מודל אפיתל דמה מקלעת מבוססת תאים של הגדר ודם-השדרתי נוזל לחקר זיהום חיידקים מצד basolateral

המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור מודל מבוסס תאי אפיתל מקלעת כורואיד של מחסום נוזל הדם-מוח האנושי. מאפשר חקר זיהומים חיידקיים מהצד הבסיסי-לטרלי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי מחלות זיהומיות של מערכת העצבים המרכזית, כגון אילו תהליכים מעורבים במהלך אינטראקציות חיידקיות עם אפיתל מקלעת הכורואיד.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח של האינטראקציות של פתוגנים עם הצד השחור הרוחבי הבסיסי של תאי האפיתל. ניתן ליישם שיטה זו גם במחקרים אחרים כגון, לחקירת ההעברה של תאי החיסון ותאי הגידול על פני אפיתל מקלעת הכורואיד. הרעיון הראשון להשתמש בפפילומה של מקלעת הכורקואיד האנושית, או תאי HIBCCP לשיטה זו עלה לי כשקראתי את כתב היד משנת 2005 של Shibata et.al.

מתאר את קו התאים. התחל בשימוש במלקחיים סטריליים כדי למקם תוספות מסנן תרבית תאים בגודל 0.33 סנטימטרים מרובעים, עם שלוש נקבוביות בגודל מיקרון הפוכות לבארות בודדות של צלחת שתים עשרה בארות. לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית, הציפו את הבאר בכשלושה מיליליטר מהמדיום שחומם מראש, ושאבו כל תמיסה נוספת, עד שהתא התחתון רק מתמלא.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרומטר של מדיום תת-תרבות של 37 מעלות בתוספת עשרה אחוז FCS על גבי המסנן. בעת הוספת המדיום חשוב מאוד להימנע מיצירת בועות אוויר, מכיוון שהבועות ימנעו את הזנת התאים מספיק. לאחר הוספת המדיום לכל התוספות, כסו את הצלחת והעבירו את התוספות לאינקובטור CO2 של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים.

כעת, שטפו בקבוק של תאי HIBCPP עם עשרה מיליליטר PVS, פעמיים במערבולת. לאחר הכביסה השנייה, הוסף לתאים שלושה מיליליטר של 0.25 אחוז טריפסין EDTA וסובב את הבקבוק. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך כעשרים דקות.

בתום הדגירה יש לוודא שהתאים התרוממו מתחתית הבקבוק ולהציג צורה עגולה. התאים אינם מתנתקים לחלוטין זה מזה ולעתים קרובות נמצאים באגרומרטים. השעו מחדש את התרבית עם 17 מיליליטר מדיום כדי לעצור את התגובה ולהעביר את המתלה לצינור של 50 מיליליטר.

לאחר מכן, סובב את התאים, והשהה מחדש את הגלולה בנפח מתאים של מדיום לספירה. לאחר מכן, יש לדלל את התאים לריכוז אחד כפול עשרה עד שישי תאים למיליליטר, ולהפוך את הצינור כדי לפזר את התאים באופן שווה. לאחר מכן, הוסף 80 מיקרו ליטר תאים לחלק העליון של כל תוספת מסנן.

לאחר שכל התוספות נזרעו, מכסים את הצלחת ומחזירים אותה לחממה לתרבית לילה. למחרת, הוסף מיליליטר אחד של מדיום לכל באר של צלחת 24 בארות. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הרם כל תוספת והשליך את המדיום בפנים, והניח את התוספות בצד ימין כלפי מעלה בבארות בודדות של צלחת 24 הבארות.

כאשר מוסיף המסנן מתהפך מצלחת 12 הבארות לצלחת 24 הבארות, היזהר לא לגעת בקרום המסנן כשהתאים גדלים למעלה. מלאו את התוספות ב 0.5 מיליליטר מדיום טרי, והחזירו את הצלחת לחממה. העבירו את התוספות לצלחת חדשה של 24 באר עם מדיום טרי כל יומיים, ובכך החליפו את המדיום בתא העליון.

כדי למדוד את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתלית, או TEER של התאים, טבלו תחילה את קצות האלקטרודות של מד וולט-אוהם של רקמת אפיתל לתוך 80 אחוז אתנול. לאחר 15 דקות, הסר את האלקטרודה מהאתנול כדי לאפשר לאלקטרודה להתייבש. לאחר מכן, הנח את הקצוות לתוך מדיום תת-תרבות למשך 15 דקות נוספות.

כאשר האלקטרודה מאוזנת, מקם את הזרוע הארוכה יותר כך שתיגע בתחתית התא התחתון של באר אחת של לוחית תרבית התאים, ואת הזרוע הקצרה יותר כך שתגיע לתא הכנסת המסנן. מדוד את ערכי ההתנגדות של מוסיף מסנן תרבית התאים במדיום ללא תאים כדי להשיג את הערכים הריקים. לאחר מכן, מדוד את ה-TEER של כל אחת מהתוספות הזרועות.

לאחר המדידה, החזירו את האלקטרודה ל-80 אחוז אתנול למשך 15 דקות, ולאחר מכן אחסן בצינור יבש. כאשר ערכי ה-TEER של תוספות הזרעים של HIBCPP עולים על 70 אוהם לסנטימטר בריבוע, יש לחדש את המדיום באמצעות מדיום תרבית טרי בתוספת חמישה מיקרו גרם למיליליטר אינסולין ואחוז אחד FCS, ולהחזיר את הצלחת לחממת גידול התאים למשך הלילה. כדי לקבוע את החדירות הפרה-תאית של תרביות ההכנסה, הוסף 50 מיקרו גרם למיליליטר של FITC-אינולין טרי שהוכן במדיום תרבית נמוך בסרום טרי לתא המסנן העליון של כל תוספת, והחזר את התאים לחממה.

כאשר התרביות הגיעו ל-TEER של כ-500 אוהם לסנטימטר בריבוע, הדביקו את התאים בתרחיף חיידקי מעניין בריבוי של עשרה, והחזירו את התאים לחממה לתקופת התרבית המתאימה. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים על ידי העברת המסנן לבאר חדשה עם מיליליטר אחד של מדיום נטול סרום. בכל פעם, הנח את המדיום בתא המסנן עם 500 מיקרו ליטר מאותו מדיום, לבסוף, קבע את ריכוז האינולין שעבר מתא המסנן דרך שכבת התא לאחר הזיהום החיידקי על ידי איסוף דגימות מדיום מהבאר התחתונה של כל תוספת מסנן תרבית תאים, ומדידת כל הדגימות בקורא צלחות מיקרו מול עשרה דילולים סטנדרטיים של FITC-אינולין.

תאי HIBCCP מציגים פונקציות מחסום ספציפיות המאפשרות להם להגביל את החילופים המולקולריים שלהם במידה צנועה. לדוגמה, ניתוחים אימונו-פלואורסצנטיים של צומת הסוג הקשור לחלבון, ZO-1, אוקלודין וקלודין-1, חושפים אות ללא הפרעה באתרי המגע בין התאים. ממחיש את החיבור ההדדי של התאים על ידי גדילים רציפים של צמתים הדוקים.

כאשר הם מתורבתים בתנאים המתאימים, תאי HIBCPP מציגים פוטנציאל ממברנה גבוה, המגיע עד כ -500 אוהם לסנטימטר בריבוע ללא טיפול, תוך שמירה על פונקציות המחסום האופייניות של מחסום נוזל הדם-מוח השדרה, כמו היווצרות פוטנציאל ממברנה, כמו גם חדירות נמוכה למולקולות מאקרו. עם זאת, ככל שמיישמים ריכוזים הולכים וגדלים של DMSO, ערכי ה-TEER יורדים באופן תלוי מינון, עם ירידה משמעותית דומה בערך ה-TEER שנצפתה לאחר הטיפול ב-Cytochalasin D. יתר על כן, תוספת של שני אחוזי נפח DMSO, או ציטוכלזין D, מביאה לעלייה משמעותית בחדירות מקבילה לשטף FITC-אינולין.

יתר על כן, הזיהום החיידקי של תאי HIBCCP גורם לפלישה משמעותית לשכבת התא על ידי שני זני חיידקים פתוגניים. MC58, והמוטציה חסרת הקפסולה שלו. בעוד שרק פלישה קלה נצפתה עבור זן אלפא 14 הפתוגני.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לגעת בקרום המסנן לאחר זריעת התאים מכיוון ששכבת ה-HIBCCP השלמה תופרע על ידי המגע. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחני הגירה חוץ גופית כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מנגנוני נדידת תאי החיסון והגידול על פני תאי אפיתל מקלעת כורואיד. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרמקולוגיה לחקור את העברת הסובסטרטים על פני אפיתל מקלעת הכורואיד במבחנה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין מודל מבוסס תאי HIBCCP של מחסום נוזל הדם-מוח השדרתי לזיהום רוחבי בסיסי עם פתוגנים. אל תשכח שעבודה עם פתוגנים אנושיים עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה תחת מכסה בטיחות מתאים בעת ביצוע הליך זה.