ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים יישום פשוט של זיהוי פלואורסצנטי של מיקרופלואידיקה טיפתית באמצעות סיבים אופטיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בבדיקות ביולוגיות בתפוקה גבוהה, כגון זיהוי פנוטיפים נדירים והתפתחות מכוונת של אנזימים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת יישום פשוט וזול של זיהוי פלואורסצנטי במיקרופלואידיקה טיפתית.

כדי להתחיל, הנח פרוסת סיליקון בקוטר שלושה אינץ' נקייה מראש על צ'אק הוואקום של ציפוי מסתובב. לאחר מכן, מרחו מיליליטר אחד של SU-8 3050 במרכז הוופל, וסובבו את הוופל כדי לספק שכבת פוטו-רזיסט בעובי 80 מיקרומטר. הסר את הוופל המצופה מציפוי הסיבוב והניח אותו על פלטה שחוממת מראש ל -135 מעלות צלזיוס.

לאחר 30 דקות מסירים את הוופל ומניחים לו להתקרר בחזרה לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו את הוופל על משטח ישר ויישרו את מסיכת השכבה הראשונה על הוופל. חשוף את הוופל מתחת ל-LED קולימציה של 190 מיליוואט, 365 ננומטר למשך שלוש דקות.

לאחר החשיפה, הניחו את הוופל על פלטה של 135 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ולאחר מכן הניחו לו להתקרר בחזרה לטמפרטורת החדר. לאחר שהתקרר, הנח את הוופל בחזרה על ציפוי הסיבוב והצמד אותו לצ'אק. מרחו מיליליטר נוסף של SU-8 3050 במרכז הפרוסה וסובבו במשך 20 שניות ב-500 סל"ד.

ואחריו 30 שניות ב-5,000 סל"ד. לאחר מכן, אופים את הוופל על פלטה חמה. הניחו לו להתקרר בחזרה לטמפרטורת החדר ולאחר מכן הניחו אותו בחזרה על משטח יישור המסכה.

השתמשו בטווח החיתוך כדי ליישר ידנית את מסיכת השכבה השנייה עם סימני היישור עם דוגמת המילוי שעל הפרוסת. לאחר יישור נכון, חשוף את הוופל המצופה למשך 4-1/2 דקות באותם תנאים כמו קודם. לאחר החשיפה, הניחו את הוופל על פלטה חמה בטמפרטורה של 135 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואז קררו את הוופל והדביקו אותו בחזרה על ציפוי הסיבוב.

מרחו מיליליטר אחד של SU-8 3050 על הפרוסה בפעם השלישית וסובבו כדי להוסיף 100 מיקרומטר נוספים של התנגדות לאור. מוציאים את הוופל ואופים על פלטה של 135 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, מצננים אותו לטמפרטורת החדר ומניחים אותו על משטח היישור.

יישר את מסיכת השכבה השלישית עם הגיאומטריה הקודמת וחשוף את הוופל המצופה בתנאים הקודמים למשך תשע דקות. לאחר החשיפה, הניחו את הוופל על פלטה של 135 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ולאחר מכן קררו אותו לטמפרטורת החדר. לאחר שהתקרר, פתחו את המסכות על ידי טבילת הוופל באמבט מעורבב של מפתח למשך 30 דקות.

לבסוף, שטפו את הוופל באיזופרופנול ולאחר מכן אופים אותו בפעם האחרונה במשך דקה אחת על פלטה חמה בחום של 135 מעלות צלזיוס. אחסן את המאסטר המפותח בצלחת פטרי 100 מילימטר עד ליציקה. הכינו תערובת של 10:1 של PDMS על ידי שילוב של 50 גרם בסיס סיליקון עם חמישה גרם חומר ריפוי בכוס פלסטיק.

מערבבים את התכולה עם כלי סיבובי, ולאחר מכן מסירים את התערובת בתוך חומר ייבוש למשך 30 דקות, או עד שכל בועות האוויר מוסרות. שופכים את ה- PDMS הנטול גז על המאסטר המוכן כדי לתת עובי של שלושה מילימטרים. לאחר מכן, הנח את צלחת הפטרי בחזרה לתוך המייבש להמשך הסרת הגז.

לאחר הסרת כל הבועות, אופים את המכשיר בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 80 דקות. לאחר הקירור, חתוך את המכשיר מהתבנית באמצעות אזמל כך שגם הטלגיאומטריות של 120 מיקרומטר וגם 220 מיקרומטר יהיו נגישות מצד המכשיר. לאחר מכן נקב את הכניסות והיציאות הנוזליות עם אגרוף ביופסיה של 0.75 מ"מ.

פלזמה מטפלת במכשיר עם צד תכונה כלפי מעלה יחד עם מגלשת זכוכית נקייה מראש ופלזמת חמצן של 1 מיליבר למשך 20 שניות במנקה פלזמה של 300 וואט. חבר את המכשיר על ידי הנחת הצד המעוצב של מכשיר ה-PDMS על הצד המטופל בפלזמה של שקופית הזכוכית. לאחר מכן, הכניסו את המכשיר לתנור מכשיר של 80 מעלות צלזיוס והחזירו את המכשיר המורכב למשך 40 דקות.

לאחר האפייה, השתמש במזרק כדי לשטוף את המכשיר בנוזל טיפול פני שטח מופלר כדי להפוך את התעלות להידרופוביות. לאחר מכן, אופים מיד את המכשיר בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאדות את הממס. הכן שני סיבי עירור לייזר על ידי הסרת הבידוד מחמשת המילימטרים האחרונים של הסיבים האופטיים.

כמו כן, הכינו את הסיב לאיסוף האות הפלואורסצנטי על ידי הסרת הבידוד מחמשת המילימטרים האחרונים של סיב אופטי גדול יותר. בדוק את קצות כל הסיבים במיקרוסקופ. אם הטיפים אינם מסתיימים במשטח ישר, יש לסגור את הקצוות בעזרת סופר סיבים.

לאחר מכן, חבר מצמד סיבי לייזר ללייזר של 50 מיליוואט, 405 ננומטר והצמד ללייזר אחד מסיבי הליבה של 105 מיקרומטר. כוון את הקצה המופשט של החיישן של מד כוח לייזר והשתמש בהתאמות העדינות של מצמד הלייזר כדי למקסם את עוצמת הלייזר. בצע את אותו תהליך כדי לכוונן את הסיב השני באמצעות לייזר 50 מיליוואט ו-473 ננומטר.

לאחר מכן, התקן מסנן פס מרובע על צינור מכפיל הצילום באמצעות צינורות עדשה כדי לחסום את אור הלייזר ולהעביר פלואורסצנטיות הנפלטת. חבר מצמד סיבים כך שהאור יעבור דרך המסננים לפני הפגיעה בצינור מכפיל הצילום. לאחר מכן, חבר את סיב האיסוף למצמד הסיבים.

הנח את השבב המיקרופלואידי המיוצר על הבמה של מיקרוסקופ הפוך יחד עם מצלמה דיגיטלית המסוגלת למהירויות תריס של 100 מיקרו-שנייה לפחות. עבדו בזהירות מהצדדים, הכניסו את הסיב המחובר ללייזר 473 ננומטר לתעלה הרחוקה ביותר במעלה הזרם של 120 מיקרומטר. הקפד לא לנקב את תעלת הזרימה הראשית.

לאחר מכן, הכנס את הסיב המחובר ללייזר 405 ננומטר לתעלה הצדדית הרחוקה ביותר במורד הזרם בגובה 120 מיקרומטר, ומספק מרווח סיבים של 300 מיקרומטר. לבסוף, הכנס את הסיב המחובר לצינור מכפיל הצילום הגדול יותר לתעלה בגובה 220 מיקרומטר הרגילה לשני סיבי עירור הלייזר. מלאו מזרק של חמישה מיליליטר מלא ב-HFE 7500 המכיל 2% פלואורו-פעילי שטח יוניים והרכיבו אותו לכניסת שמן המרווח של מכשיר הזיהוי באמצעות צינורות PE2.

לאחר מכן, מלאו מזרק בתחליב FITC מעורב וצבע כחול והרכיבו אותו על משאבת מזרק בכיוון אנכי המחוברת למכשיר ככניסת הזרקה חוזרת של טיפות באמצעות צינורות PE2. חבר אורך של צינורות PE מיציאת המכשיר למיכל פסולת. לאחר מכן, הפעל את המכשיר על ידי הפעלת כל אחת מהמשאבות במהירות של 1,000 מיקרוליטר לשעה עד שנראה שגם שמן וגם טיפות משתלבים באופן קבוע במכשיר וזורמים במורד הזרם.

התאם את קצבי הזרימה כך ששמן המרווח יפעל ב-6,000 מיקרוליטר לשעה, והטיפות ב-100 מיקרוליטר לשעה, מה שמספק מרווח משמעותי בין טיפות העוברות באזור הזיהוי. לאחר מכן, הפעל את הלייזרים והתחל את תוכנית רכישת הנתונים. לאחר מכן, כוונן את רווח צינור מכפיל הצילום כדי לספק אותות שהם יותר מפי 100 מרצפת הרעש הבסיסית.

לבסוף, כוונן את עוצמת הלייזר כך שכל הפסגות הכפולות ייראו בבירור על עקבות זמן יחידים בקנה מידה ליניארי. טיפה הזורמת דרך תעלת הזיהוי נתקלת באזורי עירור נפרדים מול כל אחד מהסיבים האופטיים המחוברים ללייזר. סיבי הזיהוי מתעדים פלואורסצנטיות פולטות עם שינוי זמני עם הפרדת שיא המתואמת עם הזמן שלוקח לטיפה לעבור מאזור עירור אחד למשנהו.

זה מבטל את הצורך בסינון אור נוסף ובצינורות מכפיל צילום נפרדים. יעילות תוכנית הזיהוי נבדקה על ידי זיהוי תחליב מעורב של טיפות המכילות צבעים המעוררים ב-405 ננומטר וב-473 ננומטר. גרף זה מראה הפרדה ברורה בין ארבעת סוגי הטיפות המוזרקות מחדש כאשר הן זורמות בערך ב-50 הרץ.

הטווח הדינמי והרגישות המוחלטת של הגלאי נחקרו על ידי מדידת טיפות הפלואורסצאין בלבד. הנתונים מראים את יכולתה של המערכת לזהות ריכוזי צבע הנעים בין 0.1 ל-100 ננו-מולר. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם מערכת זיהוי פלואורסצנטי פשוטה וקומפקטית על ידי שימוש במערך של סיבים אופטיים מוכנסים וגלאי צילום יחיד.