זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להמחיש את האירועים הדינמיים בתוך הסביבה המיקרובית של הגידול באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית תוך-חיה (intravital) ברזולוציה גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח לגבי הסביבה המיקרובית של הגידול, כגון אילו אירועים דינמיים מעורבים בחדירות כלי דם ובאינטראקציות רב-תאיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לצפות במדדי הקינטיקה של האירועים בסביבה המיקרובית של הגידול ולמדוד אותם.

לפני תחילת הפרוצדורה, הפעילו את כל רכיבי המיקרוסקופ והלייזר, כולל לייזרים של פוטונים כפולים ואת הגלאים. הגדירו את תא החממה ל-30 °C כדי לחמם מראש את הבמה. נגבו את במת המיקרוסקופ ואת התושבת של הבמה עם 70% ethanol.

כאשר הבמה יבשה, הניחו טיפה גדולה של מים על עדשת המיקרוסקופ 25 x 1.05 NA כדי לשמור על מגע אופטי עם זכוכית הביסוס, והניחו זכוכית ביסוס בעובי מספר 1.5 מעל פתח הדימות של התושבת. לאחר מכן, גזרו חתיכה של 30 סנטימטרים של צינור פוליאתילן. הניחו את רפידת הגומי מעל זכוכית הביסוס.

באמצעות פינצטה, שבירו מחט gauge 31 מהתושבת הפלסטית שלה והכניסו את הקצה הקהה של בסיס המחט אל תוך הפיתול. הכניסו וחברו מחט gauge 31 לקצה השני של פיתול ה-PE. לאחר מכן, מלאו מזרק של 1 cc ב-PBS סטרילי וחברו את המזרק למחט ה-gauge 31.

השתמש ב-PBS כדי לשטוף את כל האוויר החוצה מהפיתול ומהמחט. לאחר מכן, מלא מזרק של 1 cc ב-200 µL של התווית הוסקולרית המתאימה ומזרק נוסף עם החלבון להזרקה המתאים. לפני תחילת הניתוח, ודא שההרדמה תקינה על ידי בדיקת חוסר תגובה לצביטה בבהו, ומריח משחות עיניים לעכבר המורדם.

בשלב הבא, הנח את בעל החיים על פלטפורמה כירורגית תחת מנורת חימום כדי להגביר את זרימת הדם בזנב. לאחר שתי דקות, סטריליז את הזנב באמצעות 70% ethanol והחדר את קצה הקטטר בכיול 31, לשני עד שלושה מילימטרים לתוך הווריד הצדי של הזנב. לאחר מכן, הצמד פיסת סרט דביק למעבדה באורך של סנטימטר אחד לקטטר, כדי להחזיק את המחט במקביל לווריד לאורך הזנב.

לאחר קיבוע הקטטר, נגב את פני השטח של אזור הבטן והגידול ב-70% ethanol. לאחר מכן, הרם את העור מעל הבטן והשתמש במספריים סטריליים כדי לבצע חתך תת-עורי של כסנטימטר אחד לאורך קו האמצע הגחוני של הבטן, תוך הקפדה לא לנקב את הפריטונאום. חתוך בעדינות את רקמת החיבור המחברת את בלוטת החלב והגידול לפריטונאום כדי לחשוף את הגידול.

לאחר מכן, באמצעות המספריים והפינצטה, הסירו בעדינות את הפסציה (fascia) ואת השומן מהמשטח החשוף של הגידול. לאחר חשיפת הגידול, העבירו את העכבר לבמה של מערכת הדימוג שחוממה מראש. השתמשו בסרטי דבק למעבדה כדי לקבע את זכוכית הכיסוי, ולאחר מכן הניחו את הגידול בתוך החור של רפידת גומי המכסה את זכוכית הכיסוי מעל עדשת המיקרוסקופ.

כאשר בעל החיים נמצא במיקום הנכון, מלאו את תא רדית הגומי ב-PBS כדי לשמור על לחות הרקמה ולהבטיח מגע אופטי עם לוחית הכיסוי. הניחו סביב הצוואר חיישן של צווריט למדידת סטורציה של חמצן (pulse oximeter) כדי לנטר את מדדי החיים של בעל החיים, והניחו את קופסת החימום מעל בעל החיים. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ כדי להתמקד בתאי הגידול הפלואורסצנטיים על פני השטח של הגידול ולאתר אזור עם כלי דם זורמים.

לאחר בחירת אזור העניין, העבירו את המיקרוסקופ למצב דימוי מולטיפוטון והשתמשו במכוון הפוקוס כדי להזיז את העדשה אל מיקום ההתחלה הרצוי. לאחר מכן, לחצו על כפתור Z position top כדי לקבוע את הגבול העליון של סדרת ה-z ולהדמיות את רשת סיבי הקולגן על פני השטח של הגידול בערוץ ה-second harmonic generation. לאחר מכן, הזוזו את העדשה לעומק הדימוי הרצוי ולחצו על כפתור z position bottom כדי לקבוע את הגבול התחתון של סדרת ה-z.

בשלב הבא, הזינו את הערך הרצוי לשדות גודל הצעד (step size). לאחר מכן, עברו לפאנל צילומי זמן (Time Lapse Panel) והזינו את זמן ההמ=('lapse time) המתאים. לאחר שנקבעו פרמטרי הדמיות, החליפו את המזרק המחובר לקטטר במזרק המכיל צבע לסימון כלי דם והזריקו באיטיות עד 200 µL מתמיסת הצבע, תוך הקפדה על כך שהתמיסה תיכנס לווריד.

לאחר ההזרקה, החזיר את מזרק ה-PBS לקטטר והתחל בצילום time lapse של שלב ה-z. כאשר כל התמונות התקבלו, החלף את מזרק ה-PBS במזרק המכיל את החלבון להזרקה, תוך הקפדה שלא להחדיר בועות אוויר לתוך הצינור. לאחר מכן, הזרק לאט את תמיסת החלבון לעכבר והחלף שוב את המזרק במזרק המכיל PBS.

ניתן לעקוב אחר מקרופגים באמצעות דקסטראן המסומן פלואורסצנטית במשקל 70 kilodalton, אשר מצטבר במקרופגים הפגוציטיים. סימון כפול של תאי הגידול והמקרופגים מאפשר להמחיש בזמן אמת את האינטראקציה הישירה בין שני סוגי תאים אלו. כדי להמחיש שינויים בחדירות כלי הדם בגידול, ניתן להשתמש גם בנקודות קוונטיות (quantum dots) לסימון המרחב הווסקולרי.

מאחר שהם גדולים מספיק כדי שלא יפערו בקלות דרך החללים הבין-עורקיים. הדמיה רציפה ברזולוציה גבוהה מאפשרת ללכוד את אירועי חדירות כלי הדם ולכמת את קינטיקת נדיפת הדקסטראן והסליקתו. בשדה הראייה המוצג בדוגמה זו, שיאו של נדיפת כלי הדם נצפה בין דקה 29 לדקה 34, כפי שעולה מאות TMR החוץ-כליים.

הזרקה של צבעים וסקולריים או חלבונים נוספים כדי להשרות חדירות כלי דם יכולה לספק תובנה לגבי אירועי השליח (signaling) המווסתים את חדירות כלי הדם. ואכן, בתוך השניות הראשונות לאחר ההזרקה, ניתן להבחין בדקסטראן FITC במשקל 10 kilodaltons חומק מתוך כלי הדם, בעוד שדקסטראן TMR במשקל 155 kilodalton נותר מוגבל למרחב הוסקולרי. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להסיר את רקמת החיבור בעדינות כדי לא לפגוע במשטח הגומילה, ולהקפיד על שמירת הלחות של משטח הגומילה. בעקבות פרוצדורה זו של דינמיקה תאית, ניתן להמחיש הגירה של תאי גומילה כזו כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לכיוון הגירת תאי הגומילה ולתהליך האינטרוואזציה (intravasation). לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להמחיש אירועים תאיים דינמיים במיקרו-סביבה של גומילה באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית בין-חיה (intervital multiphoton microscopy).