Name: מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: למדו שיטה למדידת ייצור פחמן דו-חמצני בזבובי פירות Drosophila melanogaster באמצעות מצעים מסומנים בקרינה. טכניקה זו מאפשרת מדידות כמותיות ורגישות של חמצון דלק במספרים קטנים של זבובים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר מודה לד"ר מינגג'יאן לו ומוריס בירנבאום על עצות מועילות ותמיכה במימון מ-NIDDK (R21DK089391).

1. הכנת מזון מרחף שמכיל מצעים radiolabeled מטבולית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור microfuge, לערבב 1 - 2 המצע radiolabeled μCi (D- [6- 14 C] -glucose, D- [1- 14 C] או -glucose [1- 14 C] חומצה -palmitic, 40 - 60 MCI / מס &#39;1 mmol) עם 15 μl FD &amp; C צבע מזון כחול H 2 O שווה בנפח כולל של 25 μl. זהירות: פחמן -14 הוא פולט בטא נמוכה אנרגיה ובעל טווח קצר באוויר. עם זאת, לטפל כדי למנוע הטחת מולקולות רדיואקטיבי או בליעה בשוגג על ידי הנסיין. טוס בקבוקוני מזון להתהפך בקלות; הקפד לשכן אותם במיכל כי ימנע מהם מפנה, במיוחד כאשר radiolabel הוא במצב נוזלי (שלב 1.2) או במזון unsolidified (שלב 1.4). זבובים הם מאכילים או כבר נמאס מצעים radiolabeled תתחיל לנשוף כמויות קטנות של radiolabeled CO 2. זבובים אלה צריכים להישמר בקופסות אקריליק ב מנדף כימי, וצלוחית של ca KOHn להיות מוגדר בתיבה לשימוש בתור scrubber CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet כל המצע radiolabeled ותמהיל הצבע הכחול לתוך החלק התחתון של בקבוקון אוכל לטוס ריק (גובה: 9.4 ס&quot;מ, רוחב: 2.2 ס&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן חום לעוף מזון במיקרוגל עד שהמזון נוזלי פשוט (15 - 20 שניות בהספק גבוה עבור בקבוקון אחד המכיל 10 מ&quot;ל של מזון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 975 μl מזון מותך למצע radiolabeled / תערובת צבע הכחולה ובמהירות מערבולת, ניטור אחידות הצבע הכחול כדי להבטיח ערבוב מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מזון להתקרר לחזק לחלוטין ב RT במשך 20 - 30 דקות. </li></ol> 2. מצעים מטבולית radiolabeled האכלה כדי וזבובי פירות למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים מבוגר זבובים באמצעות מנגנון הרדמת CO 2 מורכב פוליאתילן נקבובי התמזג בסיס אקרילי ומחובר טנק CO 2 עם ווסת לחץ. זרימת CO 2 לתוך מנגנון ההרדמה ב 5 ליטר / דקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים העברהד טס בקבוקונים המכילים רדיואקטיבי, מזון כחול-צבוע (n = -15 - 30 זבובים בכל בקבוקון). בקבוקונים קאפ עם פקק קצף, ולנוח אופקי עד זבובים להתעורר. העברת צלוחיות למיכל אקריליק עפעפיים (180 ס&quot;מ x 180 ס&quot;מ x 240 ס&quot;מ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האכלה לטווח קצר, להרעיב זבובים במשך 18 - 24 שעות לפני העברת זבובים לאוכל radiolabeled עבור 2 -. צעד האכלת hr 3 T הוא הצעד רעב חשוב כי זבובים הפד לא לאכול באופן מהימן מקור חדש של מזון שהוצג בפניהם . האכלה לטווח ארוך במשך 5 - 7 ימים, זבובים לא צריכים להיות מורעבים, אבל הנסיין צריך לפקח על תכולת המים של המזון רדיואקטיבי ב צלוחיות זבובים הם שוכנו ולהשתמש מחט ומזרק להוסיף מי בקבוקונים עם מזון יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים למזון ללא תווית על ידי &quot;קשה&quot; אותם לתוך בקבוקון חדש. תקופת מרדף ראשונית של 2 - 4 שעות מאפשרת זבובים לנקות חלקיקי מזון רדיואקטיבי מן העור הקרני שלהם ומאפשרת עיכול של radiolabelמזון ed הנותר במעיים. לעקוב אחר התקדמות של מזון דרך המעיים על ידי בדיקה ויזואלית של זבובים לחפש בטן כחולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, העברת זבובים לסוגי מזון שונים (12 - 24 שעות על מזון רגיל או אגר 1% למדידת השפעות נמאס מול המדינה צמה ביום נשימה) או כאשר טמפרטורה סביבתית (12 - 96 שעות ב 18 ג או 30 ג עבור גנטי מניפולציות באמצעות GAL80 רגיש לטמפרטורה (GAL80 TS), עבור למשל). הערה: משך תקופת מרדף זו ישתנה בהתאם הניסוי מתבצע. עבור למשל, מרדף 96 שעות ב 30 C עשוי להיות נחוץ בניסויים באמצעות GAL80 ts כדי להפעיל באופן מלא את ביטוי transgene GAL4 תלוי. </li></ol> 3. הכנת מנגנון CO 2 -Collection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב חומרים כדי לבנות &quot;לעוף תרמילים&quot;, צינורות הכתיר רשת שיכיל זבובים שכותרתו עם 14 C-גלוקוז או 14 C-פלמיטית חומצה that יישאר פתוח לאטמוספרה. חותכים את 50 מ&quot;מ העליון של 12 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ צינורות פוליפרופילן, עוזב 25 צינורות מ&quot;מ ארוך, עגול תחתית. כן 35 מ&quot;מ x 35 מ&quot;מ ריבועים של רשת ניילון 130 מיקרומטר. כמו כן, להשיג קלטת שקופה מנפק קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב חומרים עבור מנגנוני -collection 2 CO. לכל לעוף תרמיל, להרכיב בקבוקון הנצנץ זכוכית 20 מ&quot;ל, פקק מכסה גומי עם חור מחוץ למרכז, מרכז גם להיות מוכנס דרך חור פקק העליון, כיתה GF / B זכוכית נייר מיקרופייבר מסנן (2.1 ס&quot;מ קוטר המעגל, 1 נקבובי מיקרומטר). GF / B מסנן נייר משמש בגלל החוזק הרטוב הגבוה וקיבולת טעינה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 5% KOH טריים ביום שימוש. רגע לפני שלב 3.4, לקפל ולהניח את נייר הסינון GF / B חוזר למרכז היטב כי הוא מושחל דרך החור של פקק גומי העליון להרוות אותו עם 100 μl של 5% KOH. עיין איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה (ים) על תקשורת ללא תווית,nesthetize זבובים עם CO 2. המברשת עפה לתוך צינור פוליפרופילן גזור, הכובע עם רשת ניילון, ולהשתמש קלטת שקופה לדבוק רשת אל צינור. לעבוד במהירות כדי למנוע זבובים מתעוררים ולברוח לפני הרשת כבר מודבקת היטב הצינור. מספר שווה של זבובים יש להשתמש בכל תרמיל זבוב לניסוי מסוים; 10 - 20 זבובים בכל תרמיל זבוב לייצר מספיק רדיואקטיבי-CO 2 למדידה לפי ספירת נצנץ (שלב 4.1 להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את התרמיל לטוס ל בקבוקון נצנץ זכוכית 20 מיליליטר. כיסוי או בקבוקון זכוכית עם פקק מכסה גומי מחזיק מרכז היטב המכיל נייר KOH-רווי GF / B מסנן. מקפל את הדף הרחב של פקק גומי העליון מעל שפתו של בקבוקון נצנץ זכוכית. עיין איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלוחיות זכוכית סט המכילות זבובי עפעפיים, מיכל אקריליק, דגירה במשך תקופות שונות של זמן (2 עד 12 שעות עובדות היטב). </li></ol> ניתוח 4. של תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בְּסוף הדגירה, צלוחיות זכוכית uncap, ונייר מסנן GF / B העברת רווי KOH ל בקבוקון הנצנץ פלסטיק 6 מ&quot;ל המכיל קוקטייל נצנץ 4 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להקפיא זבובים תרמילי זבוב על קרח ולאחסן יבש ב -80 C לקביעת מאוחר של מאוחסנים סובסטרטים. שים לב דגימות אלה הם רדיואקטיביים חייב להיות מאוחסן בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין בקבוקוני נצנץ נוספים: אחד המכיל נייר סינון בשימוש GF / B לשמש רקע ואחד שניים נוספים המכילים 0.1 - 0.5 מצע radiolabeled μCi לקבוע לדקה / μCi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד לדקה עבור כל דגימה באמצעות מונה נצנץ על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב pmol 14 CO 2 / לדקה ו pmol 14 CO 2 לכל זבוב לשעה. הפחת את לדקת הרקע מהערך לדקה עבור כל דגימה. מנתוני מצע radiolabeled המסודרים, לחשב את לדקת רקע תיקן / μCi של מדגם נספרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש ביצרנית שסופק על-ידי פעילות ספציפית וריכוז radiochemical של המצע רדיואקטיבי (למשל, 50 μCi / μmol ו -0.1 μCi / μl, בהתאמה) כדי לחשב pmol / לדקה. השתמש גורם זה כדי להמיר נתוני תרמיל זבוב-תקן רקע לדקה 14 CO 2 / מדגם pmol 14 CO 2 / מדגם. לאחר מכן יש לחלק במספר הזבובים ומספר שעות בתרמיל הזבוב. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+flies+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).</li>
<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila%3A+implications+for+aging+and+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+supports+growth+in+Drosophila+by+regulating+muscle+activity+and+nutrient+uptake+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+biol%22%5BJournal%5D)">AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut.</a> Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).</li>
<li>Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin%2FIGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Geront%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).</li>
<li>Van Voorhies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+function+in+Drosophila+melanogaster+in+response+to+hypoxia+and+pure+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen.</a> J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).</li>
<li>Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+determinants+of+variation+in+energy+metabolism%2C+respiration+and+flight+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila.</a> Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).</li>
<li>Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+metabolic+rate+in+Drosophila+using+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry.</a> JoVE. (88), e51681(2014).</li>
<li>Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+cyclin+D%2FCdk4+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+aging+and+sensitizes+animals+to+hypoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress.</a> Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).</li>
<li>Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+ability+of+cells+overexpressing+MYC+proteins+to+reduce+peroxide+and+hydroperoxides%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides.</a> Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).</li>
<li>Ontko, J. A., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+rate+of+oxidation+of+fatty+acids+in+animal+tissues.+Effect+of+substrate+concentration%2C+pH%2C+and+coenzyme+a+in+rat+liver+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations.</a> J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).</li>
<li>Vincent, A., Briggs, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((parkin-induced+defects+in+neurophysiology+and+locomotion+are+generated+by+metabolic+dysfunction+and+not+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress.</a> Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).</li>
<li>Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+and+mechanism+of+the+hexose+monophosphate+shunt+in+rat+liver+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices.</a> J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).</li>
<li>Katz, J., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+glucose-C14+for+the+evaluation+of+the+pathways+of+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism.</a> J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).</li>
<li>Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li>
<li>Sang, J. H., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Requirements+of+Axenically+Cultured+Drosophila+Melanogaster+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults.</a> J Exp Biol. , (1961).</li>
<li>Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+hepatic+utilization+of+glucose+for+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis.</a> J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).</li>
<li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+%22rate+of+living%22+model%3A+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).</li>
</ol>

המחבר מצהיר שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת החמצון של מצעים רדיואקטיבי מסוימים תסיסנית מבוגר. טכניקה זו היא פשוטה, כמוני, לשחזור ורגיש, והוא משלים שיטות קיימות מודדות ייצור הכולל CO 2 וצריכה O 2 כי זה יכול לשמש כדי לזהות את המזין (s) being חמצון לייצור ATP. מדידת CO 2 ששוחררה החמצון של מצעי radiolabeled ספציפיים באמצעות השיטה המתוארת כאן היא משלימה טכניקות המודדים ייצור CO 2 בקטגוריה כולה. הייצור הכולל CO 2 (CO2 V) מאפשר הערכה של קצב חילוף החומרים, וכאשר הצריכה הכוללת O 2 (V O2) ידוע, את קצב חילוף החומרים ניתן לחשב ואת מקור דלק עבור חמצון ניתן להעריך על בסיס יחס החליפין הנשימה (V O2 CO2 / V = RER). מתיפחמימות הן המצע בלעדי, RER = 1, אבל כאשר חומצות שומן הם המקור הבלעדי, RER = 0.7, בשל והרכב של התגובות של גלוקוז וחמצון שומנים. בהיעדר ציוד למדידת צריכת חמצן תסיסנית 14, מקור דלק החמצונים לא ניתן לזהות. עם זאת, על ידי תיוג טס עם כמויות זעירות של מצע רדיואקטיבי זו או אחרת ושיעורי מדידה של ייצור radiolabeled CO 2, אפשר להסיק מסקנות לגבי היכולת של זבובים לחמצן מצע נתון בנקודות זמן שונות במהלך גירוי או על ההשפעות של נתון מוטציה על חמצון דלק. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, יש לנקוט משנה זהירות בעת שימוש בחומרים רדיואקטיביים כדי שלא יישפכו וזיהום של תחומי מחקר. שנית, כאשר בהרדמת זבובים במהלך השלבים 2.1 ו -3.4, הנסיין צריך לעבוד במהירות כדי למנוע תופעות של CO 2 ממושךחשיפה על חילוף חומרים ועל התנהגות. קבוצה של 20 זבובים יכולה להיות מורדמת והועברה בקבוקון חדש או לתוך תרמיל לטוס ב -20 שניות או פחות. כאשר נגזרים מנגנון הרדמה כדי בקבוקון מזון, הבקבוקון צריך להיות מונח על צידו כדי למנוע זבובים הרדימו מ להיתקע על פני שטח המזון. כאשר הזבובים מזון רדיואקטיבי הפד במהלך כמה ימים כמו בשלב 2.2, הנסיין צריך להבטיח כי המזון לא להתייבש כמו זבובים רגישים להתייבשות. הפד או צם המדינה לפני תיוג, הבחירה של התווית, את משך הזמן תיוג, את משך הזמן בתרמיל לטוס, ואת שיטת ההרדמה הם פרמטרים שיכולים להיות חשוף פתרון בעיות ושינוי בעת שימוש בטכניקה זו. ראשית, זבובים נתונים תקופות תיוג קצרות (2 - 3 שעות) צפויים לצרוך כמויות משמעותיות של מזון רדיואקטיבי, אלא אם כן נתון תקופת צום לפני כן. שנית, הבחירה של ג תוויתלהשפיע מסקנות אחד יכול לצייר על פנוטיפים מטבוליים. לדוגמה, ייצור CO 2 רדיואקטיבי מ D- [1- 14 C] -glucose יכול לשקף חמצון דרך מחזור חומצת לימון או שנט פוספט pentose, בעוד שהייצור CO 2 רדיואקטיבי מ D- [6- 14 C] -glucose משקף חמצון דרך מחזור חומצת לימון בלבד 12,15,16. האכלת זבובים עם נותב רדיואקטיבי עבור חומצת אמינו חיונית 17,18 תהיה אסטרטגיה טובה להערכת חמצון של חומצות אמינו נגזרו חלבונים. לבסוף, תקופות תיוג ממושכות עם גלוקוז רדיואקטיבי גם מעלות את האפשרות של שילוב של מבשר זה למעמדות אחרות של מולקולות כגון טריגליצרידים 19 וחומצות אמינו כגון אלאנין, אשר interconverts בקלות עם פירובט. זה יכול להיות מוערך על ידי מדידת רדיואקטיביות שולבה מעמדות שונות אלה של מולקולות 6. ואכן, קבוצות נפרדות של זבובים יכולות להיות מוזן radiolabeled מצעים באותו אופן ואז המשמשים בניסויים תרמיל זבוב או מדידת radiolabel המאוחסן ונשאר גליקוגן וטריגליצרידים הפד וצם התנאים 6, למשל. אסטרטגיה נוספת היא להשתמש לתקופות קצרות תיוג כי צפויים לחשוף חמצון של הרכיבים התזונתיים radiolabeled עצמם ולא צורות אחסון של חומרים מזינים אלו. שלישית, אפשר גם כי שתי קבוצות של זבובים יכול להיות בשיעורים זהים של 14 ייצור CO 2 על פני פרק זמן נתון, אך בקצב שונה מאוד בתחילה. לכן, שינוי משך הזמן טס לבלות בתרמיל הזבובים עלול להיות פרמטר חשוב לשנות כאשר מעריכים וריאציה פנוטיפי. לבסוף, פרוטוקול זה מחייב שימוש של תקופה קצרה של CO 2 הרדמה כאשר לשים זבובים לתוך המנגנון תרמיל זבוב. יתכן כי הרדמה 2 CO עלול להשפיע על התפקוד המטבולי במהלך הניסוי תרמיל זבוב. ממלא מקוםpproach היא להשתמש הרדמה חנקן אשר אינה משפיעה על קצב חילוף החומרים 20. כמו בכל טכניקה מודדת מערכת מורכבת כגון חמצון דלק קצב חילוף חומרים, השיטה המתוארת כאן יש מגבלות. ראשית, יתכן כי זבובים בקבוצות שונות עשויים לצרוך כמויות שונות של מזון רדיואקטיבי וכך היה נכנס שלב איסוף CO 2 של assay עם כמויות התחלה שונות של מצע. זה יכול להיות נשלט על במידה מסוימת על ידי ביצוע הניסוי עם מדגמים גדולים ועל ידי האכלת זבובים בהמוניהם. לתקופות תיוג קצרות, זבובים עם אומץ בצבע כחול דומה יהיה צרך את radiolabel וניתן להעברת חלק המרדף של הניסוי. כמות radiolabel שנותר קבוצה של זבובים ניתן למדוד גם בסוף הניסוי מתבצע בקבוצות נפרדות של זבובים לאחר תום ההנקה ותקופת מרדף ראשוני. שנית, רמת הפעילות ביןקבוצות של זבובי התרמילים לטוס עשויות להיות שונות. זה יצטרך להיקבע באופן ניסיוני ומובאות כאשר לפרש נתונים. שלישית, טכניקה זו אינה מודדת ייצור הכולל CO 2, ייצור רק מזין תזונתי ספציפי או בצורת האחסון (ים) של המזין. פרוטוקול זה אינו מהווה תחליף אלא הוא משלים מדידות של VCO 2 משום שהוא מספק מידע שונה נוסף. השיטה המתוארת כאן מודד נשף, radiolabeled CO 2 כי הוא תוצר של חמצון של כמויות זעירות של מצעים מטבוליים ספציפיים. על ידי שינוי התווית בשימוש - גלוקוז, חומצות שומן, או חומצת אמינו - אחד יכול לעצב ניסויים מתוחכמים יותר ויותר להעריך את תרומתם של מצעים שונים למטבוליזם בתנאים פיסיולוגיים שונים כגון הרעבה על רקע גנטי שונה. יישומים עתידיים של טכניקה זו כוללים מדידת metabolisמ בשלבי זחל גלמים של פיתוח, שני שלבי מחזור החיים תסיסנית המאופיינות קצוות של אחסון מזין והתמוטטות, בהתאמה.

עבודה באורגניזם מודל תסיסנית תרמה רבות להבנת עקרונות גנטיים, תהליכים התפתחותיים, צמיחה, הזדקנות, התנהגות, חסינות ומחלות של בני אדם 1,2. מספר עצום של גישות ביולוגיות גנטיות תא תסיסנית העלתה התקדמות בתחומים אלה. עם זאת, המחקר של חילוף החומרים זבוב הפירות פיתחה לאט יותר, בין השאר כתוצאה גדול קשיים במדידת פרמטרים מטבוליים חיה קטנה כזאת. העניין באמצעות תסיסנית כמודל לחקר מחלות אנושיות כגון סוכרת להבנת תרומתם של חילוף החומרים כדי פתולוגיות צמיחה שונים דחף בתחום לפתח ולהתאים טכניקות מטבולית אורגניזם הזה 3,4. שיטות אמינות זמינות כעת למדידת מספר הפרמטרים מטבוליים זבוב הפרות. לדוגמה, זה פשוט להעריך את צריכת המזון <sעד&gt; 5, רמות הטריגליצרידים מאוחסנים גליקוגן, כמו גם רמות hemolymph במחזור של גלוקוז והסוכר במחזור מרכזי לטוס, trehalose, שהינה דו סוכר המורכב משתי מולקולות של גלוקוז 4. שימוש קליעים נותבים מטבולית אפשרה בחקר מזין הקליטה מן הדיאטה ואת ההמרה של חומרים מזינים נספגים כגון גלוקוז אל גליקוגן צורות אחסון וטריגליצרידים 6. קצב חילוף החומרים ניתן להעריכם זבוב הפירות באמצעות מדידת צריכת החמצן 7,8 ופחמן דו חמצני (CO 2) ייצור. במעגל החומצה הציטרית מתחמצן יחידות דו-חמצנים שיכולים להיכנס למעגל כמו אצטיל-אנזים (COA), אשר נגזרה מטבוליזם של פחמימות בתזונה ומאוחסן וחומצות שומן. כל סיבוב של מחזור מייצר מולקולה אחת של GTP (או ATP) ואת תורם אלקטרון 2 FADH, שלוש מולקולות של NADH, ואת שתי מולקולות של CO פסולת 2. הפקה משותפת 2 יכוללהשתמש כדי להעריך את קצב חילוף חומרים בסיסי. ייצור הכולל CO 2 ניתן לכמת תסיסנית באמצעות-הזמין מסחרית או בעבודת יד respirometers 9-10,11. מדידת הייצור הכולל CO 2, במיוחד כאשר מצמידים עם מדידת צריכת O 2, מספק תובנה חשובה לחילוף חומרים של אנרגיה לכל הגוף. עם זאת, מדד זה לא יזהה את המזין מלהיות חמצון עבור אדנוזין אדנוזין (ATP) ייצור. שלושה סוגים עיקריים של חומרים מזינים יכול להיכנס ההמרה הבאה מעגל החומצה הציטרית כדי אצטיל CoA: פחמימות, חומצות שומן, וחלבונים. גלוקוז-6-פוספט, נגזר מן הגלוקוז תזונתיים או הגליקוגן, ניתן להמיר ל פירובט כי הוא decarboxylated ידי פירובט דהידרוגנאז לגבש CoA אצטיל. התפלגות חומצות שומן נגזרות הדיאטה או טריגליצרידים מאוחסנים על ידי תשואות-חמצון ß אצטיל CoA כי אז נכנסה במעגל החומצה הציטרית. סוף כל סוף, ברוב של חומצות אמינו יכול להיכנס למעגל חומצת הלימון הבא המרתי ל פירובט, אצטיל ביניים מחזור CoA או חומצת לימון כגון ketoglutarate אלפא. מזין ספציפי תרומה לחילוף אנרגיה במהלך בסיס ותנאי מגורה ניתן לנטר באמצעות קליעים נותבים רדיואקטיביים. הפרוטוקול המובא כאן הוא מותאם לשימוש תסיסנית מתוך פרוטוקול המשמש להערכת חמצון בתאים הגדלים בתרבית 12,13. לפי גישה זו, זבובי פרות ניזונים 14 מצעים מטבולית C-רדיואקטיבי (פחמימות, חומצות שומן, או חומצות אמינו) בתזונה לזמן קצר (שעות) או ארוכים (ימים) דופק, רדפו על מזון ללא תווית, ולאחר מכן נחשף תא המכיל אשלגן הידרוקסידי (KOH) נייר סינון -saturated על השמנת CO ננשף 2 כמו ביקרבונט. ניתן לכמת ביקרבונט radiolabeled ידי ספירת נצנץ. הבדלי radiolabeled-CO 2 ייצור בין הניסויקבוצות אל זבובים עשויות לשקף שימוש בדלקים שונים לייצור ATP במהלך של הבדלים מהר או פנימיים ממושך במטבוליזם דלק בין גנוטיפים, למשל.

<table><tbody><tr><td>חומצה פלמיטית, [1-14C]-, 50 ומיקרו; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז, D-[6-14C]-, 50 ומיקרו; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז, D-[1-14C]-, 50&micro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני Drosophila, צרים, פוליסטירן</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליפרופילן עגולים תחתונים, 12 x 75 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>רשת, ניילון ניטקס, 120 ומיקרו; m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ זכוכית בורוסיליקט 20 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>פקק עליון בקבוק עם חור מחוץ למרכז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>מרכז פוליפרופילן באר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B נייר סינון מיקרופייבר זכוכית, עיגול, קוטר</td> <td>2.1 ס"מפישר סיינטיפיק</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ 6 מ"ל עם מכסי דחיפה/פיתול</td> National <td>Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב<em&gt; תסיסנית</em

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

כוחה של הגנטיקה תסיסנית הולכת ומיושמת בהדרגה לשאלות של איתות הורמון ואת חילוף החומרים כדי פיתוח מודלים של מחלות אנושיות באורגניזם זה. רגישות שיטות למדידות של פרמטרים כגון קצב חילוף חומרים נדרשות לנהוג להבנת פיזיולוגיה ומחלות בבעלי חיים קטנים כמו זבוב הפרות. השיטה המתוארת כאן מעריך חמצון דלק במספרים קטנים של זבובים בוגרים נמאס מזון המכיל כמויות זעירות של 14 מצעים C שכותרתו כגון גלוקוז או חומצת שומן. לאחר תקופת ההאכלה וכל מניפולציות ניסיוני נוספות, זבובים מועברים צינורות קצרים כתרים עם רשת, אשר ממוקמים אז צלוחיות זכוכית המכילות נייר סינון KOH-רווי כי מלכודות נשף, CO radiolabeled 2 שנוצר מפני התחמצנות של מצעים רדיואקטיבי כמו אשלגן ביקרבונט, KHCO 3. ביקרבונט radiolabeled זו נמדד על ידי ספירת נצנץ. זהו aquantitative, לשחזור, גישה פשוטה לחקר חמצון דלק. השימוש של גלוקוז רדיואקטיבי, חומצות שומן, חומצות אמינו או מאפשר לקבוע את תרומתו של מקורות דלק שונים אלה לחילוף אנרגיה בתנאים שונים כגון האכלה וצום וב רקע גנטי שונה. זה משלים גישות אחרות המשמשות למדידה במטבוליזם אנרגית vivo וצריך לקדם את ההבנה של ויסות חילוף חומרים.

כמות radiolabeled נשף לכודים CO 2 כי מופק מטבוליזם של מצע רדיואקטיבי צריך לתאם עם מספר הזבובים בתרמיל לטוס כמו גם את משך הזמן החיות לבלות במנגנון אוסף CO 2. כדי לבחון זאת, זבובים שהיו צם במשך 18 שעות הואכלו חומצה פלמיטית רדיואקטיבי (0.02 μCi / מזון μl) עבור 2 שעות ולאחר מכן נבדק לייצור radiolabeled CO 2 בקבוצות של 12 או 25 חיות במשך 3 או 6 incubations hr. כמות ה- CO 2 המיוצרת על ידי 25 זבובים הייתה כמעט כפול הכמות המיוצרת על ידי 12 זבובים, ואת הסכום לכל קבוצה הוכפל כאשר זמן הדגירה, מ -3 שעות עד 6 שעות (איור 2 א). Pmol 14 CO 2 / לטוס / hr היה כמעט שווה ערך בכל קבוצה. צום מגרה את התמוטטות חומצות שומן על ידי SS oxidation; ולכן CO 2 ייצור מפני התחמצנות חומצות שומן צריך להיות מורם בחיות צמות לעומת האכלת חיות. כדי לקבוע אם זה היה המקרה, 18-hr צם זבובים הואכלו חומצה פלמיטית radiolabeled עבור שעה 2. בעקבות דופק האכלה קצר זה, זבובים חולקו לשתי קבוצות והועברו אוכל לטוס ללא תווית או אגר 1% במשך 3 שעות ולאחר מכן הועברו לטוס תרמילים עבור שעה 2. בשני ניסויים נפרדים, זבובים רדפו על CO radiolabeled משמעותית אגרו פיק יותר 2 לעומת זבובים רדפו על מזון (איור 2 ב), המציין כי חמצון ß הוגדל בחי הצם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> איור 1. המנגנון לאיסוף נשף, radiolabeled CO 2. זבובים שכילו מצעים מטבולית רדיואקטיבי הםמכניס &quot;לעוף תרמיל&quot; (FP), צינור צנטריפוגות הפסקה כתרים עם רשת (M). תרמיל הזבוב מושם לתוך בקבוקון נצנץ זכוכית 20 מיליליטר כתרים עם פקק מכסה גומי (S) המכיל חור מחוץ למרכז, דרך אשר ממוקם מרכז היטב (CW) המכיל מסנן נייר GF / B רווי 100 μl 5% KOH. נשף CO 2 מגיב עם KOH והוא לכוד על נייר פילטר כמו ביקרבונט. לכודים, ניתן לכמת CO 2 רדיואקטיבי על ידי ספירת נצנץ של נייר הסינון הרווי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> איור 2. 14 וקושרת ייצור CO 2 עם זמן ואת מספר זבוביםPod Fly ומגיב הפד והגבלות צמות. (א) סכום של 14 CO 2 מיוצר זבובים נמאס palmitate radiolabeled בקורלציה עם מספר הזבובים נבדק (n = 12 (ברים פתוחים) או 25 (ברים סגור)) ואת משך הזמן בתוך תרמיל זבוב (3 או 6 שעות ). על בסיס לכל-fly, זבובים מיוצרים 0.99, 1.13, 1.10 ו 1.01 pmol 14 CO 2 / hr (נתונים המפורטים באותו שמאלי כדי בסדר נכון כנתוני גרף). (ב) זבובים נרדפו על אגר מתחמצן יותר radiolabeled palmitate מאשר זבובים כי נרדפו על מזון. ממצאים מתוך שני ניסויים מדווחים כאמצעי סטיית תקן, n = 16 - 17 זבובים / קבוצה (ניסוי 1); n = 10 זבובים / קבוצה (ניסוי 2). * P = 0.017, מבחן t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

מאמר זה מתאר שיטה למדידת חמצון דלק ב-Drosophila melanogaster שבה כמויות זעירות של מצעים מטבוליים ספציפיים המסומנים ברדיו מוזנות לזבובים. ה-CO2 הנשוף המסומן ברדיו שהוא מיוצר מחמצון דלק נאסף ונמדד.

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא למדוד פחמן דו-חמצני המיוצר על ידי זבובים שלםים, עם תסריות מסומנות רדיואקטיבית כגון palmitic acid או glucose. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח עבור חוקרי Drosophila, כגון השאלה האם מוטציה מסוימת עשויה להשפיע על מטבוליזם האנרגיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידות כמותיות, רגישות וניתנות לשחזור של חמצון דלק במספרים קטנים של זבובים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי הרכבת תא הזבובים דורשים מניפולציה מהירה של חלקים קטנים כדי להבטיח בנייה תקינה של המערך הניסויי לפני שהזבובים יתאוששו מההרדמה. Carbon-14 הוא פולט בטא בעל אנרגיה נמוכה וטווח קצר באוויר, אך עדיין יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע שפיכה של מולקולות מסומנות רדיואקטיבית או בליעה מקרית על ידי הנסיין. ערבבו 1 עד 2 microcurie של סובסטרט מסומן רדיואקטיבית עם 15 µL של צבע מאכל כחול FD&C Number One ומים כדי להגיע לנפח כולל של 25 µL.העבירו באמצעות פיפט את כל תערובת המצע המסומן רדיואקטיבית והצבע הכחול לתחתית של מבחנת מזון לזבובים ריקה. מכיוון שמבחנות מזון לזבובים נוטות להתהפך בקלות, ודאו שהן מוצבות בתוך מיכל שימנע מהן להתהפך. חממו מזון סטנדרטי לזבובים בתנור מיקרוגלים עד שהמזון יהיה נוזלי.15 עד 20 שניות ברמת הספק גבוהה מספיקות בדרך כלל עבור מבחנה אחת המכילה 10 milliliters של מזון. הוסף 975 microliters של המזון המותך לתערובת התסבסית המסומנת רדיואקטיבית והצבע הכחול, וסובב במהירות תוך ניטור אחידות הצבע הכחול כדי להבטיח ערבוב מלא. ייתכן שיהיה צורך לחתוך את קצות הפיפטה בעזרת מספריים כדי להרחיב את הקצה הצר, ובכך לאפשר שאיבה מדויקת של המזון המותך והצמיגי.הניחו למזון להתקרר ולהתמצק לחלוטין בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות. לצורך הרדמת זבובים בוגרים, נעשה שימוש במכשיר הרדמה באמצעות פחמן דו-חמצני, המורכב מפוליאתילן נקבובי המחובר לבסיס אקרילי ומחובר למיכל פחמן דו-חמצני עם ווסת לחץ. הזרים פחמן דו-חמצני אל מכשיר ההרדמה בקצב של חמישה ליטרים לדקה.העבירו את הזבובים המורדמים לבקבוקונים המכילים מזון כחול עם סימון רדיואקטיבי. סגרו כל בקבוקון עם פקק ספוג והניחו אותו במצב אופקי עד שהזבובים יתעוררו. העבירו את הבקבוקונים למכל אקרילי עם מכסה.להאכלה לטווח קצר, הרעיבו את הזבובים במשך 18 עד 24 שעות לפני העברתם למזון המסומן רדיואקטיבית, כדי להבטיח שהם יאכלו במהלך שלב ההאכלה שנמשך שעתיים עד שלוש שעות. להאכלה לטווח ארוך לאורך חמישה עד שבעה ימים, אין צורך להרעיב את הזבובים, אך על החוקר לנטר את תכולת המים של המזון המסומן רדיואקטיבית בתוך הבקבוקונים, ולהשתמש במחט ומזרק כדי להוסיף מים לבקבוקונים עם מזון יבש. עם סיום תקופת ההאכלה בסובסטרט המסומן רדיואקטיבית, העבירו את הזבובים למזון לא מסומן על ידי הקשתם אל תוך בקבוקון חדש.תקופת מרדף (chase period) ראשונית של שתיים עד ארבע שעות מאפשרת לזבובים לנקות חלקיקי מזון מסומנים רדיואקטיבית מהקוטיקולה שלהם, ומאפשרת את עיכול המזון המסומן שנותר במעי. עקבו אחר התקדמות המזון במעי באמצעות בדיקה חזותית של הזבובים כדי לחפש בטנים כחולות. לאחר מכן, העבירו את הזבובים לסוגי מזון שונים או לטמפרטורות סביבה שונות.אורך תקופת המרדף (chase period) זו ישתנה בהתאם לניסוי המבוצע. לפני בניית מנגנון איסוף הפחמן הדו-חמצני, הכינו את החומרים להרכבת תאי זבובים (fly pods), שהם מבחנות עם מכסי רשת אשר יכילו זבובים שסומנו ב-C-14 glucose או ב-C-14 palmitic acid, ויישארו פתוחות לאטמוספירה. הצמידו להב תער באמצעות המוסטט, חממו אותה בלהבת מבער בונסן עד שתהיה לוהטת, והשתמשו בלהב החם כדי לחתוך את 50 המילימטרים העליונים של מבחנות פוליפרופילן במידות 12 מילימטר על 75 מילימטר, כך שיישארו מבחנות בעלות תחתית עגולה באורך 25 מילימטר.הכינו ריבועים של 35 מילימטר על 35 מילימטר מרשת ניילון של 130 מיקרון. גזרו מספר חתיכות של סרט דביק שקוף באורך של שעה וחצי עד שתי אינץ'. לאחר מכן, הכינו את החומרים עבור התקן איסוף הפחמן הדו-חמצני.עבור כל תא זבוב, הרכיבו מבחנת סינטילציה מזכוכית בנפח 20 milliliter, פקק גומי עם חור שאינו מרכזי, באר מרכזית ונייר סינון ממיקרו-סיבי זכוכית בדרגת GFB. הכניסו את הבאר המרכזית דרך החור שבפקק העליון. הכינו 5% potassium hydroxide טרי ביום השימוש.ממש לפני הרדמת הזבובים לצורך העברתם אל ה-fly pod, קפלו והניחו את נייר הסינון העגול מסוג GFB אל תוך הבאר המרכזית המחוברת דרך החור של פקק הגומי העליון, והספיגו אותו ב-100 µL של potassium hydroxide בריכוז 5%. העברת זבובים מורדמים אל ה-fly pods היא השלב המאתגר ביותר בפרוטוקול זה. כדי להבטיח הצלחה, יש להכין את כל החומרים הדרושים בהישג יד, ולעבוד במהירות כדי להגביל את חשיפת הזבובים ל-carbon dioxide ולמנוע מהם להתעורר ולהימלט לפני שהרשת הוצמדה היטב לשפופרת.לאחר הדגירה במצעים שאינם מסומנים, הרדימו את הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני. העבירו בעזרת מברשת את הזבובים המורדמים אל תוך מבחנת פוליפרופילן חתוכה, סגרו אותה באמצעות רשת ניילון, והשתמשו בסרט דביק שקוף כדי להדביק את הרשת למבחנה. יש להשתמש במספר שווה של זבובים בכל תא זבובים (fly pod) עבור ניסוי נתון.10 עד 20 זבובים לכל תא גידול (fly pod) מייצרים כמות מספקת של פחמן דו-חמצני מסומן רדיואקטיבית למדידה באמצעות ספירת נצנוצים. העבירו את תא הגידול לבקבוק זכוכית לספירת נצנוצים בנפח 20 milliliter. סגרו את בקבוק הזכוכית עם הפקק בעל ראש הגומי, המכיל באומרה מרכזית נייר סינון GFB רווי ב-potassium hydroxide.קפלו את החלק העליון הרחב של הפקק עם כיסוי הגומי מעל שפת בקבוק הניצנוץ (scintillation vial) מזכוכית. הניחו את בקבוקי הזכוכית המכילים את הזבובים בתוך מיכל אקרילי עם מכסה, והדגירו למשך פרקי זמן משתנים. בתום הדגירה, הסירו את פקק בקבוק הזכוכית, והעבירו את נייר הסינון GFB הרווי ב-potassium hydroxide לבקבוק ניצנוץ פלסטיקי בנפח 6 milliliters המכיל 4 milliliters של תמיסת ניצנוץ (scintillation cocktail).הכינו מבחנות סנצילציה נוספות, אחת המכילה נייר סינון GFB שלא היה בשימוש כדי לשמש כרקע, ואחת עד שתיים מבחנות נוספות המכילות 0.1 עד 0.5 microcurie של סובסטרט מסומן רדיואקטיבית כדי לקבוע את מספר הספירות לדקה ל-microcurie. באמצעות מונה סנצילציה, מדדו את מספר הספירות לדקה עבור כל דגימה בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר מכן, חשבו את סך ייצור הפחמן הדו-חמצני כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול.הזבובים הורעבו למשך 18 שעות, הוזנו בחומצה פלמיטית מסומנת רדיואקטיבית במשך שעתיים, ולאחר מכן נבדקה הפקת פחמן דו-חמצני מסומן רדיואקטיבית בקבוצות של 12 או 25 בעלי חיים עבור דגירה של שלוש או שש שעות. כפי שמוצג בגרף זה, כמות הפחמן הדו-חמצני שהופקה על ידי 25 זבובים הייתה כמעט כפולה מהכמות שהופקה על ידי 12 זבובים, והכמות של כל קבוצה הוכפלה כאשר זמן הדגירה הוארך משלוש לשש שעות. כמות הפחמן הדו-חמצני המסומן רדיואקטיבית בפיקומול לזבוב לשעה הייתה כמעט שווה בכל קבוצה.מכיוון שצום מעורר את פירוק חומצות השומן באמצעות בטא-חמצון, ייצור פחמן דו-חמצני מחמצון חומצות שומן אמור להיות מוגבר בבעלי חיים בצום בהשוואה לבעלי חיים שהוזנו. כדי לבחון זאת, זבובים שהצמידו צום של 18 שעות הוזנו בחומצה פלמיטית מסומנת רדיואקטיבית במשך שעתיים, חולקו לשתי קבוצות, והועברו למזון זבובים לא מסומן, או ל-1% agar. בשני ניסויים נפרדים, זבובים שעברו שלב מרדף (chase) על agar ייצרו משמעותית יותר פחמן דו-חמצני מסומן רדיואקטיבית מאשר זבובים שעברו שלב מרדף על מזון, מה שמעיד על כך שבטא-חמצון היה מוגבר בבעלי החיים בצום.בעקבות נוהל זה, ניתן לבצע שיטות משלימות כגון מדידה של ייצור פחמן דו-חמצני כולל, צריכת חמצן כוללת, וחישוב של יחס חילוף הנשימה (respiratory exchange ratio) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מהו מקור הדלק המועדף. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן השימוש בפרוטוקול זה כדי לקבוע את ההשפעה של מוטציה נתונה או מניפולציה ניסויית על היכולת להשתמש בדלק ספציפי כמקור אנרגיה. זכרו כי עבודה עם רדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע נוהל זה, כגון חבישת כפפות, חלוקי מעבדה ומשקפי מגן, ושימוש במיגון מתאים.

measurement-carbon-dioxide-production-from-radiolabeled-substrates

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה למדידת עומס חיידקי E. coli לאחר הזרקת E. coli לבית החזה של Drosophila melanogaster.

מדידת עומס חיידקי E. coli ב- Drosophila melanogaster בעקבות זיהום E. coli

הפרעות מטבוליות הן בין אחת המחלות הנפוצות ביותר בבני אדם. אורגניזם המודל גנטי הצייתן ד melanogaster יכול לשמש כדי לזהות גנים רומן שמווסתים את חילוף חומרים. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה יחסית המאפשרת ללמוד את קצב חילוף חומרים בזבובים על ידי מדידת ייצור CO 2 שלהם.

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O2 שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .

מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

במאמר זה אנו מדגימים כיצד לנתח את מערכת העצבים המרכזית של הזחלים third תסיסנית instar.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

המחקר של התנהגות של תנועה...

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

בשנת חרקים, oenocytes לייצר תרכובות פחמימנים cuticular. תרכובות אלו להגן מפני התייבשות ולאפשר תקשורת כימית. כאן אנו להפגין טכניקה לנתיחה להשתמש כדי לבודד את oenocytes מן...

Dissection של Oenocytes מן למבוגרים תסיסנית melanogaster</em

תסיסנית האשכים melanogaster ניתן במהירות וביעילות מבודדים מן הזכרים הבוגרים באמצעות מחטים לנתח. בעזרת תרגול, ניתן לבודד בקלות בתוך יום או יומיים סכום של האשכים מספיק לניתוח DNA או RNA על ידי רצף תפוקה גבוהה יותר או מסורתי או בשיטות הביולוגיה המולקולרית של חלבון עבור מבחני נוגדנים או אנזים מבוססות.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

למדו שיטה למדידת ייצור פחמן דו-חמצני בזבובי פירות Drosophila melanogaster באמצעות מצעים מסומנים בקרינה. טכניקה זו מאפשרת מדידות כמותיות ורגישות של חמצון דלק במספרים קטנים של זבובים.

מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב

גלה סרטונים נוספים