ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לטהר חלקיקים דמויי נגיף, או VLPs, המתבטאים ומופרשים על ידי מערכות ביטוי של יונקים או תאי חרקים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום החיסונים, כגון כיצד לבטא ולטהר אנטיגנים נגיפיים רלוונטיים באופן בטוח וגמיש. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת משקעי חלבון באמצעות פוליאתילן גליקול או הכנת שכבות צפיפות מרובות לריכוז VLPs.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי זיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון, VLPs יכולים לשמש גם ככלים לאבחון מחלות וסרולוגיה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שכבת גליצרול בשלבי השעיה מחדש של VLP מכיוון שמתחילים עלולים להיכשל בהפעלת טכניקה נכונה. ביום הטרנסבקציה הכינו תמיסות ליפוזום ו-DNA לפי המלצות היצרן.

העבר את תאי ה-DNA עם הרכב DNA של אחד עד אחד עד שניים של HA ל-NA ל-Gag וכמות DNA כוללת של 40 מיקרוגרם לכל בקבוק T150. חזור על שלב זה כדי ליצור תשע צלוחיות T150, לנפח כולל של 200 מיליליטר. לאחר מכן, יש לדלל את תמיסות ה-DNA והליפוזום באמצעי טרנסבקציה נטולי סרום ללא אנטיביוטיקה, כך שכל בקבוק יכיל נפח כולל של 24 מיליליטר.

החזירו את הצלוחיות לאינקובטור ושמרו על התאים ועל מדיום תרבית הטרנסבקציה עד ליום שבו חלקיק דמוי וירוס, או VLP, נקצר. העבירו את הסופרנטנט לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר כדי לקצור את התרבית מהתאים לאחר 72 עד 96 שעות לאחר הטרנסבקציה. סובב את התאים כלפי מטה כדי לגלול את הפסולת התאית.

אוספים את חומרי העל ומסננים אותם דרך קרום מזיגה של 0.22 מיקרון. תרבית שהוכנה בעבר spodoptera frugiperda, או תאי Sf9, בתרחיף בצלוחיות ספינרים, על ידי ערבוב מתמיד ב-130 סל"ד על מערכת צלחות בוחש רב-נקודתיות. שמור על נפחי תרבות בלא יותר ממחצית נפח בקבוק הספינר לאוורור תקין.

לאחר מכן, בטא CHIK VLPs על ידי הדבקת 250 מיליליטר של תאי Sf9 בבקבוק ספינר בצפיפות של שניים כפול עשרה עד ששת התאים למיליליטר עם נגיף בקולו-וירוס רקומביננטי שהוכן בעבר, והחזיר את התאים לאינקובטור של 28 מעלות צלזיוס. השתמש בהדרה כחולה של טריפן כדי לקבוע אם כדאיות התא ירדה ל-70 עד 80%עם האישור, העבירו את התרביות ישירות מהתרחיף לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וסובבו את התאים כלפי מטה. אוספים את הסופרנטנטים ומסננים אותם דרך קרום יציקה של 0.22 מיקרון לפני המשקעים.

עקר שישה צינורות אולטרה-צנטריפוגה פתוחים בגודל 25 מילימטר על 89 מילימטר עם 70% אתנול. לאחר מכן, ודא שהאתנול התייבש לחלוטין. טען 32 מיליליטר של סופרנטנטים לתוך הצינורות הנקיים.

לאחר מכן, הניחו בזהירות את הסופרנטנטים עם שלושה מיליליטר של 20% גליצרול סטרילי ו-PBS. הנח את הגליצרול לאט כדי למנוע הפרעה של שכבת הצפיפות הדקה בין הגליצרול לתמיסת ה-VLP. הוצאת הגליצרול מהר מדי תגרום לערבוב הגליצרול ותמיסות ה-VLP, ותפחית את שקיעת ה-VLP.

ודא שהצינורות מאוזנים ואז התחל את הסיבוב. לאחר ארבע שעות, הסר את הצינורות מהצנטריפוגה. שאפו את הסופרנטנט, היזהרו לא לעקור את הכדור מהצינור.

השעו מחדש את ה-VLPs המשקעים ב-100 מיקרוליטר לפחות בתחתית הצינורות עם PBS סטרילי על ידי פיפטינג עדין ואיטי למעלה ולמטה. השעיה מחדש של כדור ה-VLP צריכה להתבצע עם שאיפה חוזרת ונשנית עדינה ואיטית והוצאה של PBS באמצעות פיפטה. הימנע מיצירת בועות כדי להגביל את אובדן ה-VLP.

לבסוף, אחסן את ה-VLPs המושעים. נפחי VLP ותפוקת החלבון הכוללת מבדיקת BCA קונבנציונלית התקבלו ממגוון מבני SVP ו-VLP. תפוקות CHIK SVP מתאי Sf9 נעות בין 0.008 ל-0.016 מיליגרם של חלבון כולל למיליליטר של נפח סופרנטנט.

בעוד שייצור באמצעות 293 תאי T של יונקים מניב הפחתה של פי עשרה של חלבון. תמונת מיקרוגרף אלקטרונים זו מראה כי VLPs ליבת שפעת HA Gag באים לידי ביטוי, מורכבים ומטוהרים בהצלחה כ-VLPs. ובכן, בניסיון זה חשוב לזכור להעביר ולהדביק רק תרביות תאים בריאות וברות קיימא מכיוון שזה ישפיע על רמות ביטוי החלבון הכוללות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחני BCA, ELIZA ו-HA על מנת למדוד את תכולת החלבון הכוללת, תכולת אנטיגן ספציפית וביטוי של HA הפונקציונלי. אל תשכח שעבודה עם אולטרה-צנטריפוגה עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון איזון הצינורות, שימוש ברוטורים ובמהירויות מומלצות בלבד, ופיקוח נאות על אנשי מעבדה חדשים בעת ביצוע הליך זה.