Dissection ו-הרכבה שטוחה של שלד Threespine קוצן branchial
7 במאי 2016
השלד המסועף, כולל מגרפות זימים, שיני לוע ועצמות מסועפות, משמש כאתר העיקרי לעיבוד מזון ברוב הדגים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח והרכבה שטוחה של השלד הפנימי הזה בסטיקלבק תלת-שדרתי. שיטה זו ישימה גם למגוון מיני דגים אחרים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח ולהרכיב את שלד ה-Stickleback Branchial. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי ההתפתחות, הגנטיקה והאבולוציה. כגון כיצד בעלי חיים מסתגלים לסביבות חדשות וכיצד מתעוררת שונות במורפולוגיה של מבוגרים במהלך ההתפתחות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעל ידי ניתוח והרכבה שטוחה של השלד המסועף, ניתן לדמיין מגוון תכונות טרופיות שלא ניתן לחקור בהרכבה שלמה. כהכנה, סקור את המורפולוגיה הרלוונטית של שלד הראש של שלושת עמודי השדרה. לאחר הכנת הדג לדיסקציה, התחל בהחדרת מלקחיים חדים מספר חמש לצד העין, בזווית של 45 מעלות כדי לנקב את הקרום המכסה את העין.
לאחר מכן, קלפו את קרום העין, כמו מכסה של מיכל יוגורט. לאחר מכן, הכנס מלקחיים פתוחים מאחורי העין, תפוס את עצב הראייה והסר את העין. היזהר להימנע מניקוב העין, אחרת היא תדלוף מלנין.
חזור על תהליך זה עם העין בצד הנגדי. לאחר מכן, הניחו את הלהב של מספריים קטנים מתחת לצד האחורי של דש האופרקל, וחתכו את הרקמה הרכה בגב מעל האופרקל, לכיוון ארובת העין. לאחר מכן חותכים את העצם הקדמית, שהיא הגב לארובת העין.
לאחר מכן, חותכים את העצם הפרספנואידית של קו האמצע, סביב מרכז ארובת העין. חזור על חיתוך האופרקל בצד הנגדי. לשלבים הבאים, עמוד השדרה של האגן יכול לשמש כידיות.
הם מתקפלים החוצה, על ידי משיכתם בעדינות ישירות מהגוף. כעת, הכניסו את המלקחיים מתחת לאופרקל, וקילפו לאט את הפנים מהגוף. חיתוך כל רקמה רכה שעדיין מחוברת בתהליך.
היזהר סביב מגרפות הזימים, והקפד לא להפריע להן. קל לתפוס בטעות את העצם הצרטו-ענפית הראשונה, יחד עם הפרקול בעת הסרת שלד הפנים. הסתכל מתחת לפרקול שלהם כשאתה מקלף אותו קדימה כדי להיות בטוח שאין לך אחיזה בשום דבר נוסף.
כעת, בעזרת מלקחיים, נתק את הצרטוהילים משני צידי קו הבסיס האמצעי, תוך קילוף והסרת שלד הפנים הגולגולתי הקדמי. חזור על הצד הנגדי. שלד הפנים הגולגולתי הקדמי כולל את כל הלסת, את כל שלד ההיואיד, את האלמנטים הגביים והאנדוכונדריאלים הבסיסיים ואת החלק הקדמי של הגולגולת.
לאחר מכן, הכנס מלקחיים סגורים ממש מתחת לצינור המעיים, וגרור אותם קדימה. לפרק את השרירים והרצועות הנותרים המחוברים לשלד הענף בתהליך. לאחר מכן, השתמשו בקצה המלקחיים הסגורים כדי לגרד את השרירים שמחברים את השלד הענפי הגבי למארז המוח הגחוני.
מגרדים בתנועה אחורית לקדמית. חזור על תהליך הסרת השרירים בצד הנגדי של הסטיקלבק. לאחר מכן, הסר את השלד הענפי, על ידי אחיזה בבסיס צינור המעי ומשיכה קדמית.
הפרד את צינור המעי באמצעות חתך מאונך, אחורי לצרטו-ענף החמישי. טעות נפוצה היא לתפוס את צינור המעי קדמי מדי, מה שמשאיר את הצינור הקדמי הגחוני הרחק מאחור. הקפד לתפוס עמוק בחלק האחורי של חלל בית החזה ותמיד תוכל להסיר את צינור המעי העודף מאוחר יותר.
לאחר הסרת כל שברי העצם שנותרו מהמוח מקרה בצד הגבי של השלד הענפי. הכנס מספריים לסל הענף, ובצע חתך גבי בין הסטים הדו-צדדיים של לוחות השיניים הגביים. שמור את החיתוך הזה במרכז כדי למנוע נזק ללוחיות השן הגביות.
לאחר מכן, בצע שני חתכים רוחביים רדודים בלומן המעי הגומי בקצה האחורי של השלד המסועף. בקצה האנטי-ארורי של צינור המעי. כדי לסייע בפתיחת השלד המסועף.
כעת, העבירו את השלד לתוך צינור מיקרו-סנטריפוגה עמוס ב-50 אחוז גליצרול, אפס נקודה שתיים וחמישה אחוז אשלגן הידרוקסיד לניקוי עדין. או במקום זאת, העבירו אותו לגליצרול טהור אם אין צורך בניקוי נוסף. אם יש צורך בצביעה מחדש, הפרטים ניתנים בפרוטוקול הטקסט.
כדי להתכונן להרכבה, החלף את התמיסה לגליצרול טהור ונער את הצינור למשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, הסר את השלד המסועף והנח אותו ליד החלק התחתון של החלקת כיסוי זכוכית בגודל 22 על 60 מילימטר כשהצד הגבי כלפי מעלה. כעת, העבירו כמה טיפות גליצרול על השלד.
לאחר מכן, גלגלו שני כדורים קטנים של חימר דוגמנות, ושחקו אחד משני קצוות החלקת הכיסוי, הם מתפקדים כמרווחים. לאחר מכן, הנח באופן רופף החלקת כיסוי שנייה מעל התכשיר, עם מספיק לחץ כדי לשטח את השלד הענפי הקדמי. כעת, קלף את דש הגב השמאלי, כולל לוחות השיניים הגביות, והחלק את הדש בין החלקות הכיסוי.
לאחר מכן עשה את אותו הדבר עם דש הגב הימני. ודחף את כל השלד הענפי הרחק מקצה החלקת הכיסוי. להשלמת ההליך, לחץ קלות על החלקת הכיסוי העליונה כדי לשטח את כדורי החימר.
מספיק כדי שהם ישמרו על השלד הענפי רכוב שטוח. אבל, לא עד כדי כך שהוא נמחץ. אם במהלך התהליך, שורת מגרפות מוסתרת, החלק את המלקחיים בין הכיסויים וכיוון מחדש את הצרטו-ענף או את התכשיר כולו.
כאשר הוא מותקן שטוח בגליצרול טהור, ניתן לאחסן את התכשיר שטוח בטמפרטורת החדר למשך עשור לפחות. פרוטוקול זה מביא לשלד ענף מנותח ומורכב שטוח. שם ניתן לתעד מגוון תכונות טרופיות חשובות.
ממבט גבי, ניתן לדמיין בקלות את כל שורות מגרפות הזימים, את כל לוחות השיניים של הלוע וכמעט את כל עצמות הענפים. אדום אליזרין S, גם פלורז על רודמין או מסנן אדום דומה, המאפשר תיוג כפול עם סמנים אחרים ושיטות חלופיות להדמיה. בתמונה זו, מגרפות זימים מסומנות בקראט.
השיניים מסומנות בראשי חצים, והעצמות מסומנות בכוכביות. לאחר שליטה, ניתן לבצע את הנתיחה תוך מספר דקות ולהתבצע במאות בעלי חיים במהירות יחסית. ולמרות שהדגמנו דיסקציה של שלד ענפי סטיקלבק, אנו מקווים שהליך זה יוכל לשמש כמדריך למגוון מיני דגים.
על ידי ניתוח השלד המסועף, אנו יכולים לדמיין במהירות ובקלות מגוון תכונות טרופיות חשובות, שאינן נראות בהר שלם. מאפשר הבנה טובה יותר של ההתפתחות וההתפתחות של שלד הפנים הגולגולתי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח והרכבה שטוחה של השלד הסניפי של דגי הנריף, היבט קריטי בעיבוד המזון בדגים. השיטה חלה על מיני דגים שונים ומסייעת להבנת הביולוגיה ההתפתחותית והאבולוציונית.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה אבולוציונית
רקע
- השלד הסניפי כולל קשקושים, שיניים לועיות ועצמות סניפיות.
- הוא משמש כאתר העיקרי לעיבוד מזון ברוב הדגים.
- הבנת מבנה זה יכולה לספק תובנות על התאמה והשונות המורפולוגית של בעלי חיים.
- סקירת מורפולוגיה של השלד הראשון חיונית לפני הניתוח.
מטרת המחקר
- לנתח ולהציב בהרכבה שטוחה את השלד הסניפי של דגי הנריף.
- להמחיש תכונות טרופיות שאינן נצפות בהכנות הרכבה מלאה.
- לחקור שאלות מפתח בהתפתחות, גנטיקה ואבולוציה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת הדג לניתוח.
- החדרת פורצפס חדים כדי לנקב את הממברנה המכסה את העין.
- ניתוח השלד הסניפי.
- הרכבה שטוחה של השלד המנותח להמחשה.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת הדמיה מפורטת של השלד הסניפי.
- היא מאפשרת את המחקר של תכונות טרופיות בדגים.
- מספקת שיטה חלה על מיני דגים שונים.
- משפרת את ההבנה של תהליכים התפתחותיים ואבולוציוניים.
מסקנות
- שיטת הניתוח וההרכבה השטוחה יעילה לחקר השלד הסניפי.
- גישה זו יכולה לעזור לענות על שאלות ביולוגיות משמעותיות.
- היא תורמת להבנה הרחבה יותר של מורפולוגיה והתאמה של דגים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise morphological analysis of the branchial skeleton, a key determinant of feeding efficiency and dietary adaptation in fish. By allowing quantification of trophic traits such as gill raker number and pharyngeal tooth density, it supports target validation in studies of evolutionary developmental biology. The method provides a scalable, reproducible system for linking genotype to phenotype in vertebrate craniofacial patterning.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic variants affecting craniofacial morphology through quantitative trait analysis.
- Operational Value: Provides a standardized, high-throughput compatible dissection workflow for phenotypic screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, two-dimensional preparations suitable for imaging-based assay readouts.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through consistent flat-mount morphology and glycerol-based clearing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing developmental changes in skeletal patterning relevant to human congenital disorders.
- Operational Value: Enables cross-species applicability, enhancing translational continuity in vertebrate model systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening of genetic mutants or natural variants requires detailed anatomical readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking genomic variation to measurable skeletal phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative morphological outputs essential for assay development.
- Analytics: Enables measurement of trait distributions such as bone length and tooth number for statistical comparison.
- Translational Research: Connects fish craniofacial evolution to conserved developmental pathways in higher vertebrates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for skeletal phenotyping across diverse fish species and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genotype-phenotype maps by reducing observational ambiguity in complex 3D structures.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissection and mounting steps applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing clear, quantifiable phenotypic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic loci based on effect size and penetrance of craniofacial traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vertebrate anatomy and microsurgical dissection techniques.
- Dependent on fine forceps, micro-scissors, and glycerol-based clearing solutions.
- Necessitates standardized training to ensure consistent flat-mount quality and avoid tissue damage.
- Adaptation to larger or more heavily mineralized fish may require adjusted clearing times or enzymatic treatments.
- Practical limitations include potential obscuration of posterior elements if mounting pressure is uneven.
