Name: הערכת Myofilament Ca 2 + עירור-התכווצות לב ביסוד רגישה זיווגים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: למדו להעריך רגישות סידן במיופילמנטים בקרדיומיוציטים מבודדים מלב אוגרים. פרוטוקול זה משלב מדידות התכווצות סרקומרים ורמות סידן תוך-תאיות באמצעות Fura-2 AM לניתוח מקיף של קישור עירור-התכווצות לביתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי תוכנית המחקר למדע בסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (2013068067); על ידי התכנית הבוגרת 21 מוח קוריאה של משרד קוריאני חינוך, מדע והטכנולוגיה, אונ&#39; הלאומית בסיאול החולה, האגודה הקוריאנית של יתר לחץ דם (2013), קרן מחקר SK טלקום (לא. 3420130290) ומן הקרן הלאומית למדע הטבעי של סין (NSFC 31,460,265; NSFC 81,260,035).

הפרוטוקול הוא בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים האו&quot;ם הבריאות (פרסום NIH מס 85-23, מתוקנת 1996). זה אושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית בסיאול (אישור IACUC לא .: SNU-101,213-1). הכנת הצפה 1. (חומרי שולחן וציוד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 300 מ&quot;ל של פתרון בידוד טריים ביום של הניסוי (מ&quot;מ: NaCl, 135; KCl, 5.4; 2 MgCl, 3.5; גלוקוז, 5; HEPES, 5; Na 2 4 HPO, 0.4; טאורין, 20; pH 7.4 עם NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ&quot;ל של פתרון אחסון טריים ביום של הניסוי (מ&quot;מ: 120 NaCl; KCl 5.4; MgSO 4 5; CaCl 2 0.2; נתרן-פירובט 5; גלוקוז 5.5; טאורין 20; HEPES 10; מניטול 29; pH 7.4 עם NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של פתרון זלוף (מ&quot;מ: NaCl, 141.4; KCl, 4; לאא 2 4 PO, 0.33; MGCl 2, 1; HEPES, 10; גלוקוז, 5.5; 2 CaCl, 1.8; מניטול, 14.5; pH 7.4 עם NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 30 מ&quot;ל של תמיסת collagenase 1 על ידי הוספת collagenase (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), פרוטאז (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), אלבומין בסרום שור (BSA, 1.67mg / מ&quot;ל), ו Ca 2 + (0.05 מ&quot;מ) עד 25 מ&quot;ל של בידוד פִּתָרוֹן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20 מ&quot;ל של תמיסת collagenase 2 על ידי הוספת collagenase (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), ארגון ה- BSA (1.67 מ&quot;ג / מ&quot;ל), ו Ca 2 + (0.05 מ&quot;מ) 16.7 מ&quot;ל של פתרון בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מ&quot;ל של תמיסת BSA על ידי הוספת 0.4 גרם של BSA 40 מ&quot;ל של פתרון בידוד. הפרד 10 מ&quot;ל ו -30 מ&quot;ל לשתי כוסות. הוספת Ca 2 + 30 מ&quot;ל של תמיסת BSA כך הריכוז הסופי Ca 2 + בתמיסה BSA הוא 1 מ&quot;מ. </li></ol> 2. הכנה עבור הבידוד של החדר השמאלי (LV) myocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר 8-12 בן שבוע, ספראג-Dawley זכר (SD) חולדות בכלובי תחבורה נקיות ממתקן החיה לחדר ההכנה ובידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hלאכול שתי אמבטיות מים ל -37 מעלות צלסיוס הערה: השתמש באמבט מים אחד על המים - המאגר במקטורן ואת צינורות טפטוף של מערכת זלוף Langendorff. השתמש באמבט מים אחרים כדי להתסיס גזעי רקמת שריר הלב על מנת להפריד myocytes יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל ו 3.3 מ&quot;ל של תמיסת BSA (ללא Ca 2 +) ל -25 מ&quot;ל של collagenase פתרון 1 פתרון collagenase 16.7 מ&quot;ל 2 לפצות את נפח 30 מ&quot;ל ו 20 מ&quot;ל, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון הבידוד (100 מ&quot;ל) ו collagenase פתרון 1 (30 מ&quot;ל) לעמודה 1 (אל&quot;מ 1) ועמודה 2 (אל&quot;מ 2) במערכת זלוף Langendorff, בהתאמה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמצן פתרון הבידוד collagenase פתרון 1 אל&quot;מ 1 ו Col.2 דרך צינור חיבור חמצן במערכת זלוף Langendorff (איור 1 א). בדומה לכך, פתרון collagenase oxygenate 2 והפתרון BSA באמבט מים רועד 100% O 2 דרךצינור חיבור חמצן. </li></ol> 3. בידוד של LV myocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה SD באמצעות זריקה intraperitoneal של נתרן pentobarbital (30 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ולאשר את מצב הרדמה על ידי הבוהן צובט וחוסר השתקפות הנסיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את החולדה מגש לנתיחה. במצב שכיבה, לאבטח את ארבע רגליו אל צידי הגוף עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל חתכים-ציריים באמצע חזה עם מספרי כירורגיות כדי לפתוח את החזה, הבטחה שלא לפגוע בלב. השתמש עוד זוג מספרי נקי לנתח את הלב מכלי החיבור (למשל, הווריד נבוב עליון ונחות, כלי ריאתי, ואב עורקים) ואת קרום קרום לב 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו חלק של אבי העורקים של אורך מספיק (5 - 8 מ&quot;מ), מהדק את אבי העורקים עם מלקחיים בסדר, במהירות הר צינורית של מערכת זלוף Langendorff בתוך דקות 1 (איור 1 א). לקשור תפר חוט 4/0 בחוזקה על אבי העורקים. </li><li&gt; הפעל את שסתום על אל&quot;מ 1 ו perfuse בלב מבודד עם פתרון בידוד מראש התחמם מחומצן במשך 10 דקות (שיעור זלוף: 12-14 מ&quot;ל / דקה). כבה את השסתום על אל&quot;מ 1, להפעיל את השסתום על אל&quot;מ 2 ו perfuse את הלב עם פתרון collagenase 1 עבור 8 - 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרדת בלב מתעכל על ידי חיתוך אבי העורקים ולהעביר אותו על ידי לחיצה על אבי העורקים עם מלקחיים לתוך הבקבוק המכיל פתרון בידוד טריים (איור 1Bi). השתמש במספריים בסדר מלקחיים לחתוך את רוב הקיר בחינם LV (כולל מחצה) לחתיכות קטנות יותר (~ 22 מ&quot;מ, איור 1Bii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות לתוך בקבוק המכיל תמיסת collagenase טרי מראש התחמם מחומצן 2 (איור 1Biii). Shake למשך 10 דקות. שמור אספקת חמצן פתרון collagenase המכיל myocyte 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את myocyte - ההשעיה לצינור 10 מ&quot;ל צנטריפוגות באמצעות טפטפות עם נורת שאיבה ולהוסיף Ca 2 + - המכיל פתרון BSA (1: 1 בנפח). צנטריפוגה ב 30 גרם במשך 2 דקות וזורקים supernatant. Re- להשעות גלולה myocyte ב 5 מ&quot;ל של תמיסת BSA. צנטריפוגה וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר את כדורי myocyte ולשמור מיוציטים ב 10 מ&quot;ל של פתרון האחסון מראש מחומצן ב RT (איור 1Biv-vi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על נהלים (שלבים 3.7 - 3.9) עם רקמות LV שנותרו בבקבוק. הערה: המשך לחזור ההליכים (שלבים 3.7 - 3.9) שוב עד שרוב רקמות LV נעלמת להשיג תשואה טובה של מיוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את מיוציטים בתמיסה אחסון במשך 6-8 שעות ב RT עד תום הניסויים. </li></ol> 4. מדידות סימולטני של הארעית 2+ Ca התאי Myocyte התכווצות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיוציטים LV טען עם אסתר acetoxymethyl פורעה -2 AM (2 מיקרומטר). הערה: בצע את כל נהלי העמסת ניסויים עם מיוציטים טעונים בתוך שפופרת כהה (האיור 1Bvii). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> centrifuge ההשעיה myocyte (1 מ&quot;ל) XG ב 2000 במשך 10 שניות. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה myocyte ב 1 מ&quot;ל של תמיסת Tyrode עם ריכוז נמוך Ca 2 + (250 מיקרומטר, לוח חומרים וציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פורעה-02:00 ו poloxamer 407 (2 μl), בעדינות לפיזור ההשעיה myocyte, ולשמור את התערובת ב RT (20 - 24 מעלות צלסיוס) במשך 15 דקות (איור 1Bvii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת במשך 5 שניות, לבטל את supernatant לפזר את גלולה myocyte ב 1 מ&quot;ל של תמיסת זלוף המכיל 500 מיקרומטר Ca 2 +. לאחר 10 דקות, צנטריפוגה את התערובת במשך 5 שניות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון זלוף טריים (500 מיקרומטר Ca 2 +, 1 מ&quot;ל) ולשמור את פורעה-02:00 - גלולה myocyte טעון בפתרון זה עבור הקלטות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה של התכווצות myocyte LV ו- CA התאי 2+ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההקלטה, למלא את הצינור זלוף שיוצא דרךז&#39;קט מים עם פתרון Tyrode, שהוא מחומם מראש ל 36 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה טיפות של AM 2 פורעה - השעיה myocyte LV טעון על החדר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה במשך 5 - דקות 8. לאט perfuse הפתרון Tyrode (2.2 mL / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &quot;התחל&quot; על הפנל הקדמי של הממריץ הדיגיטלי להתחיל גירוי שדה (2 הרץ). הערה: מתח המוצא (10 V, 5 msec משך) מוחלים על מיוציטים בתא באמצעות חוטי פלטינה ממוקמים משני צדי האולם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיוציטים בוחר שחוזה ביציבות (לא אלה מוצגים פיגמנטציית-יתר או התכווצות היפו) להקלטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את myocyte של בחירה במצב האופקי של מערכת זיהוי מבוסס וידאו sarcomere ולהתאים את הפוקוס של המיקרוסקופ כדי להשיג תמונות אופטימליות של סרקומר. מקם את הקופסה המלבנית הסגולה על האזור שבו סרקומר ברור הם נצפו בבירור עד לממוצעבאורכי sarcomere (שיא אדום) מציג פסגה חדה יחידה (איור 2 א, תמונה תחתונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את השינויים באורך sarcomere בתגובה לגירוי שדה (איור 2 א &#39;וב&#39;). הערה: השתמש מיוציטים טעונים בתוך 1 - 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הצמצם של המצלמה כך שהשדה במערכת זיהוי sarcomere וידאו מבוסס הוא בגודל של (איור 2 א) myocyte. לעורר את myocyte עם עירור ב 360 ננומטר / 380 ננומטר פליטה ב 510 ננומטר (תדירות הרכישה 1,000 הרץ). קיצור sarcomere שיא ויחס AM Fura2 עם גירוי שדה (תרשים 2B). </li></ol></li></ol> 5. הערכת רגישות 2+ Myofilament Ca <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע אורכי sarcomere ו Ca 2 + ארעי ב יציב (10 - 20 עקבות) ואת עלילת לולאת שלב המטוס של יחס פורעה-2 לעומת אורך sarcomere מאותו myocyte (שניהם עם ערך נמדדשינויים של ודלתה; איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל עלילה, להגדיר יחס -2 פורעה ב -50 הרפיה% (50 EC, איור 2C). השוואת שתי הלולאה ו- EC 50 של כל התערבות. </li></ol>

<ol><li>Bers, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Eisner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+calcium+cycling+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle.</a> Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).</li>
<li>Palmiter, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+regulating+the+myofilament+response+to+Ca2%2B%3A+implications+of+mutations+causal+for+familial+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy.</a> Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).</li>
<li>Missiaen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+intracellular+Ca2%2B+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease.</a> Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).</li>
<li>Trafford, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).</li>
<li>Berlin, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+cytosolic+calcium+buffering+properties+of+single+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes.</a> Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).</li>
<li>Robertson, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+time-course+of+Ca2%2B+exchange+with+calmodulin%2C+troponin%2C+parvalbumin%2C+and+myosin+in+response+to+transient+increases+in+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+.</a> Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).</li>
<li>Schober, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofilament+Ca2%2B+sensitization+increases+cytosolic+Ca2%2B+binding+affinity%2C+alters+intracellular+Ca2%2B+homeostasis%2C+and+causes+pause-dependent+Ca2%2B-triggered+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia.</a> Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).</li>
<li>Briston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+changes+in+Ca+buffering+by+SERCA+and+troponin+contribute+to+Ca+handling+during+%CE%B2-adrenergic+stimulation+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes.</a> Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).</li>
<li>Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+control+of+cardiac+myofilament+response+to+calcium+by+S-glutathionylation+at+specific+sites+of+myosin+binding+protein+C%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C.</a> Front Physiol. 4, 336(2013).</li>
<li>Jin, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofilament+Ca2%2B+desensitization+mediates+positive+lusitropic+effect+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+in+left+ventricular+myocytes+from+murine+hypertensive+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+L-type+Ca2%2B+channel+activity+by+neuronal+nitric+oxide+synthase+and+myofilament+Ca2%2B+sensitivity+in+cardiac+myocytes+from+hypertensive+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat.</a> Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Spurgeon, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+calcium+and+myofilaments+in+single+rat+cardiac+myocytes+achieve+a+dynamic+equilibrium+during+twitch+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation.</a> J Physiol. 447, 83-102 (1992).</li>
<li>Preston, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+effects+of+the+DCM+mutant+Gly159Asp+troponin+C+in+skinned+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres.</a> Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).</li>
<li>Willott, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Troponin+that+cause+HCM%2C+DCM+AND+RCM%3A+what+can+we+learn+about+thin+filament+function%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function?</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).</li>
<li>Yasuda, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+study+contraction+characteristics+of+a+single+cardiac+myocyte+using+carbon+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).</li>
<li>Sears, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neuronal+nitric+oxide+synthase+isoform+regulates+myocardial+contraction+and+calcium+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling.</a> Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).</li>
<li>Ashley, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+nitric+oxide+synthase+1+regulates+basal+and+beta-adrenergic+contractility+in+murine+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes.</a> Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).</li>
<li>Zhang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+phospholamban+phosphorylation+is+associated+with+impaired+relaxation+in+left+ventricular+myocytes+from+neuronal+NO+synthase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice.</a> Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Grynkiewicz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים כדי להעריך את השינויים של רגישות 2+ myofilament Ca ב myocyte הלב יחיד מבודד ולהדגיש את החשיבות של מדידת פרמטר זה לצד תכונות אלקטרו, הארעיים Ca 2 + תאיים, ודינמיקה myofilament. הסיבה לכך היא כי ההקלטות של אחד או שניים מהפרמטרים לא יכולות להסביר את מנגנוני התכווצות לב ורגיעה. בניגוד לשיטות קונבנציונליות המודדים התכווצות myocyte ופרופיל Ca 2 + תאי בנפרד 1, השיטה הנוכחית בוחנת גם פרמטרים במקביל באותו myocytes <s...

צימוד עירור-התכווצות הלב (EC) הוא ערכת היסוד לניתוח תכונות מכניות של שריר הלב, כלומר, הפונקציה התכווצות של הלב 1,2. צימוד EC הוא שיזם שלילת קוטביות הממברנה משנית לפעילות של תעלות יונים sarcolemmal (למשל, ערוץ Na + מתח מגודרת, אשר ניתן למדוד באמצעות טכניקות תיקון- clamp). ההפעלה הבאה של זרם מתח מגודר L- סוג Ca 2 + ערוצים (LTCCs) ו Ca 2 + דרך LTCCs לעורר את חלק הארי של Ca 2 + שחרור דרך קולטני ryanodine (RyRs), גברת ריכוז cytosolic Ca 2 + מ nanomolar (ננומטר ) כדי מיקרו ברמה (מיקרומטר). כגון עלייה Ca cytosolic 2+ מקדמת Ca 2 + מחייבת טרופונין C (TNC) ב חוטים דקים מעוררת שינויים מרחביים של מתחם הנימה כדי להקל על האינטראקציה תקטין שרירן ומשיגה myocardi<html> אל התכווצות 3. מנגד, cytosolic Ca 2 + מחדש uptaken בחזרה הרטיקולום sarcoplasmic (SR) דרך Ca 2 + -ATPase ב SR (SERCA2a) או הנמתח מן myocyte באמצעות מחליפי Na + / Ca 2 + ואת plasmalemmal Ca 2 + ATPase 1,2. כתוצאה מכך, הירידה Ca cytosolic 2+ instigates שינויים מרחביים של חוטים דקים חזרה למצב המקורי, וכתוצאה מכך ניתוק של אקטין שרירן myocyte הרפיה 1-3. לפי שיטה זו, את הפעילות של SERCA2a נחשבת בדרך כלל כדי לקבוע את המהירות של הרפיה שריר הלב כי זה חשבונות עבור 70 - 90% של הסרת cytosolic Ca 2 + ברוב תאי לב יונקים 1. ככזה, טיפול Ca 2+ נורמלי ידי LTCC, RyR ו SERCA2a, וכו &#39;כבר נחשב המנגנונים העיקריים עבור התכווצות לקויה ורוגע בלב החולה 1-4. &gt; במציאות, חינם cytosolic Ca 2 + שמתפקד השליח בחשבונות צימוד EC כ 1% בסך הכל Ca תאיים 2+ ואת רוב Ca 2 + מאוגד מאגרים תאיים Ca 2 + 5,6. זאת בשל העובדה כי מאגרים שונים Ca 2+ נמצאים בשפע myocytes לב, למשל, פוספוליפידים בממברנה, ATP, phosphocreatine, calmodulin, parvalbumin, myofibril TNC, שרירן, SERCA2a, ו calsequestrin ב SR. 5,6,7. ביניהם, SERCA2a ו TNC הם מאגרי Ca 2+ השולט 5,6,7. יתר על כן, Ca 2 + מחייב המאגרים שלה הוא תהליך דינמי במהלך עווית (למשל, 30-50% של Ca 2 + נקשרו TNC ו לנתק ממנו במהלך Ca 2 + ארעיים 7) ושינוי Ca 2 + מחייב גורם נוסף &quot;לשחרר&quot; של חינם Ca 2 + אל cytosol, תוצאות בהתאמות של Ca התאי 2+ קונצרט כלשהוentration. כתוצאה מכך, הפרעות של רמת תאיים Ca 2 + גורמות תנועות myofilament חריגות, אשר הן המבשרים של חוסר תפקוד התכווצות והפרעות קצב 8,9. גורמים רבים (הן פיזיולוגיים ופתולוגיים) יכול להיות מקורות שינויים שלאחר תעתיק של חלבונים myofilament, המשפיעים חציצה myofilament Ca 2+ myofilament רגישות Ca 2 + 8-10. לאחרונה, דווח כי מוטציות בחלבוני myofilament להגדיל את Ca 2 + זיקה מחייבת וטיפול תאיים Ca 2 +, מפעיל הגברה תלוית הפסקה של Ca 2 + ארעי, חריגת Ca 2 + שחרור, הפרעות קצב 8. עולים בקנה אחד עם המושג הזה, אנחנו גם הראינו כי הפחתת רגישות myofilament Ca 2+ בלבבות חולדה עם יתר לחץ דם משתי לרגולציה-אפ של synthase תחמוצת חנקן העצבית קשורות הדיאסטולי מוגבה סיסטולי Ca 2 + רמות11, אשר בתורו, מגביר את הפגיעות של LTCC כדי האיון התלוי 2+ Ca 12. לפיכך, רגישות 2+ myofilament Ca הוא רגולטור &quot;פעיל&quot; של פונקצית התכווצות הומאוסטזיס תאית Ca 2 + ו myocyte. זה הפך להיות צורך לנתח אינטראקציות בין myofilament ו Ca 2 + טיפול חלבונים לחקירה יסודית של צימוד myocyte EC ותפקוד הלב. כאן אנו מתארים פרוטוקול מעריך את השינויים של רגישות 2+ myofilament Ca ב myocytes לב מבודד. ניתוח מקיף של פרופיל תאיים Ca 2 +, Ca 2 + myofilament רגישות וההתכווצות לחפור מנגנוני רומן מכניקת שריר לב בסיסית.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley חולדה</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 שבועות</td></tr><tr><td>פנטוברביטל נתרן</td><td>Hanlim Pharmaceutical (קוריאה)</td> <td>AHN901</td><td>קוד ביטוח: 645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td></td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>מניטול</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין עוברי בקר</td><td>סיגמא</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 2</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאז</td><td>סיגמא</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td> <td>בדיקות מולקולריות</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>פלורוניק F127 תמיסה 20% ב-DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים רועדים</td><td>צ'אנג שין דגם מדעי</td><td>: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td>רכישה וניתוח של נתוני צימוד EC במיוציטים</td></tr><tr><td>מיוציטים סידן & מערכת הקלטת התכווצות</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים במחזור</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיוציטים</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצנטי & זיהוי וידאו</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצנטי & ממשק מערכת</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>עירור מקור אור</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>מנורת ARC בעוצמה גבוהה ספק כוח</td><td>Cairn Reseach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקר גלגל</td><td>מסנן IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>ממריץ דיגיטלי</td><td>מערכות רפואיות Corpart</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>קומפוזיציות של פתרונות ניסיוניים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</strong</td><td>>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ריכוז (mmol) 135</td></tr><tr><td>ריכוז KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>(ממול) 5.4</td></tr><tr><td>ריכוז HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>(ממול) 5</td></tr><tr><td>ריכוז גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270</td><td>(ממול) 5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>ריכוז (ממול) 3.5</td></tr><tr><td>ריכוז CB2742654 טאורין</td><td>סיגמא</td><td></td><td>(ממול) 20</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </תת></td><td>סיגמא</td><td>71649</td><td>ריכוז (ממול) 0.4</td></tr><tr><td>תמיסת אחסון (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ריכוז (ממול) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>סיגמא</td><td>P4504</td><td>ריכוז (ממול) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>ריכוז (ממול) 10</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270</td><td>ריכוז (ממול) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>ריכוז (מול) 0.2</td></tr><tr><td>מניטול</td><td>סיגמא</td><td>M4125</td><td>ריכוז (ממול) 29</td></tr><tr><td>מ"ג<תת>4</תת></td><td>סיגמא</td><td>M5921</td><td>ריכוז (ממול) 5</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא</td><td>P2256</td><td>ריכוז (ממול) 5</td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא</td><td></td><td>ריכוז CB2742654 (mmol) 20</td></tr><tr><td>תמיסת זלוף (תמיסת Tyrode, pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ריכוז (mmol) 141.4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>ריכוז (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>ריכוז (mmol) 0.33</td></tr><tr><td>ריכוז HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>(ממול) 10</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270</td><td>ריכוז (ממול) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>ריכוז (מילימול) 1.8&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; עבור העמסת Fura 2AM, ריכוזי CaCl2 הם 0.25 מ"מ ו-0.5 מ"מ</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>ריכוז (mmol) 1</td></tr><tr><td>ריכוז מניטול</td><td>סיגמא</td><td>M4125</td><td>(mmol) 14.5</td></tr><tr><td>תמיסת קולנגנאז 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת בידוד (30 מ"ל)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אלבומין עוברי בקר (תמיסת BSA 5 מ"ל)</td><td></td><td></td><td>ריכוז (מול) 1.67 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 2</td><td>ריכוז LS004177 וורת'ינגטון</td><td></td><td>(מול) 1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>ריכוז פרוטאז</td><td>סיגמא</td><td>P6911</td><td>(ממול) 0.1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>ריכוז (ממול) 0.05 מ"מ</td></tr><tr><td>תמיסת קולנגנאז 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת בידוד ( 20 מ"ל)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אלבומין עוברי בקר (תמיסת BSA 3.3 מ"ל)</td><td></td><td></td> <td>ריכוז (מ"ל) 1.67 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 2</td><td>ריכוז LS004177 וורת'ינגטון</td><td></td><td>(מילי) 1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>CaCl<תת>2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>ריכוז (מ"מ) 0.05 מ"מ</td></tr><tr><td>תמיסת בידוד תמיסת</td><td></td><td></td><td></td>BSA</tr><tr><td>( 40 מ"ל)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ריכוז אלבומין עוברי בקר</td><td>סיגמא</td><td>A7906</td><td>(ממול) 400 מ"ג</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>ריכוז (מול) 1 מ"מ</td></tr></tbody></table>

הערכת myofilament ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; עירור-התכווצות לב ביסוד רגישה זיווגים

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

אי ספיקת לב והפרעות קצב הלב הם הגורמים המובילים לתמותה ותחלואה בעולם. עם זאת, המנגנון של מחלה ו תקלת שריר לב בלב החולה נשאר להתברר במלואה. ראיות משכנעות אחרונות מוכיחות כי שינויים ברגישות 2+ myofilament Ca להשפיע Ca התאי 2+ פעילויות הומאוסטזיס יון ערוץ myocytes הלב, המנגנונים החיוניים אחראים פוטנציאל הפעולה של הלב והתכווצות בלבבות בריאים וחולים. ואכן, פעילויות של תעלות יונים מובילי שבבסיס פוטנציאל פעולת לב (למשל, Na +, Ca 2 + ו K + ערוצים מחליפים Na + -Ca 2+) ו- CA תאי 2+ טיפול חלבונים (למשל., קולטנים ryanodine ו- CA 2+ -ATPase ב הרטיקולום sarcoplasmic (SERCA2a) או phospholamban ו זירחון שלה) נמדדים כמקובל כדי evaluאכול את המנגנונים הבסיסיים של התכווצות עירור לב (EC) צימוד. שני פעילויות חשמל בקרום והשינויים 2+ Ca התאיים הן אותות ההדק של צימוד EC, ואילו myofilament היא היחידה התפקודית של התכווצות והרפיה, ו myofilament Ca רגיש 2+ הכרחית ביישום ביצועי myofibril. אף על פי כן, כמה מחקרים לשלב myofilament רגישות Ca 2 + לתוך האנליזה הפונקציונלית של שריר הלב, אלא אם כן הוא המוקד של המחקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול המודד קיצור sarcomere / מחדש התארכות ורמת תאיים Ca 2 + באמצעות פורעה -2 AM (זיהוי ratiometric) ולהעריך את השינויים של רגישות 2+ myofilament Ca ב myocytes לב מלבבות חולדה. המטרה העיקרית היא להדגיש myofilament שרגישות 2+ Ca צריכה להילקח בחשבון צימוד EC לניתוח מכניסטית. חקירה מקיפה של iבערוצים, מובילי יון, טיפול Ca 2 + תאיים, ורגישות 2+ myofilament Ca העומדים בבסיס התכווצות myocyte בלבבות בריאים וחולים יספק מידע רב ערך לתכנון אסטרטגיות יעילות יותר של translational ואת הערך טיפולי.

מיוציטים LV מבודדים לבבות עכברוש נורמלי יתר לחץ דם. רוד בצורה מיוציטים עם פסים ברורים (מייצג סרקומר) ואת צירים יציבים בתגובה לגירוי שדה נחשבים להיות מיוציטים האופטימלי ונבחרים להקלטות (איור 2 א). בדוגמה המוצגת F igure 2A, פורעה 2 לפני הצהריים -loaded myocyte LV ממוצבת בצורה אופקית ואת הצמצם של המצלמה מותאמת כך myocyte תופסת את רוב בתחום ההקלטה ואזור רקע מינימלי כלול. בתחום ההקלטה, להתאים את ממדי המלבן הסגול ידי לחי...

מאמר זה מתאר פרוטוקול המעריך את השינויים ברגישות לשריר Ca2+ במהלך התכווצות במיוציטים לבביים מבודדים מלב חולדה. יחד עם אלקטרופיזיולוגיה של הלב, רמות ציטוזול סיסטולי/דיאסטולי Ca2+ והתכווצות/הרפיה, מדידה זו הכרחית בבסיס המנגנונים המתווכים צימוד עירור-התכווצות לב בלב בריא וחולה.

הערכת Myofilament Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; עירור-התכווצות לב ביסוד רגישה זיווגים

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את הרגישות לסידן של המיופילמנטים, במטרה להעמיק את הבנתנו במנגנונים העומדים בבסיס ההתכווצות בלב בריא ובלב חולה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות הקשורות לגודש בלב ולאי-ספיקת לב. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבשילוב עם תעלות יונים, נשאי יונים וניהול סידן בין-תאי, היא מספקת הבנה מקיפה של המנגנון העומד בבסיס כושר ההתכווצות של לב עכבר במצב בריא ובמצבי מחלה של הלב.כדי להתחיל בהליך זה, חממו שני מקבטות מים ל-37 °C. הוסיפו 5 mL של תמיסת BSA נטולת סידן ל-25 mL של תמיסת קולגנאז 1, ו-3.3 mL של תמיסת BSA נטולת סידן ל-16.7 mL של תמיסת קולגנאז 2. לאחר מכן, הוסיפו 100 mL של תמיסת בידוד לעמודה 1 ו-30 mL של תמיסת קולגנאז 1 לעמודה 2 במערכת הפרפוזיה של Langendorff.חמצנ את תמיסת הבידוד ותמיסת הקולגנאז אחת בעמודה אחת ובעמודה שתיים באמצעות צינור חיבור החמצן במערכת הפרפוזיה של Langendorff. באופן דומה, חמצנ את תמיסת הקולגנאז שתיים ואת תמיסת ה-BSA במקלחית המטלטלת באמצעות 100% oxygen דרך צינור חיבור החמצן. בשלב זה, לאחר הרדמת חולדה מסוג SD באמצעות הזרקה תוך-peritoneal של pentobarbital sodium, ודא את מצב ההרדמה על ידי צביטה בבהו במטרה לוודא היעדר רפלקס נסיגה.לאחר מכן, העבירו את החולדה למגש ניתוח. כאשר החולדה במנח גב (supine), קבעו את ארבע הרגליים לדפנות הגוף באמצעות סרט דביק. לאחר מכן, תפסו את האורטה בעזרת פינצטה עדינה והחזיקו מיד את הקנולה של מערכת הפרפוזיה של Langendorff.לאחר מכן, קשרו את חוט התפר בחוזקה מעל האורטה. פתחו את השסתום בעמודה הראשונה ובצעו פרפוזיה ללב המבודד עם תמיסת בידוד מחוממת ומחומצנת למשך 10 דקות. לאחר מכן, פתחו את השסתום בעמודה השנייה ובצעו פרפוזיה ללב עם תמיסת קולגנאז מספר אחת למשך שמונה עד 10 דקות.לאחר מכן, הוצא את הלב שעבר עיכול על ידי חיתוך האורטה והעבר אותו לבקבוק המכיל תמיסת בידוד טרייה. באמצעות מספריים עדינים ופינצטה, חתוך את רוב הדופן החיצונית של ה-LV, כולל המחיצה, לחתיכות קטנות יותר. לאחר מכן, העבר את הרקמות לבקבוק המכיל תמיסת collagenase two טרייה, שחוממה מראש והועשרה בחמצן.לאחר מכן, נער אותם במשך 10 דקות ושמור על תמיסת הקולגנאז הכוללת את המיוציטים תחת חמצון. לאחר מכן, העבר את תרחיף המיוציטים לשפופרת צנטריפוגה של 10 מיליליטר והוסף תמיסת BSA הכוללת סידן. סבב בצנטריפוגה למשך שתי דקות.לאחר שתי דקות, השליכו את הנוזל העליון ותלו את משקע המיוציטים ב-5 milliliters של תמיסת BSA. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה והשליכו שוב את הנוזל העליון. לאחר מכן, פזרו את משקע המיוציטים ושמרו את המיוציטים ב-10 milliliters של תמיסת אחסון שעברה חמצון מוקדם בטמפרטורת החדר עד לסיום הניסוי.כעת, טענו את המיוציטים מהחדר השמאלי (LV) עם 2 µM של acetoxymethyl ester Fura-2AM. סובבו בצנטריפוגה 1 mL של תרחיף מיוציטים למשך 10 שניות. לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון ותלו את משקע המיוציטים מחדש ב-1 mL של תמיסת Tyrode בריכוז סידן נמוך.לאחר מכן, הוסיפו Fura-2AM ושני מיקרולטרים של poloxamer 407 לתאי השריר (myocytes). פזרו בעדינות את תרחיף תאי השריר והשאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, סבבו את התערובת בצנטריפוגה למשך חמש שניות.שפכו את הנוזל העליון ופזרו את משקע המיוציטים במיליליטר אחד של תמיסת פרפוזיה המכילה 500 micro-molar סידן. לאחר 10 דקות, סבבו את התערובת בצנטריפוגה למשך חמש שניות ושפכו את הנוזל העליון. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת פרפוזיה טרייה ושמרו את משקע המיוציטים הטעון ב-Fura-2AM בתמיסה זו לצורך ההקלטות.לפני ההקלטה, מלאו את צינור הפרפוזיה העובר דרך מעטפת מים בתמיסת Tyrode בטמפרטורה של 36 degree Celsius. לאחר מכן, טפטפו מספר טיפות של תרחיף מיוציטים של LV הטעונים ב-Fura-2AM על תאית של מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך והמתינו חמש עד שמונה דקות. בצעו פרפוזיה איטית של תמיסת ה-Tyrode בקצב של 2.2 milliliters per minute.לאחר מכן, לחצו על כפתור ההפעלה (start) בפנל הקדמי של הסטימולטור הדיגיטלי כדי להתחיל את הגירוי החשמלי בתדר של 2 Hz. בחרו את המיוציטים המתכווצים באופן יציב לצורך ההקלטה. מוצגים כאן העקומות הגולמיות של קיצור הסרקומר ומדידת יחס Fura-2 במיוציטים של חדר שמאלי (LV) מעכברים קבוצת ביקורת (sham) ומעכברים עם יתר לחץ דם.להלן העקבות הממוצעים של אורך הסרקומר ואותי ה-Fura-2. וכאן מוצגים תרשימי מישור הפאזה של יחס ה-Fura-2 לעומת אורך הסרקומר בשתי הקבוצות. לולאת המסלול מוסטת ימינה וה-EC50 נוטה להיות גבוה יותר בהיפרטנשן (יתר לחץ דם), מה שמרמז על ירידה ברגישות לסידן של המיופילמנטים.לפני ניסיון ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבחון את ה-cortium, המיוציטים המבודדים, על ידי זיהוי התכווצות מיוציטים ללא טעינה של Fura-2AM. בנוסף, יש לבדוק תמיד את התכווצות המיוציטים לאחר טעינה של Fura-2AM כדי למנוע טעינת יתר. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון טכניקות patch clamp, כדי לענות על שאלות נוספות.לדוגמה, פעילות של תעלת סידן מסוג L, כלומר, במעשה, הצימוד בין העירור להתכווצות במיוציט. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בעתיד הפיזיולוגיה של הלב להעמיק בתובנות לגבי מחלות לב בבני אדם. לאחר תרגול שגרתי, צריכה להיות לכם הבנה טובה של אופן ניתוח פעילות תעלות הסידן במיופילימנט.במטרה להבין טוב יותר את המנגנונים המתווכים את צימוד העירור-התכווצות הלבבי בלבבות בריאים וחולים.

assessment-myofilament-ca2-sensitivity-underlying-cardiac-excitation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה ישירה למדידת כוח שרירים, כוח שרירים, התכווצות וקינטיקה עיפנות של שרירי שלד מבודדים...

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

שריר פפילרי חדרית עזב Murine יכול לשמש כדי לחקור התכווצות לב במבחנה. מאמר זה מתאר בפירוט את הבידוד ופרוטוקולי ניסוי ללמוד מאפייני התכווצות לב.

מדידות התכווצות שרירים בpapillary מבודדים לחקירת הלב Inotropy בעכברים

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול מפורט וציוד הכרחי למיפוי כפול אופטי של (מ 'V) פוטנציאל הטרנסממברני וחופשי רשתית תוך-sarcoplasmic (SR) Ca 2 + בלב ארנב Langendorff-perfused. שיטה זו מאפשרת לתצפית ישירה וכימות של מטר V ו2+ דינמיקת Ca SR בלב שלם.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

פרוטוקול זה נועד לתאר צעד אחר צעד את הטכניקה של מיצוי והערכה של תפקוד הלב באמצעות cardiomyocytes עור. מתודולוגיה זו מאפשרת מדידה ואימודולציה חריפה של תפקוד myofilament באמצעות ביופסיות קפואות קטנות שניתן לאסוף ממקומות לב שונים, מעכברים לגברים.

להערכת ויטרו של תפקוד הלב באמצעות קרדיומיוציטים עור

אנו מציגים פרוטוקול להערכת ההשפעות האלקטרו-מאלקטרומכניים של הפעלת GtACR1 בקרדיוציטים בארנבים. אנו מספקים מידע מפורט על בידוד התא, culturing ו אדנונגיפי התמרה, ועל ניסויים פונקציונליים עם מלחציים טלאי וסיבי פחמן.

הערכה אלקטרו-מגנטית של אלקטרואופטיקה פעילות מודולציט

מוצג כאן פרוטוקול כדי להעריך את המאפיינים ההתכווצות של שרירים מחוסנים myofibrils עם רזולוציית ננו ניוטון. הפרוטוקול משתמש בהתקנה עם גשוש כוח אופטי מבוסס אינטרפרומטריה. הגדרה זו יוצרת נתונים עם יחס אות לרעש גבוה ומאפשרת הערכה של קינטיקה מתכוובת של myofibrils.

בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון

פרוטוקול זה מציג אוסף של נתונים גיאומטריים סרקומר, סידן ומקרוסקופיים מ trabecula ex vivoמתכווצת באופן פעיל . מדידות סימולטניות אלה מתאפשרות על ידי שילוב של שלוש שיטות הדמיה.

ברייטפילד בו זמנית, פלואורסצנטיות והדמיה טומוגרפית קוהרנטית אופטית של התלקחות טרבקולה לב Ex Vivo

מוצגת סדרה של פרוטוקולים המתארים את מדידת פונקציית ההתכווצות באמצעות זיהוי אורך סרקומר יחד עם מדידת סידן (Ca2+) במיוציטים של חולדות מבודדות. היישום של גישה זו למחקרים במודלים של בעלי חיים של אי ספיקת לב נכלל גם הוא.

ניתוח של תפקוד לקוי של התכווצות הלב ו- Ca2 + טרנזיינטים במיוציטים של מכרסמים

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד התכווצות בקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים מלבבות תורמים באמצעות מערכת MyoBLAZER, פלטפורמה אמינה להערכת שינויים בהתכווצות הנגרמת על ידי תרופות במהלך הפיתוח הפרה-קליני.

מדידת התכווצות הלב בקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים מבודדים

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca2+ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

למדו להעריך רגישות סידן במיופילמנטים בקרדיומיוציטים מבודדים מלב אוגרים. פרוטוקול זה משלב מדידות התכווצות סרקומרים ורמות סידן תוך-תאיות באמצעות Fura-2 AM לניתוח מקיף של קישור עירור-התכווצות לביתי.

הערכת Myofilament Ca

גלה סרטונים נוספים