Name: קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוגל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: חקור שיטה להעשרת תאי אפיתל הרתי באמצעות מדרג צפיפות ו-FACS, תוך שימוש בפפטידים EAK16-II/EAKIIH6 ליצירת הידרוג'ל תלת-ממדי. השיטה תומכת בהישרדות התאים ומסייעת בביוהנדסת הרתיוס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R21 AI113000 (WSM) ו R01 AI123392 (YF).

כל בעלי החיים המשמשים בניסויים שוכנו במתקן החיה במכון מחקר אלגני-זינגר תחת הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש המכון לחקר זינגר רשת בריאות אלגני / אלגני. 1. לעכל את התימוס עם Collagenase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות התימוס קציר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים 3-5 שבועות בן עכברים C57BL6 / J בתוך הפחמן הדו-חמצני (CO 2) תא למסוק בלוטות התימוס. בפירוט, מניחים את העכברים בתא תחת אינדוקציה 2 CO 3-5 דקות ולאשר למוות על ידי אימות דום לב או נשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הפגר על גבו להרטיב את הגוף עם אתנול 70%. לעשות חתך אופקי קטן עם מספרי לנתח חד, ישר על הבטן שלה דרך העור. משוך את העור משני הקצוות (ראש ורגליים), כך הוא גם הפוך לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך אופקי עם המספריים לנתח רק תחתהצלע הנמוכה ביותר לחתוך דרך הסרעפת לצדדים. החזק את תהליך xiphoid עם מלקחיים ולחתוך באמצע הצלעות שתמשיך עד משני הצדדים. משוך כלפי מעלה את הצלעות / עצם החזה כך התימוס נראה בבירור. הערה: קורנית שוכנת ישירות על החלק העליון של הלב, מורכבת מ -2 אונות והוא בצבע לבן שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים מעוקלים, בעדינות לגרוף ולמשוך אונות התימוס ההנחה של רקמות חיבור העביר בתמיסת כביסה (ראה רשימה של חומרים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון העיכול על ידי ערבוב 9 מ&quot;ל RPMI-1640 (מכון ממוריאל פארק רוזוול בינוני-1640), 0.025 מ&quot;ג / collagenase מטוהרים מ&quot;ל, 10 HEPES מ&quot;מ [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה], ו -0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל DNase אני בתוך שפופרת 50 צנטריפוגות מ&quot;ל. שמור את הפתרון העיכול ב -37 מעלות צלזיוס המים באמבטיה עד השימוש. הערה: סכום פתרון העיכול המוכן מספיק thymi עכבר עד חמישה מבוגרים, אשר יכול להיות מודגרות יחד עגול קלקר אחד 5 מיליליטרצינור תחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התימוס לצלחת בתרבית רקמה 60 מ&quot;מ המכיל 5-6 מ&quot;ל RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את בלוטת התימוס עם 28 G אינסולין מזרק מחט לחתיכות קטנות (ריבוע 1 מ&quot;מ 3 על) כדי לאפשר לזרום החוצה לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את חתיכות הרתי עם RPMI-1640 כי הוא בצלחת פטרי עם פיפטה זכוכית פסטר. הטה את הצלחת ולתת שברי הרתי ליישב לתחתית. לאט לשאוב וזורקים supernatant RPMI-1640 באמצעות פיפטה מזכוכית. חזור על שלב שטיפה זה עם 5-6 מ&quot;ל RPMI-1640 עבור 4-5 פעמים עם פיפטה זכוכית עד הפתרון הוא פחות אטום. הערה: טפטפות זכוכית מומלץ בשלב זה, שכן שברי הרתי נוטים לדבוק פלסטיק, וכתוצאה מכך אובדן מוגזם של רקמות הרתי. עבור שאר ההליך, להשתמש טפטפות פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הסופית, לבטל את supernatant כמתואר בשלב 1.5. הוסף פתרון העיכול 3 מ&quot;ל ולהעביר את חתיכות התימוס והפתרון לתוך 5 מ&quot;ל p מסביב לתחתיתצינור olystyrene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על הכתף צינור לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות במהירות סיבוב של 12 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לתת את שברי הרתי ליישב לתחתית של התחתית על ידי כוח הכבידה. אסוף את supernatant עם פיפטה פסטר ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל עם 10 מ&quot;ל של תמיסת שטיפה. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend התאים בתמיסה לשטיפת 10 מ&quot;ל. שמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.6-1.8 פעמיים על שברי הרתי ב -5 מ&quot;ל מסביב לתחתית צינור קלקר. לרכז את supernatant בצינור אותו 50 מ&quot;ל. הערה: צנטריפוגה אין צורך השני לשטוף השלישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העיכול הסופי, pipet למעלה ולמטה עם 2 מיליליטר פיפטה סרולוגיות פלסטיק לשבור כל שברים שנותרו בצינור והעברת צינור צנטריפוגות 50 המ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שפופרת 50 מ&quot;ל ב 300 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend ב 10 מ&quot;ל של שטיפת buffer ולסנן דרך 100 מיקרומטר תא מסנן. שמור על הקרח. </li></ol> 2. העשרה של Tecs עם שיפוע צפיפות רציף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שיפוע צפיפות 21% על ידי ערבוב 2.4 מ&quot;ל בינוני שיפוע צפיפות (60% w / v של iodixanol במים) פתרון הכביסה 9.6 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים הרתי ניתק בצינור 50 מ&quot;ל אוסף משלב 1.11 ב XG 300 במשך 5 דקות ו resuspend במאגר כביסה 2.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל בינוני RPMI-1640 על השעיית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 12 מ&quot;ל של תמיסת שיפוע צפיפות 21% בתוך pipet סרולוגיות 10 מ&quot;ל עם פיפטור אלקטרוני. מניחים את קצה pipet סרולוגיות בתחתית הצינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל תאים המכילים, ולאפשר הפתרון שיפוע צפיפות לנקז אל החלק התחתון של הצינור באמצעות כוח הכבידה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרש פתרון שיפוע צפיפות מ pipet לסיים שהניב שתי השכבות של צפיפויות שונות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG FOr 20 דקות ב RT ב הרוטור מתנדנד-דלי. הגדר את קצב ההאטה ברמה האיטית ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השכבה העליונה ואת ממשק לצינור חדש 50 מ&quot;ל. הערה: רוב Tecs נשמרים בממשק. לימפוציטים יהיה להאיץ לתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה. אם תאים אלה ישמשו למטרות אחרות, יש לשטוף את הגלולה עם פתרון כביסה 20 מיליליטר במשך שלוש פעמים. Resuspend התאים 10 מ&quot;ל של חיץ הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון כביסה עד 40 מ&quot;ל אל הצינור בשלב 2.6 ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C. כדי להסיר את supernatant, לשאוב עם pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הכביסה פי 2 השאיפה כמתואר בשלב 2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 2 מ&quot;ל של תמיסת שטיפה לספור את התאים עם hemocytometer. </li></ol> 3. Tecs בידוד עם FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם התאים משלב 2.9 בריכוז של 1x10 6 תאים / 100 μl עם פתרון כביסה והעברתהתאים לצינור 5 מ&quot;ל מסביב לתחתית (פוליפרופילן או קלקר, כפי שהומלץ על ידי ההנחיות של סדרן זרימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 2 IgG הקולטן אנטי Fc μl לכל 1x10 6 תאים דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוספת CD45 אנטי (דילול 1: 150, 10 μl לדגימה) ואנטי-EpCAM (1: 100 דילול, 10 μl לדגימה) נוגדני דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ -20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פתרון צנטריפוגות כביסה 2 מ&quot;ל ב 400 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C. לשאוב supernatant עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים שנאגרו מלוחים פוספט 1x 1 מ&quot;ל (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון דרך מסננת 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את התאים למכשיר מיון. בחר את הלימפוציטים ואוכלוסיית TEC למעט התאים הקטנים ביותר על אור המפוזר בצד (SSC) / אור-מפוזר קדימה פנל (FSC) (תאים מתים), אז שער על האוכלוסייה שנבחרה CD45- EpCAM + למיון 13. </li></ol> 4. Generation של TEC / EAK אגרגטים הערה: יש לבצע הכנה מגיב וצעדים מעורבים תא ערבוב מתחת למכסה המנוע למינרית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מתחמי מתאם PA / G על ידי ערבוב 4 μl של IgG אנטי-שלו-תג, 8 μl של IgG אנטי EpCAM ו -2.6 μl של הרשות / G בתוך שפופרת microcentrifuge סטרילי 1.5 מ&quot;ל, ו לדגור על RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את Tecs מסודרים משלב 3.7 ל 5x10 4 תאים / מ&quot;ל עם פתרון כביסה, ו pipet 100 μl כדי אחד טוב של אויר נמוך, 96-גם צלחת בתרבית רקמה מסביב לתחתית. להוסיף 14.6 מתחמי מתאם PA / G μl אל התאים. מניח את הצלחת על פלטפורמת נדנדה במשך 20 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם 200 פתרון הכביסה μl. צנטריפוגה את הצלחת ב 400 XG במשך 6 דקות. בטל supernatant עם micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם תמיסת סוכרוז 200 μl 10%. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 6 דקות. בטל supernatant עם micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 30 μl 10% sתמיסת סוכרוז terile לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של EAKIIH6 (7.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו דגירה במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של EAK16-II (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לתערובת TEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של מדיום מלא למערכת ליזום gelation. מניחים את הצלחת על שייקר פלטפורמה 15-20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 2-4 שעות, להוסיף עוד 100 μl של בינוני מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית בכל יום אחר עד השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 100 μl של המדיום מפני השטח מבלי להפריע את הג&#39;ל באמצעות micropipette בעדינות להוסיף 100 μl של מדיום מראש חימם ידי הצבת קצה פיפטה אל הקיר של הבאר. </li></ol></li></ol> אפיון 5. של אגרגטים TEC / EAK <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון את הפונקציה של אגרגטים TEC / EAK in vivo, לאסוף את TEC / הידרוג&#39;ל EAK לאחר O / N תרבות השתלת תחת הקפסולה כליות של athymic בעירוםעכבר, באמצעות שתואר לעיל הליך 11,14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על התפתחות תאי T בפריפריה על ידי קצירת 50-100 דגימות דם μl לתוך צינור איסוף דם המכיל EDTA מן העכברים בעירום 4-6 שבועות לפרסם השתלה ואת כתם עם קוקטייל של CD4 אנטי, -CD8, -CD45 , ו -CD3 נוגדנים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את האחוזים של לימפוציטים מסוג T ב לויקוציטים דם היקפיים עם cytometry זרימה (FCM), באמצעות תוכנת ניתוח תא בודד 12. </li></ol>

<ol><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+deletion+of+insulin+induces+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes.</a> The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).</li>
<li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li>
<li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li>
<li>Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+colloidal+suspension+of+hydrophobic+compounds+with+an+amphiphilic+self-assembling+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).</li>
<li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+the+ionic+peptide+EAK16%3A+the+effect+of+charge+distributions+on+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly.</a> Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).</li>
<li>Saunders, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+fluorogen+activating+proteins+into+self-assembling+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials.</a> Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).</li>
<li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+of+the+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).</li>
<li>Wen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coassembly+of+amphiphilic+peptide+EAK16-II+with+histidinylated+analogues+and+implications+for+functionalization+of+beta-sheet+fibrils+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo.</a> Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide-based+material+platform+for+displaying+antibodies+to+engage+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells.</a> Biomaterials. 32, 249-257 (2011).</li>
<li>Tajima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+mini+functional+thymic+units+with+EAK16-II%2FEAKIIH6+self-assembling+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel.</a> Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+Thymus+Organoids+to+Restore+Thymic+Function+and+Induce+Donor-Specific+Immune+Tolerance+to+Allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts.</a> Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+deletion+of+insulin+induces+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes.</a> The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+central+tolerance+of+ICA69+induces+multiple+organ+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity.</a> J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).</li>
<li>Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li>
<li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+complex+thymus+stromal+cell+populations%3A+rapid+thymic+epithelia+preparation+characterizes+radiation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury.</a> Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).</li>
<li>McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).</li>
<li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+identification%2C+and+purification+of+murine+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells.</a> J Vis Exp. , e51780(2014).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+monocytes+from+whole+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Separation of monocytes from whole human blood.</a> ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).</li>
<li>Li, X., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+subcellular+membrane+vesicles+of+epithelial+and+nonepithelial+cells+by+OptiPrep+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation.</a> Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).</li>
<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+method+using+iodixanol+%28OptiPrep%29-based+density+gradient+significantly+reduces+cytokine+chemokine+production+from+human+islet+preparations%2C+leading+to+prolonged+beta-cell+survival+during+pretransplantation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture.</a> Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).</li>
<li>Anderson, G., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%3A+working+class+heroes+for+T+cell+development+and+repertoire+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection.</a> Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).</li>
<li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role for central tolerance.</a> Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).</li>
<li>St-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+of+neonatal+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells.</a> Sci Rep. 3, 1860(2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

בעוד Tecs הם האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי ולשחק תפקידים חיוניים עבור המבנה והתפקוד של בלוטות התימוס, הם מהווים רק 0.1-0.5% של cellularity הרתי הכולל. הם גם תאי שברירי כמו באחוזים גבוהים של מוות של תאים הם נצפו לעתים בעקבות עיכול collagenase, כלומר, הטיפול לנתק Tecs מן מטריקס (ECM). הנדירות שלהם (~ 200,000 לכל התימוס עכבר) והשברירי, היו זו משימה מאתגרת לבודד Tecs. הניצול האחרון של collagenase הנקי במיוחד בבידוד TEC הגדיל באופן משמעותי את מספרם של תאי חיים בעקבות העיכול ...

התימוס הוא איבר הלימפה הראשי אחראי לייצור אוכלוסייה מגוונת של תאי הפתוגן-reactive, עצמי סובלני T כי הוא חיוני לתפקוד של מערכת החיסון הנרכשת. זהו איבר דינמי שבו thymocytes פיתוח, עלה ממח העצם כפי ובתאים הלימפוציטים, נודדים דרך מטריקס תלת מימדי דמוי ספוג (3-D) של stroma הרתי, לעבור השושלת-מפרט והבחנה, ובסופו של דבר להגר כפי בוגרת T-תאי. הצלחתו של תהליך מתוכנת היטב זה תלוי במידה רבה על הצטלבות בין thymocytes נודדות לתאי האפיתל מגורים הרתי (Tecs), האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי החיוניים לקביעתם ולקיומם של שלמות במיקרו-סביבה של התימוס. בהתבסס על המיקום האנטומי שלהם פונקציה ייחודית, Tecs ניתן לחלק לשתי קבוצות משנה: הטקאנים בקליפה (cTECs) כי הם responsible לבחירה עצמי MHC (מורכבי histocompatibility גדולים) מוגבל מתאי T (סלקציה חיובית), ואת Tecs ב הלשד (mTECs) כי הם חיוניים עבור ביטול אוטוריאקטיבים תאי T (סלקציה שלילית) 1,2. גורמים רבים (למשל, הזדקנות, זיהום, קרינה, התרופה טיפולים) יכול לגרום נזק בלתי הפיך האפיתל הרתי, וכתוצאה מכך חסינות אדפטיבית נפגעת. למרות ניסיונות רבים, משחזר את תפקוד הרתי כבר מאתגר בשל הקושי לשחזר את המיקרו-סביבה הרתי. יש לציין, הרתי תלת ממדי (3-D) תצורה היא קריטית להישרדות והתפקוד של Tecs, ואילו Tecs תורבת בסביבת 2-D במהירות להקטין את הביטוי של גנים קריטיים עבור 3,4 thymopoiesis. EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) ו אנלוגי histidinylated C- מסוף שלה EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) הם משקל מולקולרי נמוך, oligopeptides amphiphilic כי הם מסיסים שתייה ללא יוניםr, אבל לעבור gelation ליצירת β-הסיבים כאשר הם נחשפים כוח יוניים גבוה מ -20 מ&quot;מ NaCl (ריכוז מלח רגיל בנוזל הגוף האנושי הוא 154 מ&quot;מ). נכס תגובה הסביבה זה גורם להם להיות אבני הבניין צדדי כדי ליצור מבנים 3D. The-התג שלו על EAKII-H6 מספק מנגנון עגינה, שבאמצעותו IgGs אנטי שלו / Fc מחייב חלבון רקומביננטי / G (αH6: PA / G) מתחמים יכולים לשמש מתאם לעגן תרופות חלבון ביומולקולות אחר ( למשל, נוגדנים) על מרוכבים הידרוג&#39;ל 5-8. אנחנו הוכחנו בעבר כי מולקולות ניאון שכותרתו IgG מעוגנות על הידרוג&#39;ל ניתן להיעזר באזור הזריקה עד 13 ימים 9. יתר על כן, כאשר αH6: מתאמי הרשות / G מעוגן עם IgGs אנטי CD4 נוספו EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) הידרוג&#39;ל, תאי CD4 + T נתפסו במיוחד 10. באמצעות טכניקה דומה, אנחנו הוכחנו לאחרונה כי צבירת 3-D של ג Tecsולד יקודם הידרוג&#39;ל EAK עם מתחמי מתאם נושאת נוגדנים אנטי EpCAM TEC-ספציפי (αH6: PA / G: αEpCAM). כאשר מושתלים מתחת קפסולות הכליות של עכברים בעירום, אשכולות TEC מוטבעים הידרוג&#39;ל EAK יכולים לתמוך בפיתוח יעיל של תאי T התפקודיים in vivo 11,12. כאן אנו מדגימים את השיטה שלנו לטהר Tecs במהירות וביעילות עם תא המופעל הקרינה מיון (FACS) וליצור 3-D אגרגטים TEC עם מערכת הידרוג&#39;ל EAK.

<table><tbody><tr><td><חזק>TEC בידוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701 (1 ליטר)</td> <td>אתנול 200 הוכחה, מספריים לניתוח מים נטולי יונים</td></tr><tr><td>, ישר</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים של Graefe, ישר</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים של Graefe,</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> כביסה <td>1x PBS, 0.1% BSA, 2&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>1x PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (אלבומין בסרום בקר)</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> עיכול <td>9 מ"ל RPMI-1640, 0.025&nbsp; מ"ג/מ"ל Liberase TM ציון מחקר, 10&nbsp; מ"מ HEPES, 0.2&nbsp; מ"ג/מ"ל DNaseI</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>המכונה "קולגנאז מטוהר"</td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; צינור צנטריפוגה מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; צלחת תרבית רקמות מ"מ</td><td>פלקון</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>1/2&nbsp; מזרק אינסולין cc U-100 28&nbsp; 1/2&nbsp; ג'י</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול</td><td>פלקון</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; מ"ל צינור זכוכית</td><td>פישר הלת'</td><td>13-678-27E</td><td>השתמש לשטיפת שברי התימוס. שברי תימוס נוטים להיצמד לקיר בעזרת צנרת פלסטיק.</td></tr><tr><td>מסובב צינור MACSmix</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>100&nbsp; ומיקרו; מסננת תאים m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>מדיום שיפוע צפיפות: OptiPrep</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td></td></tr><tr><td><מיון תאים חזק></חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; מ"ל פוליפרופילן צינור תחתון עגול</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD16/CD32 (FC Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>להשתמש כלא מדולל, 2&nbsp; ומיקרו; l לכל דגימה</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD45-PercpCy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-80</td><td>השתמש ב 1:150, 10&nbsp; ומיקרו; l לכל דגימה</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD326 (EpCAM)-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5791-82</td><td>השתמש ב-1:100, 10&nbsp; ומיקרו; l לכל דגימה</td></tr><tr><td>BD Influx</td><td>BD Biosciences</td> תוכנה לניתוח תאים בודדים <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAK ג'ל הרכבה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-היס-תג</td><td>AnaSpec</td><td>29673</td> <td>"אנטי-היס-תג IgG"</td></tr> <tr><td>מטוהר נגד עכבר CD326 (EpCAM)</td> <td>BioLegend</td><td>118202</td><td>"אנטי-EpCAM IgG"</td></tr><tr><td>חלבון רקומביננטי A/G</td><td>פירס ביוטכנולוגיה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile</td><td>Fisher Healthcare</td><td>05-402-24B</td><td>המכונה "1.5&nbsp; צינור מיקרוצנטריפוגה מ"ל "</td></tr><tr><td>96 בארות, צלחת תרבית רקמות, תחתית עגולה עם מכסה אידוי נמוך</td><td>BD Falcon</td><td>353917</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת נדנדה: מיקסר Nutator מס' 1105</td><td>BD Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% סוכרוז</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>הכן עם מים מזוקקים סטריליים</td></tr><tr><td>EAK16-II (AcNH-AEAEAKAEAEAKAK-CONH2)</td><td>American Peptide Company& נ.ב.פ;</td><td></td><td>מסונתז בהתאמה אישית, 10&nbsp; מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)</td><td>חברת הפפטידים האמריקאית&nbsp;</td><td></td><td>מסונתז בהתאמה אישית, 7.5&nbsp; מ"ג/מ"ל</td></tr><tr>RPMI-1640<td>בינוני</td><td></td><td></td> מלא<td>, 10% FBS, 1% עט/סטרפטוק, 1% L-גלוטמין, 1% NEAA, 5&nbsp; מ"מ HEPES, 50&nbsp; ומיקרו; M 2-מרקפטואתנול</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ג'יבקו</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>FBS (סרום בקר עוברי)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>מושבת בחום לפני השימוש</td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס</td><td>גיבקו</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200&nbsp; מ"מ (100x)</td><td>גיבקו</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (חומצת אמינו לא חיונית) 100x</td><td>גיבקו</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (100x)</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>שייקר פלטפורמה: רקדנית הבטן</td><td>Stovall Life Sciences Inc.</td><td>דגם: USBDbo</td><td></td></tr></tbody></table>

קידום aggregation 3-d של תאי אפיתל הרתי המטוהר facs עם eak 16-ii / eakiih6 עצמית להרכבת הידרוג&#39;ל

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

התפתחות בלוטת התימוס, הקשורה להזדקנות או עלבונות פתולוגיים, גורמת לירידה בתפוקה של תאי T בוגרים. שחזור התפקוד של בלוטת התימוס הכושלת הוא חיוני לשמירה על תגובה חיסונית נרכשת יעילה בתיווך תאי T כנגד פתוגנים פולשים. עם זאת, התחדשות התימוס והחייאתו התגלו כמאתגרים, בעיקר בשל הקשיים בשחזור המיקרו-סביבה התלת-ממדית הייחודית של הסטרומה התימית שהיא קריטית להישרדות ולתפקוד של תאי אפיתל תימוס (TECs). פיתחנו מערכת הידרוג'ל חדשה לקידום היווצרותם של אגרגטים TEC, המבוססת על תכונת ההרכבה העצמית של האוליגופפטידים האמפיפיליים EAK16-II והאנלוגי ההיסטידיניל שלו EAKIIH6. TECs הועשרו מתאים תימיים מבודדים עם שיפוע צפיפות, מוינו במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי (FACS), וסומנו בנוגדנים של מולקולת הידבקות תאים אנטי-אפיתל (EpCAM) שעוגנו, יחד עם אנטי-His IgGs, על קומפלקסי מתאם החלבון A/G. היווצרות אגרגטים של תאים קודמה על ידי דגירה של TECs עם אוליגופפטידים EAKIIH6 ו-EAK16-II, ולאחר מכן על ידי הגדלת הריכוז היוני של המדיום כדי להתחיל ג'לציה. אגרגטים של TEC המוטבעים בהידרוג'ל EAK יכולים לקדם ביעילות את התפתחותם של תאי T פונקציונליים in vivo כאשר הם מושתלים בעכברים עירומים אתימיים.

כדי לבחון את האפקטיביות של השימוש בפרוטוקול ההפרדה שיפוע צפיפות להעשיר את תאי סטרומה CD45-, תאים שנקטפו משני הממשק ואת כדורי הלימפוציטים זירז הוכתמו אנטי CD45 ונוגדנים אנטי EpCAM. שני 1 אנטי Ulex Europaeus agglutinin (UEA1) ונוגדנים נגד MHC Class II נכללו גם קוקטייל מכתים להמשיך לזהות את תת cTEC ו Mtec. כפי שניתן לראות בתרשים 1, הצלחנו להשיג שגרתי קרוב ל 15-20 פעמים העשרה של Tecs. <p class="jove_content" fo:keep-together.within...

סרטון זה מדגים פרוטוקול להעשרת תאי אפיתל תימיים (TECs) עם שיפוע צפיפות לבידוד FACS. הוא גם מראה את השימוש בפפטידים EAK16-II/EAKIIH6 כדי לקדם את היווצרות הצבירה של TEC. המיקרו-סביבות של הידרוג'ל EAK16-II/EAKIIH6 מספקות את התצורה התלת-ממדית הדרושה לשמירה על ההישרדות והתפקוד של ה-TEC.

קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג&#39;ל

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את השימוש בפפטיד EAK 16-II/EAKIIH6 בקידום צבירת תאי אפיתל תימי במבנה תלת מימדי לתמיכה בהישרדות עצמית ותפקוד אפיתל תימי. שיטה זו עשויה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-הנדסה של בלוטת התימוס. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא משתמשת בפפטיד EAK-16-II/EAKIIH6, מקדמת צבירת תאי אפיתל תימיים, מתכלה ובעלת פוטנציאל לשמש להזרקות.כדי לקצור את בלוטת התימוס, התחל בהנחת עכבר שחור C57 6J בן שלושה עד חמישה שבועות במצב שכיבה והרטיב את השיער עם 70% אתנול. בעזרת מספריים חדים וישרים, בצע חתך אופקי קטן דרך עור הבטן. לאחר מכן משוך את העור משני צידי החתך כדי לחשוף את חלל הבטן.לאחר מכן, בצע חתך אופקי ממש מתחת לצלע התחתונה וחתוך לצדדים לסרעפת. בעזרת מלקחיים מושכים את תהליך ה- xiphoid וחותכים את אמצע הצלעות משני צידי החזה. משוך את הצלעות ועצם החזה כלפי מעלה כך שבלוטת התימוס נראית בבירור.לאחר מכן, בעזרת מלקחיים מעוקלים, גרפו בעדינות את אונות התימוס מרקמת החיבור והניחו אותן בתמיסת כביסה. לאחר השטיפה, העבירו את בלוטת התימוס לתבנית תרבית רקמה של 16 מיליליטר המכילה חמישה עד שישה מיליליטר של RPMI 1640 והשתמשו במחט אינסולין בגודל 28 כדי לנתח את הרקמה לחתיכות מרובעות של כמילימטר מעוקב. לאחר מכן, השתמש בפיפטה פסטר זכוכית כדי לשטוף את שברי הרקמות עם המדיום שבצלחת.לאחר מכן, הטה את המנה ותן לשברים להתיישב לתחתית. הסר לאט את המדיום על ידי שאיפה. לאחר מכן חזור על הכביסה ארבע עד חמש פעמים נוספות עם חמישה עד שישה מיליליטר של מדיום טרי בכל פעם עד שהתמיסה הופכת פחות אטומה.לאחר השטיפה הסופית, הוסיפו לתבשיל שלושה מיליליטר תמיסת עיכול והעבירו את חתיכות התימוס והתמיסה לצינור פוליסטירן תחתון עגול של חמישה מיליליטר. דגרו את הרקמות על מסובב צינור ב-37 מעלות צלזיוס למשך שש דקות ב-12 סל"ד. בסוף הסיבוב, הניחו לשברים להתיישב בתחתית הצינור והשתמשו בפיפטה של פסטר כדי להעביר את הסופרנטנט לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר תמיסת כביסה.צנטריפוגה את הסופרנטנט והשעיה מחדש של התאים ב -10 מיליליטר של תמיסת כביסה טרייה על קרח. לאחר מכן עכל את שברי התימוס פעמיים נוספות במסובב כפי שהודגם זה עתה, ומשוך את הסופרנטנט באותו צינור של 50 מיליליטר. לאחר העיכול הסופי, השתמש בפיפטה סרולוגית מפלסטיק של שני מיליליטר כדי לשלש את כל השברים שנותרו ולהעביר את שטף הרקמות לצינור של 50 מיליליטר.סובב את הצינור כדי לאסוף את התאים ולהשעות מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מאגר כביסה. לאחר מכן, סנן את התאים דרך מסננת של 100 מיקרון בזמן שהצינור מונח על קרח. כדי להעשיר את תאי האפיתל התימי, סובב שוב את התאים והשהה מחדש את הגלולה ב -2.5 מיליליטר של מאגר כביסה.לאחר מכן, הוסף 20 מיליליטר של RPMI 1640 לתאים והשתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לשכב בזהירות 12 מיליליטר של תמיסת שיפוע בצפיפות 21% שהוכנה טרי מתחת לתאים על ידי כוח הכבידה. כעת, הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד בקצב ההאטה האיטי ביותר. בתום הצנטריפוגה, העבירו את השכבה העליונה ואת הממשק לצינור חדש של 50 מיליליטר והוסיפו עד 40 מיליליטר של תמיסת כביסה לתאים.הסר את שיפוע הצפיפות על ידי שלוש צנטריפוגות רצופות באמצעות פיפטה כדי לשאוב את הסופרנטנט לאחר כל שטיפה. ואז השעו מחדש את הגלולה הסופית בשני מיליליטר של תמיסת כביסה לספירה. כדי ליצור את אגרגטי EAK של תא האפיתל התימי, התאם את תאי האפיתל התימיים לדילול של חמישה פעמים 10 לארבעה תאים למיליליטר בתמיסת כביסה וזרע 100 מיקרוליטר תאים לבאר לתוך צלחת תרבית רקמות נמוכה של 96 בארות, תחתית עגולה.לאחר מכן, הוסף 14.6 מיקרוליטר של מתחמי מתאם AG חלבון טריים שהוכנו לכל באר והניח את הצלחת על משטח נדנדה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות יש לשטוף את התאים עם 200 מיקרוליטר תמיסת כביסה לבאר, בעזרת מיקרופיפטה להסרת הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את התאים שוב עם 200 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז 10%.השעו מחדש את הכדורים ב -30 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז סטרילית של 10% לבאר. לאחר מכן, דגרו את התאים ב-10 מיקרוליטר EAKIIH6 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה מוסיפים 20 מיקרוליטר EAK 16-II, ואחריהם 100 מיקרוליטר של מדיום שלם ומניחים את הצלחת על פלטפורמה בטמפרטורת החדר כדי להתחיל את הג'לציה.לאחר 15 עד 20 דקות, העבירו את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר מכן מוסיפים עוד 100 מיקרוליטר של מדיום שלם ומחזירים את הצלחת לחממה. כדי לשנות את המדיום, השתמש במיקרופיפטה כדי לשאוב 100 מיקרוליטר של המדיום מעל פני התרבויות מבלי להפריע לג'ל ולהניח את הקצה על קירות כל באר כדי לזרוע את התרבויות עם 100 מיקרוליטר של מדיום מחומם מראש.באמצעות פרוטוקול הפרדת שיפוע הצפיפות כפי שהודגם זה עתה, ניתן להעשיר באופן שגרתי תאי סטרומה שליליים CD45 פי 15 עד 20 כפי שמוצג בתרשים הנקודות המייצג הללו. כאן, אגרגטים של תאי אפיתל תימיים, שהוכנו מעכברים פלואורסצנטיים אדומים בני ארבעה שבועות המבטאים טרנסגניים כפי שהודגם זה עתה, תורבו במשך יומיים במבחנה ונבדקו במיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר השליטה, ניתן להעשיר את תאי האפיתל התימיים למיון זרימה תוך שלוש עד ארבע שעות.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת רקמות התימוס לפתח יחידות מיני תימוס פונקציונליות הניתנות להזרקה כדי לווסת את מערכת החיסון הנרכשת.

promoting-3-d-aggregation-facs-purified-thymic-epithelial-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון זה הכנת 2-dGuo שטופלו reaggregate תרבויות התימוס מודגם.

Reaggregate תרבויות קורנית

אנו מציגים פרוטוקולים אנקפסולציה (3D) 3 ממדי של תאים בתוך הידרוג סינתטי. ההליך המתואר אנקפסולציה עבור שתי השיטות הנפוצות של crosslinking (מייקל מסוג בנוסף ואור יזומה מנגנוני רדיקלים חופשיים), כמו גם מספר טכניקות להערכת התנהגות התא כמוס.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

כאן אנו מתארים את השימוש של הרכבה עצמית 3 ממדי הפיגום לתרבות תאים אנושיים אבי עצביים. אנו מציגים פרוטוקול לשחרר את התאים מן הפיגומים כדי להיות מנותח למשל לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה. פרוטוקול זה עשוי להתאים סוגי תאים אחרים לבצע מחקרים מפורטים באופן מכניסטי.

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

הפרוטוקול הבא מספק טכניקות לencapsulating לבלב β-תאים בידרוג PEG-פפטיד שלב צמיחה שהוקם על ידי thiol-ene תגובות תמונה בלחיצה. פלטפורמת חומר זה לא רק מציעה microenvironment cytocompatible אנקפסולציה תא, אלא גם מאפשרת התאוששות מהירה למשתמש שליטה מלאה של מבני תא נוצרה בתוך הידרוג.

דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד

ליצירת מבנים מאורגנים מאוד של רקמה מורכבת, יש להרכיב מספר חומרים וסוגי תאים לכדי קומפוזיט משולב.  עיצוב קומבינטורי זה משלב יריעות תאים שכבתיות ספציפיות לאיבר עם שני חומרים נפרדים שמקורם ביולוגית המכילים בסיס מטריצה סיבי חזק, ותאי אנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדשים.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

חקר תאי אפיתל תימיים מדולריים במבחנה לא הצליח ברובו, מכיוון שמערכות התרבית הדו-ממדיות הנוכחיות אינן מחקות את תרחיש in vivo. מערכת התרבית התלת-ממדית המתוארת כאן - מודל תרבית אורגנוטיפית של עור שונה - הוכיחה את עצמה כעדיפה בסיכום התפשטות mTEC, התמיינות ותחזוקה של ביטוי גנים מופקר.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בתעלה מיקרופלואידית עם שינוי גיאומטריה לאורך כיוון זרימת הנוזל כדי ליצור מאמץ מאריך (מתיחה) ליישור סיבים בהידרוג'ל קולגן תלת-ממדי (עובי &lt;250 מיקרומטר). היישור המתקבל משתרע על פני מספר מילימטרים ומושפע מקצב המאמץ המתארך.

מיקרו-הנדסה הידרוג'ל קולגן תלת-ממדית עם יישור סיבים לטווח ארוך

מאמר זה מתאר כיצד להדפיס ביו-ממד הידרוג'לים פוטו-ממדיים כדי לחקור התקשות מטריצה חוץ-תאית והפעלת פיברובלסטים.

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית הידרוג'לים פוטו-ממדיים לחקר הפעלת פיברובלסטים

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להיווצרות אורגנואידים אנושיים של בלוטת התימוס המופקת מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) הגדלים בהידרוג'לים תלת-ממדיים של פיברין, במטרה לתמוך בהבשלת תאי אפיתל תימיים (TEC) ובתחזוקה ממושכת, כמו גם במבחנה, כמו גם במבחנה.

היווצרות אורגנואידים של בלוטת התימוס האנושית בהידרוג'לים תלת מימדיים של פיברין

חקור שיטה להעשרת תאי אפיתל הרתי באמצעות מדרג צפיפות ו-FACS, תוך שימוש בפפטידים EAK16-II/EAKIIH6 ליצירת הידרוג'ל תלת-ממדי. השיטה תומכת בהישרדות התאים ומסייעת בביוהנדסת הרתיוס.

קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג'ל

גלה סרטונים נוספים