Name: ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: למדו שיטה לטיהור חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) המיוצרים במערכות תאי יונקים או חרקים. הפרוטוקול מפשט את תהליך הטיהור באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה ותומך בזיהוי אנטיגנים ויראליים לחיסונים בצורה בטוחה וגמישה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מבקשים להודות לחברים מראש של מעבדת רוס שעזרו לייעל את הפרוטוקול ליעילות ותשואות מקסימליים.

1. מערכת ביטוי יונקת עבור דור של שפעת H3N2 VLP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone hemagglutinin גליקופרוטאינים מבניים ויראלי (HA), נורמינידאז (NA), וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) P55 Gag לתוך וקטורים ביטוי איקריוטיים, כגון pTR600 שתואר לעיל. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר דנ&quot;א coli Escherichia המוסמכות כימית (למשל, DH5α) ולבודד פלסמיד transfection כיתה באמצעות ערכת טיהור פלסמיד לפי הוראות היצרן. כמות ה- DNA תלויה תשואה והצרכים של המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על שורת תאים יונקים, 293T, בתקשורת צמיחה המכיל 10% נסיוב עוברי-שור (FBS) על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 באינקובטור humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים כאלה בבקבוק בתרבית רקמה T-150 מכיל 45-75 x 10 6 תאים לכל בקבוק כזה כי הבקבוק משיג דבקות תא שלם confluency התא 85-95% על ידי למחרת. בדוק התאים תחת מיקרוסקופ עבור conflu הרצויency. הערה: צפיפות התאים גבוהה מומלץ בדרך כלל להניב ביטוי חלבון אופטימלי עם רעילות מינימלית כאשר באמצעות ריאגנטים transfection המסחריים אולם יתר confluency עלול לגרום הצטברות של פסולת הסלולר תוצרי לוואי ולהפחית כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום transfection, להכין ליפוזום תערובת DNA על פי המלצות היצרן ו transfect תאי DNA עם רכב ה- DNA של 1: 1: 2 של HA: NA: Gag עם כמות ה- DNA כוללת של 40 מיקרוגרם לכל בקבוק T-150. לדלל פתרונות דנ&quot;א ליפוזום במדיה transfection סרום ללא ללא אנטיביוטיקה כך שכל בקבוק מכיל בהיקף כולל של 20-30 מ&quot;ל. הערה: יחס של מבני גן עשוי לדרוש אופטימיזציה למשתמש. אמנם לא הפגין כאן, הליך transfection דומה שבוצע עם וירוס סינסיציאלי נשימה (RSV) F ו- HIV Gag ביחס של 1: 1. עבור פלסמידים ביטוי יחיד DENV ו CHIKV, סך של 20 מיקרוגרם של ה- DNA לכל בקבוק T-150 משמשים דואר אופטימליxpression. דנ&quot;א: יחסי מגיב transfection מותאמים למשתמש. שימוש מומלץ בינוני transfection ויסות בשיטות transfection, כלומר, transfections שומני polycationic ממליץ הפחתה או העדר בסרום שור עובר ובכך תקשורת ניתן להשלים עם הורמוני גדילה ויסודות קורט כדי לתמוך בצמיחה בהעדר בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס עם חממת 5% CO 2. עבור נפח של 200 מ&quot;ל, השתמש 9 T-150 צלוחיות. התאים נשמרים בינוני תרבות transfection עד יום קציר VLP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant תרבות קציר מתאי לאחר 72-96 שעות-transfection פוסט תלוי אנטיגן, או כאשר כדאיות התא ירדה ל 70-80%, כפי שהוערך על ידי בדיקה מיקרוסקופית. העברת supernatant לתוך 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי ספין התאים למטה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולה פסולת הסלולר. הערה: החלפת supernatant 3 ימים עם תקשורת transfection מחומם מראש, סרום ללא טריה תאים חסידים יהיה yielמנה שנייה da של VLPs עם תשואה דומה או מופחת מעט צריכה להיות מותאמת על ידי משתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant ולסנן ברכה דרך קרום 0.22 מיקרומטר נקבוביים לפני השקיעה באמצעות ultracentrifugation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את פעילות hemagglutination של VLPs HA-להביע ידי assay hemagglutination תקן 14 באמצעות טורקיה 0.8% או כדוריות דם אדומות יונקים או להמשיך עם ELISA אנטיגן ספציפי. ראה איור 2 תוצאות נציג. </li></ol> 2. ביטוי VLP לחי שימוש מערכת תא baculovirus / חרקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור baculovirus רקומביננטי להביע קפסיד Chikungunya וירוס וחלבוני מעטפה (C-E3-E2-6K-E1) מן זן S-27 באמצעות מערכת ביטוי baculovirus מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות Spodoptera frugiperda תאים Sf9 במדיום הגידול Sf9 סרום ללא עם 100 U / פניצילין מ&quot;ל ו סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ב 28 ° C. השתמש 3-5 x 10 5 ג / מ&quot;ל ליזום תרבויות בקבוק טווה עבור suspensצמיחת תאי יון. המעבר שגרתי, כאשר הם מגיעים צפיפות התא של 2-4 x 10 6 ג / מ&quot;ל (כל 3-4 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sf9 תרבות תאים בתרחיף צלוחיות טווות עם הערבוב ב 130 סל&quot;ד על מערכת צלחת בוחש מרובה. עבור אוורור נאות, לשמור כרכי תרבות ללא יותר ממחצית הנפח של הבקבוק הטווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הביטוי של הלחי VLPs, להדביק תאים Sf9 בצפיפות של 2 x 10 מ&quot;ל 6 תאים / עם baculovirus רקומביננטי על ריבוי של זיהום של 1 ולחזור 28 ° C חממה. בדרך כלל, להדביק צלוחיות טווה אחד או שניים, המכיל 250 מ&quot;ל תאים Sf9. הערה: למרות שאנו לא משתמשים בשיטה זו, תאי Sf9 עלולים להיות מתורבתים צלוחיות שייקרו ב 28 ° C באמצעות פלטפורמה שייקרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות קציר לאחר 72-96 שעות לאחר הפגיעה, או כאשר כדאיות התא ירדה ל 70-80% כפי שנקבע על ידי הכללת Trypan כחול על פי פרוטוקול של היצרן. הערה: התאים ממשיכים להתרבות בעוד נגוע וישכדאיות מצוינת ~ 80% בתרבויות Sf9 נגועים baculovirus הלחי VLP רקומביננטי ב 3 ימים לאחר פגיעה (dpi). תאים נגועים baculovirus גדולים במראה. מורפולוגיה עשויה גם לשנות מן הסיבוב כדי מלבני. In-בשלבים המאוחרים של זיהומים baculovirus, התאים החלו lyse. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תרבויות ישירות מתרבות ההשעיה לתוך 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי ספין למטה התאים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף supernatants ולסנן דרך קרום 0.22 מיקרומטר נקבוביים לפני השקיעה באמצעות ultracentrifugation. </li></ol> 3. שקיעה / טיהור VLP / SVPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר 25 מ&quot;מ x 89 מ&quot;מ צינורות ultracentrifuge גג פתוח עם אתנול 70% במנדף בטיחות ביולוגית. ודא אתנול התייבש מעל לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עד 32 מ&quot;ל של supernatant לתוך צינור נקי. בהיקף מינימלי של 25 מ&quot;ל מומלץ כדי למנוע קריסה ונזק של צינורות ultracentrifuge מולא כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות בבסיס שנינות supernatantsג 3 מ&quot;ל 20% גליצרול סטרילי ב PBS (v / v). הפוך צינורות בטוחים מאוזנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 135,000 XG במשך 4 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, הבטחת הגלולה לא לעקור מן הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend משקעים VLPs בתחתית הצינורות עם PBS סטרילי על ידי pipetting למעלה ולמטה במרץ. כמות PBS צריך resuspend VLPs תלוי תשואה חלבון VLP הכולל ויישומים במורד הזרם. בדרך כלל, resuspend כל גלולה VLP בלפחות 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות דגימות 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר -80 ° C אחסון עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol> 4. קביעת תשואות חלבון ותשואות אנטיגן ספציפיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את תכולת החלבון הכולל בשיטת כימות חלבון מסחרית, כגון assay BCA לפי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך תוכן אנטיגן ספציפי, לבצע assay immunosorbent הישיר enzyme-linked (ELISA) על ידי ציפוי דילולים סידוריים של אנטיגן סטנדרטי 2-51; גרם של מדגם חלבון הכולל על צלחת ELISA 96-גם שטוח תחתונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב עם נוגדני אנטיגן ספציפי לחקור את הנוכחות של אנטיגנים על הצלחת ולהשתמש מצעי פיתוח ELISA קונבנציונליים לייצר ספיגה לזיהוי עבור קורא microplate. ראה איור 2 תוצאות נציג assay HA ו ELISA למדגם HA-להביע VLP; שילובים רבים של HA ו NA הם אולי אבל התשואות עשויות להיות שונות על תאימות HA-NA 15. הערה: נוגדנים אנטיגן ספציפי יש זיקות משתנה ומומלץ כי טיטרציה דילול נקודת הסיום של נוגדנים להיקבע לפני ביצוע כימות VLP. נוגדנים מסחריים יצטרכו טווחי ריכוז או דילול מומלצים לשימוש ELISA, כמו גם פרוטוקולים שהציעו. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+stabilization+of+recombinant+protein+based+virus-like+particle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2014).</li>
<li>Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+pH+stability+-+how+influenza+A+virus+hemagglutinin+affects+host-specific+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engerix-B+package+insert%5BTitle%5D)+AND+%22GlaxoSmithKline%2C+Research+Triangle+Park%2C+NC%22%5BJournal%5D)">Engerix-B package insert.</a> GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).</li>
<li>Giles, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+optimized+hemagglutinin+virus-like+particle+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+that+protect+nonhuman+primates+from+H5N1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection.</a> J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).</li>
<li>Giles, B. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+optimized+broadly+reactive+antigen+%28COBRA%29+based+H5N1+VLP+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+in+mice+and+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets.</a> Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).</li>
<li>Green, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3d+enhancement+of+neutralizing+antibodies+to+measles+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin.</a> Vaccine. 20, 242-248 (2001).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Clade+Protective+Immune+Responses+to+Influenza+Viruses+with+H5N1+HA+and+NA+Elicited+by+an+Influenza+Virus-Like+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle.</a> PLoS ONE. 3, e1501(2008).</li>
<li>Yondola, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+Capability+of+the+Influenza+Virus+Neuraminidase+Can+Be+Modulated+by+Tetherin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin.</a> J Virol. 85, 2480-2491 (2011).</li>
<li>Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-like+particles+for+antigen+delivery+at+mucosal+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).</li>
<li>Murawski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus-like+particles+containing+respiratory+syncytial+virus+G+protein+induced+protection+in+BALB%2Fc+mice%2C+with+no+evidence+of+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology.</a> J Virol. 84, 1110-1123 (2010).</li>
<li>Quan, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li>
<li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COBRA-Based+Dengue+Tetravalent+Vaccine+Elicits+Neutralizing+Antibodies+Against+All+Four+Dengue+Serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vaccine+Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes.</a> J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).</li>
<li>Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).</li>
<li>Mitnaul, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Activities+Are+Critical+for+Efficient+Replication+of+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus.</a> J Virol. 74, 6015-6020 (2000).</li>
<li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+DL+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 463, Academic Press. 191-222 (2009).</li>
<li>Pijlman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enveloped+virus-like+particles+as+vaccines+against+pathogenic+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses.</a> Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).</li>
<li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li>
<li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A%2Fgoose%2FGuangdong%2F1%2F96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+%3A+Morbidity+and+mortality+weekly+report%5BTitle%5D)+AND+%22Recommendations+and+reports+%2F+Centers+for+Disease+Control%22%5BJournal%5D)">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השתמשנו הטכניקות המתוארות לעיל להביע בהצלחה ולטהר SVPs ו VLPs מורכבת של חלבונים מבניים מרובים עבור פתוגנים שונים. באופן כללי, אנו משתמשים במערכות ביטוי יונקים ליצור VLPs שלנו. עם זאת, בידינו, תאים יונקים נגזרים תשואות VLP לחי היו נמוכות. תשואת VLP לחי הייתה חזקה יותר בעת השימוש במערכת תא רקומביננטי baculovirus-חרקים. באופן כללי, baculovirus חרקים מערכות תא להניב כמויות גדולות יותר של חלבונים רקומביננטיים, אשר עשוי לנבוע צפיפות התא גבוה שיכול להיות מתורבת צלוחיות טווה מול צלוחיות ב...

חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) מהווים טכנולוגיה אושרה לחיסון אדם. למעשה, חלק מן החיסונים מורשים יותר contemporarily, כולל וירוס הפפילומה האנושי (HPV) Β הפטיטיס (HepΒ) חיסונים להעסיק את הגישה הזו. VLPs נוצר חלבונים מבניים מסוגלים הרכבה עצמית. החלקיקים התאספו לחקות מורפולוגיות ויראלי, אבל לא יכולים להדביק או לשכפל משום שהם חסרי הגנום נגיפי. VLPs יכול לבוא לידי ביטוי מטוהרים מן מספר מערכות פרוקריוטים ו האיקריוטים. סקירה של הספרות עולה כי מערכות ביטוי שונות מועסקות בשיעורים הבאים: החיידקים - 28%, שמרים - 20%, צמח - 9%, חרק - 28%, ו יונקים - 15% 1. ראוי לציין, חיסוני HPV מבוססים על חלבון קפסיד L1 מיוצרים שמרים (Gardasil) או מערכת תא חרק (Cervarix) 2. חיסוני HepΒ, Recombivax ו Engerix-Β, מיוצרים גם בשמרים, והם מורכבים אנטיגן שטח HepΒ 3, 4. אנו משתמשים במערכות ביטוי תאי יונקים וחרקים לייצר VLPs המחייב שיתוף ביטוי של חלבונים מבניים מרובים להרכבה. העבודה שלנו מתמקדת בעיצוב, ייצור, וחיסונים VLP מבוססי טיהור נגד פתוגנים אנושיים: נגיף שפעת, וירוס סינסיציאלי הנשימה (RSV), וירוס דנגה (DENV), ו Chikungunya וירוס (CHIKV). השיטות שלנו גמישות מספיק כדי לאפשר שיתוף ביטוי של החלבונים המבניים המרובים פלסמידים ביטוי מרובים, או פלסמיד ביטוי יחיד (איור 1). בעבר, שהפקנו מטוהרים H5N1 VLPs התאספו מן שיתוף ביטוי של פלסמידים קידוד hemagglutinin שפעת (HA), נורמינידאז (NA), מטריצה ​​(M1) בתאים עובריים אנושיים כליות 293T 5,6. הגנים היו קודון אופטימיזציה עבור ביטוי בתאי יונקים ו משובטים לתוך pTR600, וקטור ביטוי איקריוטיים המכיל את ציטומגלווירוס מיידית-מוקדם אמרגן אחד פלוס אינטרון לייזום transcription מוסיף איקריוטיים ואת האות polyadenylation הורמון גדילה שור להפסקת שעתוק 7. גישה דומה באמצעות שלושת פלסמיד שיתוף הביטוי של HA, NA (איור 1 א) ו חלבון מטריקס ויראלי חלופי, HIV Gag P55, שמשה דור VLPs H3N2 תת סוג שפעת עונתית אדם במחקר זה הוכח ליצור VLPs בגודל דומה כחלקיקים שפעת 8. למרות החיסונים לשפעת בעיקר לעורר נוגדנים אנטי-HA, תוספת של נורמינידאז שפעת מתווכת פעילות sialidase לאפשר VLP ניצני מתאי transfected 9 וגם בהווה מטרות immunogenic נוספים. כדי לייצר RSV VLPs, אנחנו גם נבחרנו הליבה הקשורה של HIV Gag לעצב חיסונים אבטיפוס שמציגים גליקופרוטאינים משטח RSV בלעדי להפגין עוד יותר גמישות של היווצרות VLP באמצעות HIV Gag, כפי שתואר לעיל ואופיין על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני 6,10. אחריםבעבר הראו כי VLPs הצגת ניתן להרכיב גליקופרוטאינים RSV באמצעות מרכיבים נגיפיים שונים וירוס מחלת ניוקאסל (NDV) 11, ושפעת מטריקס 12. רצפים גליקופרוטאין משטח באורך מלא נוצלו במחקר זה כדי לשמור על תצורות הילידים כי ייתכן שיהיה צורך עבור קולטן פונקציונלי assay הכרה נוגדן איגוד באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA). דוגמאות שלנו עבור שימוש במערכות ביטוי פלסמיד בודד כדי ליצור חלקיקים הם DENV ו CHIKV. במקרה של DENV, נוכל לייצר חלקיקים subviral (SVPs) ללא קפסיד בתאים 293T מתוך פלסמיד יחיד המכיל קלטת ביטוי גנים מבניים PRM / E 13. סגן נשיא בכיר המונח משמש כדי לציין את חוסר חלבון הליבה או קפסיד באסיפה של חלבונים מבניים ויראלי. לחי VLPs ניתן לייצר גם באמצעות פלסמיד יחיד המכיל קלטת גנים מבניים CHIKV, קפסיד קידוד חלבוני מעטפה, או אניתאי nsect על ידי הדבקה עם baculovirus רקומביננטי קידוד קלטת הגנים מבני באותו אופטימיזציה עבור ביטוי תא חרקים (1B איור - C). התוצאה הסופית של ביטוי גישות שנדון לעיל היא השחרור VLPs לתוך מדיום תרבית תאים כי אז יכול להיות מטוהר באמצעות ultracentrifugation באמצעות כרית גליצרול 20%. בדו&quot;ח זה, אנו מציגים שיטות להביע ולטהר VLPs אלה ממערכות תאי יונקים וחרקים.

<table><tbody><tr><td>פלסמיד מקסי קיט</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Life Technologies</td><td>L3000075</td><td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Cimarec I 6 צלחת בוחש רב-נקודתית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה פוליקליר</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>אשר צינורות מתאימים לאולטרה-צנטריפוגה וגודל דלי</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון מיקרו BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט ציטראט</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-phenylenediamine דיהידרוכלוריד&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m מסנן ואקום עליון (500 מ"ל)</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma</td><td>339741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) וחלקיקי subviral (SVPs) הם גישה חלופית עיצוב חיסון ויראלי מציע את היתרונות של בטיחות ביולוגית מוגברת יציבות לאורך שימוש פתוגנים חיים. ללא זיהומיות עצמית הרכבה, VLPs משמש להציג חלבונים מבניים כמו immunogens, תוך עקיפת צורך פתוגנים חיים או וקטורים ויראליים רקומביננטי למסירת אנטיגן. במאמר זה, אנחנו מדגימים את השלבים השונים של עיצוב VLP ופיתוח עבור יישומים עתידיים ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. ההליך כולל את השלבים הבאים: בחירה של אנטיגן, ביטוי של אנטיגן בתור תא של בחירה, טיהור VLPs / SVPs, וכימות עבור מינון האנטיגן. אנו מדגימים שימוש בשני שורות תאי יונקי חרקים לביטוי של אנטיגנים שלנו להדגים כיצד מתודולוגיות שונות בתשואה. המתודולוגיה הציג עשויה לחול על מגוון רחב של פתוגנים יכול להיות מושגת על ידי החלפת אנטיגנים עם str immunogenicחלבוני uctural של מיקרואורגניזם המשתמש של עניין. VLPs ו SVPs לסייע באפיון אנטיגן ובחירת המועמדים החיסון הטוב ביותר.

תשואות VLP היו משתנות על ידי עיצוב מבנה אנטיגן ויראלי. בפרוטוקול זה, אנו הוכחנו שימוש בתאי חרקים יונקים לייצור SVP או VLPs ב supernatant וטיהור על ידי ultracentrifugation. ארבעה תת-סוגים של DENV PRM / E קלטות ביטוי מבני גן ששמשו לבניית הגירסות של SVPs DENV (המסומן כמו 1-4) בלוח 1 ולהפגין בטווח שבין 1.1-2.6 מ&quot;ג של חלבון מסך 0.6 מיליליטר כרכים. לקבלת VLPs הדורשים בונה גן השלושה, מצאנו את יחס transfection DNA אופטימיזציה של 1: 1:...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לטהר חלקיקים דמויי נגיף, או VLPs, המובעים ומופרשים על ידי מערכות ביטוי של תאי יונקים או תאי חרקים. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום של פיתוח חיסונים, כגון כיצד להביע ולטהר אנטיגנים ויראליים בעלי מבנה תרחיף רלוונטי בצורה בטוחה וגמישה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאינה דורשת שקיעה של חלבונים באמצעות polyethylene glycol או הכנה של שכבות דחיסות מרובות לצורך ריכוז של VLPs.אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי זיהוי אנטיגנים ויראליים כמטרות לחיסון, ניתן להשתמש ב-VLPs גם ככלים לאבחון מחלות ולסרולוגיה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי השעייה של VLPs עם תשתית גליצרין הם קשים ללמידה, כיוון שמתחילים עלולים שלא להפעיל את הטכניקה הנכונה. ביום התרנסווקציה (transvection), הכינו תמיסות ליפוזומים ו-DNA לפי המלצות היצרן.בצע טרנספקציה לתאי ה-DNA עם תערובת DNA ביחס של 1:1:2 של HA ל-NA ל-Gag, בכמות DNA כוללת של 40 micrograms לכל בקבוק T150. חזור על שלב זה כדי להכין תשעה בקבוקי T150, לנפח כולל של 200 milliliters. לאחר מכן, דלל את תמיסות ה-DNA והליפוזומים במצע טרנספקציה נטול סרום וללא אנטיביוטיקה, כך שכל בקבוק יכיל נפח כולל של 24 milliliters.החזירו את הבקרוקים לאינקובטור ושמרו את התאים ואת מצע תרבית הטרנסווקציה עד ליום איסוף החלקיקים דמויי-הנגיף, או VLP. העבירו את הסופרנאטט למבחנות קוניות של 50 מיליליטר כדי לאסוף את התרבית מהתאים לאחר 72 עד 96 שעות מהטרנסווקציה. סובבו את התאים במערכת צנטריפוגה כדי לשקיע את השאריות התאיות.אספו את העל-נתיכים (supernatants) וסננו אותם דרך ממברנת סינון של 0.22 מיקרון. תרבתו תאי spodoptera frugiperda, או תאי Sf9, שהוכנו מראש, בסuspended בתוך בקבוקי spinner, תוך써 ערבוב רציף במהירות של 130 rpm על גבי מערכת פלטות ערבוב רב-נקודתית. שמרו על נפחי תרבית שאינם עולים על מחצית מנפח בקבוק ה-spinner כדי להבטיח אוורור תקין.בשלב הבא, בצעו ביטוי של CHIK VLPs על ידי הדבקת 250 milliliters של תאי Sf9 בבקבוק ספינר (spinner flask) בצפיפות של 2×10⁶ תאים למילליליטר באמצעות baculovirus רקומביננטי שהוכן מראש, והחזירו את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 28 °C. השתמשו במבחן הדרה של trypan blue כדי לקבוע אם חיוניות התאים ירדה ל-70% עד 80%. עם אישור הדבר, העבירו את התרביות ישירות מהסספנסיה למבחנות קוניות של 50 milliliter וסבבו את התאים למטה (spin down). אספו את העל-נוזל (supernatants) וסננו אותם דרך ממבנה סינון של 0.22 micron לפני השקיעה.עקרו שש מבחנות אולטרסנטריפוגה פתוחות בגודל 25 מילימטר על 89 מילימטר באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, ודאו שה-ethanol התייבש לחלוטין. העבירו 32 milliliters של תעלילים נקיים אל המבחנות הנקיות.בשלב הבא, יש להוסיף בזהירות מתחת לתעליליו של הסופרנאטנט שלושה מיליליטרים של 20% glycerol ו-PBS סטריליים. יש להוסיף את ה-glycerol באיטיות כדי למנוע הפרעה לשכבת הצפיפות הדקה שבין ה-glycerol לבין תמיסת ה-VLP. הוספה מהירה מדי של ה-glycerol תגרום לערבוב של ה-glycerol ותמיסות ה-VLP, דבר שיפחית את שקיעת ה-VLP.וודאו שהמבחנות מאוזנות, ולאחר מכן התחילו את הצנטריפוגה. לאחר ארבע שעות, הוציאו את המבחנות מהצנטריפוגה. שאבו את הנוזל העליון (supernatant), תוך הקפדה לא להזיז את המשקע (pellet) מהמבחנה.שחזר את ה-VLPs השקועים בלפחות 100 µL של PBS סטרילי בתחתית המבחנות, על ידי פיפטור עדין ואיטי מעלה ומטה. יש לבצע את שחזור משקע ה-VLP באמצעות שאיבה והזרקה חוזרת, עדינה ואיטית של PBS בעזרת פיפטה. הימנע מיצירת בועות כדי להגביל את אובדן ה-VLP.לבסוף, יש לאחסן את ה-VLPs לאחר התו HttpSession. נפחי ה-VLP ותוצר החלבון הכולל, כפי שנמדדו בבדיקת BCA קונבנציונלית, התקבלו ממגוון מבני SVP ו-VLP. תוצרי CHIK SVP מתאי Sf9 נעים בין 0.008 ל-0.016 מיליגרם של חלבון כולל למיליליטר של נפח העל, תלוי במבנה.בעוד שהפקה באמצעות תאי 293 T של יונקים גורמת להפחתה של פי עשרה בכמות החלבון, תמונת מיקרוסקופ האלקטרונים זו מראה כי VLPs של ליבת HA Gag של שפעת מובעים, מורכבים ומושרים בהצלחה כ-VLPs. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע טרנספקציה והדבקה רק לתרביתי תאים בריאים וחיים, שכן הדבר ישפיע על רמות ביטוי החלבון הכלליות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקות BCA, ELIZA ו-HA כדי למדוד את תכולת החלבון הכוללת, תכולת אנטיגן ספציפית וביטוי של HA פונקציונלי. יש לזכור כי עבודה עם אולטרה-צנטריפוגה עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון איזון המבחנות, שימוש ברוטורים ובמהירויות מומלצות בלבד, והשגחה נאותה על אנשי מעבדה חדשים.

expression-and-purification-of-virus-like-particles-for-vaccination

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

סרטון זה מדגים את היווצרותם של חלקיקים דמויי נגיף שפעת (VLPs) במערכת יונקים. לאחר שהם מבטאים שלושה וקטורי ביטוי אאוקריוטים – המקודדים חלבונים מבניים נגיפיים שונים – בתאים מארחים מתאימים של יונקים, החלבונים הנגיפיים המבוטאים מתאספים בעצמם ל-VLPs על קרום הפלזמה המארח ומשחררים באמצעות ניצנים מפני השטח של התא.

טכניקה ליצירת חלקיקים דמויי נגיף שפעת באמצעות מערכת יונקים

סרטון זה מראה כיצד חלקיקים דמויי וירוס, VLPs נוצרים על ידי הדבקת תאי חרקים בבקולווירוס רקומביננטי הנושא את קלטת הגן של נגיף הצ'יקונגוניה. הנגיף הרקומביננטי מדביק תאים, מה שמוביל להיווצרות, הרכבה ושחרור של VLP למדיום התרבית לשימוש פוטנציאלי בייצור חיסונים.

יצירת חלקיקים דמויי וירוס Chikungunya באמצעות מערכת ביטוי Baculovirus בתאי חרקים

פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור וקטור הוכחה של עיקרון סוג אדנווירוס דו הערכי 5 (Ad5) Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי ניצול אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות. וקטור זה הודגם להפגין כושר איכותי, היכולת להימלט סרה Ad5 חיובית במבחנה, וantigenicity כמו גם חיסונית לאנטיגנים המשולבים.

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

וירוס Vaccinia (VV) כבר בשימוש נרחב במחקר ביו ושיפור בריאות האדם. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה, מאוד לערוך את הגנום VV באמצעות מערכת CRISPR-Cas9.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

שיטה מפורטת מסופקת כאן ומתארת את הטיהור, הקיפול והאפיון של חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית (סאפאנס) לשימוש בפיתוח החיסונים.

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

כאן, פרוטוקול פשוט מוצג לייצור חלקיקי mRNA המבוססים על פולי (בטא אמינואסטר) פולימרים, קל להתאמה על ידי שינוי mRNA אנקפסולציה. זרימת העבודה לסינתזה של הפולימרים, הננו-חלקיקים והאפיון החיוני שלהם מתוארים גם הם. כמו כן מתווספת הוכחת תפיסה בנוגע לחיסון.

סינתזה ואפיון של חלקיקי פולי (בטא אמינואסטרים) טעונים mRNA למטרות חיסון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אפיטופים נטרול על חלקיקים דמויי וירוס אנטיגן מציגים (VLPs). אימונופרציפיטציה של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגזר VLPs מתבצע באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים glycoproteins מעטפה בשילוב חלבון חרוזים מגנטיים מצומדים G. VLPs שנתפסו כפופים לאחר מכן SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי באמצעות חלבון הליבה הנגיפי נוגדנים ספציפיים ל-Gag.

זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הביו-הנדסה של שלפוחיות הממברנה החיצונית כפלטפורמת חיסון "Plug-and-Display", כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2

למדו שיטה לטיהור חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) המיוצרים במערכות תאי יונקים או חרקים. הפרוטוקול מפשט את תהליך הטיהור באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה ותומך בזיהוי אנטיגנים ויראליים לחיסונים בצורה בטוחה וגמישה.

ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

גלה סרטונים נוספים