Dissection ו-הרכבה שטוחה של שלד Threespine קוצן branchial

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע דיסקציה והרכבה שטוחה (flat-mount) של השלד הברנכיאלי של דג הסטיקלבק. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחומי ההתפתחות, הגנטיקה והאבולוציה, כגון כיצד בעלי חיים מסתגלים לסביבות חדשות וכיצד נוצר שונות במורפולוגיה של בוגרים במהלך ההתפתחות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שעל ידי דיסקציה והרכבה שטוחה (flat-mounting) של השלד הבלעמי, ניתן להבחין במגוון של תכונות טרופיות שלא ניתן לחקור בדגימות שלמות (whole-mount). כהכנה, יש לסקור את המורפולוגיה של שלד הראש של דג הסטיקלבק בעל שלושה קוצים (three spine stickleback). לאחר הכנת הדג לדיסקציה, התחילו בהחדרת פינצטה חדה מספר 5 לצד העין, בזווית של 45 מעלות, כדי לנקב את הקרומי המכסה את העין.

לאחר מכן, קלפו את קרומי העין, בדומה להסרת המכסה של גביע יוגורט. כעת, הכניסו פינצטה פתוחה מאחורי העין, אחזו בעצב הראייה והוציאו את העין. היזהרו שלא לנקב את העין, כדי למנוע דליפה של מלנין.

חזור על תהליך זה עם העין בצד הנגדי. לאחר מכן, הנח את להב מספריים קטנים תחת הצד האחורי של תflap של ה-opercle, וגזור דרך הרקמה הרכה גבייה מעל ה-opercle, לכיוון מחסום העין. לאחר מכן, גזור דרך עצם המצח, הנמצאת גבית למחסום העין.

לאחר מכן, חתכו דרך קו האמצע של עצם ה-parasphenoid, סביב מרכז מחלול העין. חזרו על חיתוך ה-opercle בצד הנגדי. בשלבים הבאים, ניתן להשתמש בקוצי האגן כנקודות אחיזה.

אתה פותח אותם על ידי משיכה עדינה ישירות הרחק מהגוף. כעת, הכנס את הפינצטה מתחת לאופרקלום (opercle), וקלף לאט את הפנים מהגוף. תוך כדי התהליך, גזור כל רקמה רכה שעדיין מחוברת.

היו זהירים סביב מסנני הזימים, והקפידו לא להפגיע בהם. קל לתפוס בטעות את העצם הריסית הראשונה (ceratobranchial bone), יחד עם ה-percoll, בעת הסרת השלד הפניםי. הסתכלו מתחת ל-percoll בעודכם מקלפים אותו קדימה כדי לוודא שאינכם מחזיקים ברכיב נוסף.

כעת, בעזרת פינצטה, נתקו את ה-ceratohyals משני צדי ה-basihyal בקו האמצע, תוך써 קישוף והסרה של השלד הפניםי גולגולתי קדמי (anterior cranial facial skeleton). חזרו על הפעולה בצד המ相对. השלד הפניםי גולגולתי קדמי כולל את הלסת כולה, את כל שלד הלשון (hyoid skeleton), את האלמנטים הגביים והאנדוכונדרליים שמתחתיהם ואת החלק הקדמי של הגולגולת.

בשלב הבא, הכניסו פינצטה סגורה ממש מתחת לצינור המעי, וגררו אותה קדימה (אנטריאלית), תוך הפרדת השרירים והרצועות שנותרו המחוברים לשלד הזיקים. לאחר מכן, השתמשו בקצה הפינצטה הסגורה כדי לגרד ולהסיר את השרירים המחברים את השלד הזיקים הגבי (דורסלי) למארז המוח הגחוני (בנטרלי).

גרדו בתנועה מאחור לפנים. חזרו על תהליך הסרת השרירים בצדו השני של הדג הקוצני. לאחר מכן, הסירו את שלד הזימים על ידי תפיסת בסיס צינור המעי ומשיכה לכיוון anterior.

הפרידו את צינור מערכת העיכול באמצעות חיתוך ניצב, מאחור ל-ceratobranchial החמישי. טעות נפוצה היא תפיסה קדמית מדי של צינור מערכת העיכול, מה שמותיר את הצינור הפרונטלי ונטרלי הרחק מאחור. הקפידו לתפוס בעומק בחלק האחורי של חלל בית החזה; ניתן תמיד להסיר את שארית צינור מערכת העיכול בשלב מאוחר יותר.

לאחר הסרת שאריות רססי עצם מבית המוח בצד הגבי (dorsal) של השלד הבלתיות (branchial skeleton), הכניסו מספריים לסל הבלתיות ובצעו חיתוך גבי בין זוגות לוחות השיניים הגביים הדו-צדדיים. יש לשמור על חיתוך מרכזי כדי למנוע נזק ללוחות השיניים הגביים.

בשלב הבא, בצעו שני חתכים צידיים רדודים בתוך חלל המעי הגומי בקצה האחורי של השלד הברנכיאלי. בקצה הקדמי של צינור המעי, כדי לסייע בפתיחת השלד הברנכיאלי.

כעת, העבירו את השלד למסורת מיקרו-צנטריפוגה המכילה 50% glycerol ו-0.25% potassium hydroxide לצורך הבהרה עדינה. לחלופין, העבירו אותו ל-glycerol טהור אם אין צורך בהבהרה נוספת. אם נדרש צביעה חוזרת, פרטים מופיעים בפרוטוקול הכתוב.

כדי להכין את הדגימה להרכבה, החליפו את התמיסה בגליצרין טהור ונערו את המבחנה במשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, הוציאו את השלד הברנכיאלי והניחו אותו קרוב לתחתית של זכוכית כיסוי בגודל 22 על 60 מילימטר, כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. כעת, העבירו מספר טיפות של גליצרין על השלד.

בשלב הבא, גלגלו שני כדורים קטנים של פלסטלינה, והניחו אחד בכל קצה של זכוכית כיסוי; הם משמשים כמעצברים. לאחר מכן, הניחו בעדינות זכוכית כיסוי שנייה מעל הדגימה, עם לחץ מספיק כדי להשטיח את השלד ה branchial הקדמי. כעת, קלפו בעדינות את המכסה הגבית השמאלית, כולל לוחות השיניים הגביים, והחליקו את המכסה בין זכוכיות הכיסוי.

לאחר מכן, בצעו את אותו התהליך עם השפופרת הגבית הימנית. דחפו את כל השלד הזיקיאה הרחק מקצה זכוכית הכיסוי. כדי להשלים את הפרוצדורה, לחצו קלות על זכוכית הכיסוי העליונה כדי לשטח את כדורי החימר.

כמות מספיקה כדי לשמור על השלד הברנכיי מקובע בצורה שטוחה, אך לא כל כך הרבה עד שיהיה מעוך. אם במהלך התהליך שורה של רייקרים (rakers) נסתרת, החליקו פינצטה בין הזרימות וסדרו מחדש את ה-ceratobranchial או את כל הדגימה.

כאשר הדגימה מורכבת באופן שטוח בגליצרין טהור, ניתן לאחסנה בצורה שטוחה בטמפרטורת החדר למשך עשור לפחות. פרוטוקול זה מביא לשלד בסיסי (branchial skeleton) מנוסח ומורכב באופן שטוח, שבו ניתן לתעד באופן כרונולוגי מגוון של תכונות תזונתיות חשובות.

במבט גבי (דורסלי), ניתן לדמות ולתעד בקלות את כל שורות מסנני הזימים, את כל לוחות השיניים הלועיים וכמעט את כל העצמות בראכיאליות. Alizarin red S פולט פלואורסנציה גם תחת פילטר רודמין או פילטר אדום דומה, מה שמאפשר סימון כפול עם סמנים אחרים ושיטות חלופיות לוויזואליזציה. בתמונה זו, מסנני הזימים מסומנים באמצעות סימני קרה (<).

שיניים מסומנות בחצי חץ, ועצמות מסומנות בכוכביות. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את הנתיחה תוך דקות ספורות ובמספר מאות בעלי חיים במהירות יחסית. ואף שביצענו הדגמה של נתיחה של שלד בראשו של דג הסטיקלבק, אנו מקווים שפרוצדורה זו תשמש כמדריך עבור מגוון מיני דגים.

על ידי נתיחה של השלד הברנקיאלי (branchial skeleton), אנו יכולים להמחיש במהירות ובקלות מגוון של תכונות תזונתיות חשובות, שאינן נראות בדגימות שלמות. דבר זה מאפשר הבנה טובה יותר של ההתפתחות והאבולוציה של השלד הפנים-גולגולתי.