זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את האירועים הדינמיים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות מירקרוספיה רב-פוטונית תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי המיקרו-סביבה של הגידול, כגון אילו אירועים דינמיים מעורבים בחדירות כלי הדם ובאינטראקציות רב-תאיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לצפות ולמדוד את הקינטיקה של האירועים במיקרו-סביבת הגידול.

לפני תחילת ההליך, הפעל את כל רכיבי המיקרוסקופ והלייזר, כולל שני לייזרי הפוטון והגלאים. והגדר את קופסת החימום ל -30 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הבמה. נגב את שלב המיקרוסקופ ואת תוספת השלב עם 70% אתנול.

כאשר ה-stage יבש, הנח טיפת מים גדולה על מטרת המיקרוסקופ 25 x 1.05 NA כדי לשמור על מגע אופטי עם זכוכית הכיסוי והנח זכוכית כיסוי בעובי מספר 1.5 מעל יציאת ההדמיה של ההכנסה. לאחר מכן, חותכים חתיכת צינור פוליאתילן בגודל 30 סנטימטר. הנח את רפידת הגומי על גבי זכוכית הכיסוי.

בעזרת מלקחיים, שברו מחט בגודל 31 מאביזר הפלסטיק שלה והכנסו את הקצה הקהה של רכזת המחט לתוך הצינור. הכנס וחבר מחט בגודל 31 לקצה השני של צינור ה-PE. לאחר מכן, מלאו מזרק של סמ"ק אחד ב-PBS סטרילי והצמידו את המזרק למחט בגודל 31.

השתמש ב-PBS כדי לשטוף את כל האוויר מהצינור והמחט. לאחר מכן, האחד מזרק סמ"ק עם 200 מיקרוליטר של תווית כלי הדם המתאימה והשני עם החלבון המתאים להזרקה. לפני תחילת הניתוח, יש לוודא את ההרדמה הנכונה עם חוסר תגובה לצביטה בבוהן ולמרוח משחות עיניים על העכבר המורדם

לאחר מכן, הניחו את החיה על פלטפורמה כירורגית מתחת למנורת חום כדי להגביר את זרימת הזנב. לאחר שתי דקות, יש לעקר את הזנב עם אתנול 70% ולהכניס את קצה הצנתר בגודל 31, שניים עד שלושה מילימטרים לווריד הזנב הרוחבי. לאחר מכן, הנח סרט מעבדה באורך סנטימטר אחד על הצנתר כדי להחזיק את המחט במקביל לווריד לאורך הזנב.

כאשר הצנתר מאובטח, ספוג את משטחי הגחון והגידול עם 70% אתנול. ה, הרם את העור מעל הבטן והשתמש במספריים סטריליים כדי לבצע חתך תת עורי של כסנטימטר אחד לאורך קו האמצע הגחוני של הבטן, תוך הקפדה על הימנעות מניקוב הצפק. חתוך בעדינות את רקמת החיבור המחברת את בלוטת החלב והגידול הרחק מהצפק כדי לחשוף את הגידול.

לאחר מכן, בעזרת המספריים והמלקחיים, הסר בעדינות את הפאשיה והשומן מהמשטח החשוף של הגידול. כאשר הגידול נחשף, העבירו את העכבר לשלב ההדמיה המחומם מראש. השתמש בסרטי מעבדה כדי לאבטח את זכוכית הכיסוי, ולאחר מכן הנח את הגידול בחור של כרית גומי המכסה את החלקת הכיסוי מעל אובייקט המיקרוסקופ.

כאשר החיה נמצאת במקומה, מלא את תא כרית הגומי ב-PBS כדי לשמור על לחות הרקמה ולשמור על מגע אופטי עם החלקת הכיסוי. הנח חיישן צווארון בדיקה של אוקסימטר דופק סביב הצוואר כדי לנטר את הסימנים החיוניים של החיה והנח את קופסת החימום מעל החיה. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ IP כדי להתמקד בתאי הגידול הפלואורסצנטיים על פני הגידול ובאזור הממוקם עם כלי דם זורמים.

לאחר שנבחר אזור עניין, העבר את המיקרוסקופ למצב הדמיה מרובת פוטונים והשתמש במכוון המיקוד כדי להעביר את המטרה למיקום ההתחלה הרצוי. לאחר מכן, לחץ על כפתור מיקום Z העליון כדי להגדיר את הגבול העליון של סדרת z ולדמיין את רשת סיבי הקולגן על פני הגידול בערוץ הדור ההרמוני השני. לאחר מכן העבר את המטרה לעומק ההדמיה הרצוי ולחץ על כפתור תחתון של מיקום z כדי להגדיר את הגבול התחתון של סדרת z.

לאחר מכן, הזן את הערך הרצוי בשדות גודל הצעד. לאחר מכן, עבור ללוח Time Lapse והזן את זמן ה-lapse המתאים. לאחר שנקבעו פרמטרי ההדמיה, החליפו את המזרק המחובר לצנתר במזרק של צבע סימון כלי דם והזמנו באיטיות מקסימום 200 מיקרוליטר מתמיסת הצבע, תוך הקפדה על כניסת התמיסה לווריד.

לאחר ההזרקה, החזר את מזרק ה-PBS לצנתר והתחל בהדמיית זמן ה-z step. לאחר קבלת כל התמונות, החלף את המזרק של PBS במזרק המכיל את החלבון הניתן להזרקה, הקפד לא להכניס בועות לקו. לאחר מכן הזרקו לאט את תרחיף החלבון לעכבר והחליפו את המזרק במזרק המכיל PBS.

ניתן לעקוב אחר מקרופאגים עם תווית פלואורסצנטית של 70 קילודלטון ודקסטרן אשר מצטברים במיקרופאגים הפגוציטים. תיוג כפול של תאי הגידול והמיקרופאג'ים מאפשר להמחיש את האינטראקציה הישירה עם שני סוגי התאים הללו בזמן אמת. כדי לדמיין שינויים בחדירות כלי הדם של הגידול, ניתן להשתמש בנקודות קוונטיות גם כדי לתייג את חלל כלי הדם.

מכיוון שהם גדולים מספיק כדי שלא יתפזרו בקלות דרך החללים הבין-עורקיים. הדמיה רציפה ברזולוציה גבוהה מקלה על לכידת אירועי חדירות כלי הדם וכימות הקינטיקה של אקסטרוואזציה ומרווח דקסטרן. בשדה ראייה לדוגמה זה, שיא האקסטרוואזציה הוואסקולרית נצפה בין 29 ל-34 דקות כפי שמעיד אות ה-TMR הנוסף של כלי הדם.

הזרקת צבעי כלי דם או חלבונים נוספים כדי לגרום לחדירות כלי הדם יכולה לספק תובנה לגבי אירועי האיתות המווסתים את חדירות כלי הדם. ואכן, בשניות הראשונות של ההזרקה, ניתן לראות 10 קילו-דלטון של דקסטרן FITC יוצאים מכלי הדם, בעוד ש-155 קילו-דלטון בדקסטרן TMR נשארים מוגבלים לחלל כלי הדם. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להסיר את רקמת החיבור בעדינות מבלי לפגוע במשטח הגידול ולשמור על לחות פני הגידול. בעקבות הליך זה של דינמיקה תאית, ניתן לדמיין נדידת תאי גידול כזו כדי לענות על שאלות נוספות לגבי כיווניות נדידת תאי הגידול והתוך-ווזציה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין אירועים תאיים דינמיים במיקרו-סביבה של גידול על ידי מיקרוסקופיה רב-פוטונית בין-חיונית.