עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה

המטרה הכוללת היא לספק גישה כללית לפיתוח מבחן קולורימטרי מבוסס ננו-חלקיקי זהב לזיהוי מולקולות מטרה, ולספק גישות לשיפור האחסון לטווח ארוך ולהפחתת שיעורי תגובה חיובית שגויה. שיטות אלו עונות על שאלות מפתח בתחום בדיקות הקולורמטריות של אפטמר ננו-חלקיקי זהב, כגון שחזוריות הבדיקות בשטח לאחסון ארוך טווח והפחתת שיעור התגובה החיובית השגויה. בדיקות אלו עלולות להיות חשופות לבעיות עם חיי המדף ותגובות חיוביות שגויות.

בעבודה הזו, אנו משתפרים בשני הנושאים הללו. נקה בקבוק ארלנמאייר בנפח 500 מיליליטר ומוט ערבוב גדול עם חמישה מיליליטר של חומצה חנקתית מרוכזת ו-15 מיליליטר חומצה כלורית מרוכזת בתוך מכסה בטיחות כימית. הרטיב את כל משטח הבקבוקון עם שטיפה חומצית.

לאחר מכן שטוף את הבקבוק במים ללא נוקלאז ותן לבקבוק להתייבש. הוסף 100 מיליליטר של זהב מילימולר אחד ושלושה כלוריד. השתמש בדף נייר אלומיניום לכסות את החלק העליון של בקבוק ארלנמאייר המנוקה בחומצה ולחמם בערבוב רציף על פלטה חמה עד לרתיחה.

לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של 38.8 מילימולר סודיום ציטראט. הצבע ישתנה משקופ או אפור לכחול כהה או שחור, ולבסוף לכהה לאדום במשך מספר דקות. המשיכו לערבב עם האש כבויה במשך 10 דקות.

אפשר למתלים של ננו-חלקיקי הזהב להתקרר לטמפרטורת החדר ולהוסיף 110 מיקרוליטר של DEPC עם ערבוב רציף. כסו את כל הבקבוקון בנייר אלומיניום ותנו לטיפול ב-DEPC להידגר במהלך הלילה. למחרת, אוטוקלב את המתלה הננו-חלקיקי הזהב.

לאחר מכן קרר לטמפרטורת החדר ומסנן דרך ממברנת אצטט תאית של 0.22 מיקרון. אחסן את תמיסת הננו-חלקיקים הזהובים המסוננת והאוטומטית בחושך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. חשב את ריכוז ננו-חלקיקי הזהב כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כאן, הריכוז חושב כ-10 ננומולר וגודל של 15 ננומטרים, כפי שנקבע על ידי פיזור אור דינמי. רכש או סינתז את רצפי האפטמרים הקשרים לקוקאין באמצעות כימיה סטנדרטית של פוספורמידיט. לאחר טיהור האפטמרים באמצעות הסרת מלח סטנדרטית, לשחזר אוליגונוקלאוטידים במים ללא נוקלאז בתמיסות מלאי של 100 מיקרומולרים או במילימולר אחד.

אפטמרים מטוהרים עם אליקוטים יכולים להיאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. שלבו את ה-DNA עם תמיסת ננו-חלקיקי זהב בת 10 ננומולרים, תוך שינוי נפח ננו-חלקיקי הזהב לפי הצורך, כדי לספק דגימה מספקת לביצוע הבדיקה. דגרו את התערובת במשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר והגנו מהאור.

הוסיפו נפח שווה של HEPES של 20 מילימולר, שני מילימולר מגנזיום כלוריד ובופ pH של 7.4, והניחו את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס בחושך במהלך הלילה. ריכוז המלח ההתחלתי הנדרש להשראת תגובת צבע הבדיקה באמצעות טיטרציה של מלח נקבע באמצעות ריק הבדיקה. הוסיפו 20 מיקרוליטר מתנול ל-180 מיקרוליטר אליקווטים של מבחן כלוריד הזהב של אפטמר בלוח של 96 בארות.

שלב קריטי בביצוע הבדיקות הללו הוא לקבוע את ריכוז כלוריד הנתרן כדי לערער את ננו-חלקיקי הזהב לאחר הוספת המטרה. טיטרציה של הדגימות עם נפחים הולכים וגדלים של תמיסת נתרן כלוריד המקורית וקבעו את נקודת השקילות. כאן, קבעו את נפח כלוריד הנתרן הנדרש כדי לגרום לשינוי הצבע הקל ביותר באמצעות תצפית חזותית.

כדי לייעל את תגובת הבדיקה, הוסף 20 מיקרוליטר של מולקולות אנליט מדוללות במתנול ל-180 מיקרוליטר של בדיקת ננו-חלקיקי זהב אפטמר-זהב בפלטת 96 בארות בטמפרטורת החדר. מיד, הוסף את ריכוז כלוריד הנתרן שנקבע בשלב הקודם כדי להתחיל את תגובת הצבע של הבדיקה. להשיג את שינוי הצבע הגדול ביותר האפשרי על ידי הגדלת או הורדת ריכוז כלוריד הנתרן והשוואת תגובת היעד לתגובה הריקה.

השתמש בריכוז כלוריד הנתרן שמספק את ההבדל הגדול ביותר בתגובה. התבונן או מדד את תגובת הבדיקה 150 שניות לאחר הוספת כלוריד נתרן. נתח את הספיגה ב-650 ננומטר ו-530 ננומטר, באמצעות ספקטרופוטומטר.

צייר את התוצאות כיחס הספיגה שהושג ב-650 ננומטר ל-530 ננומטרים כפונקציה של ריכוז האנליטים. נרמל את תגובת הבדיקה לאות ריק. הכינו את רכיבי בדיקת ננו-חלקיקי זהב כפי שתוארו קודם בסרטון.

הכינו תמיסות נפרדות המכילות גרם אחד למיליליטר של טרהלוז וגרם אחד למיליליטר סוכרוז במים ללא נוקלאז כדי להכין את תמיסת הקריוגן. לכן שלב קריטי בהקפאת הבדיקות הללו הוא לקבוע כמה טרהלוז ותמיסות סוכרוז להוסיף לדגימות כדי להבטיח הקפאה מלאה ואחידה. יצר תמיסה שמכילה 19.2 מיליגרם למיליליטר טרהלוז ו-4.8 מיליגרם למיליליטר סוכרוז עם בדיקת 60 MN4 DNA לננו-חלקיקי זהב בנפח סופי של 200 מיקרוליטר בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטרים.

הריכוזים הסופיים של תמיסת קריוגן משתנים בהתאם לכיסוי ה-DNA. הקפיאו את הדגימות במהירות באמצעות מקפיא בטמפרטורה של 146 מעלות צלזיוס או בחנקן נוזלי. שמור את הדגימות קפואות עד השימוש.

לעבודה זו, השאירו את הדגימות במקפיא בטמפרטורה של 146 מעלות צלזיוס למשך הלילה ואז העבירו למקפיא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח. מוצגות כאן תוצאות מייצגות של עקומות טיטרציה של נתרן כלוריד עבור ננו-חלקיקי זהב לא מטופלים וחלקיקי זהב שטופלו ב-DNA. ריכוז כלוריד הנתרן ההתחלתי ששימש במבחן נקבע באמצעות טיטרציה.

תוצאות מייצגות של מבחן הצבעוני הננו-חלקיקי אפטמר-זהב עבור קוקאין ומולקולות בקרה מוצגות כאן. הגרפים חושפים את ההשפעה של הגדלת צפיפות כיסוי ה-DNA על שיעור התגובה החיובית השגויה של בדיקת הקוקאין. כאן מוצגים גרפים של עקומת הכיול שהושגו מניתוח פוטואימג'י של מבחן הקוקאין הקולורימטרית.

תמונות שהושגו באמצעות סמארטפונים. תוצאות מייצגות של תגובת הבדיקה של בדיקת ננו-חלקיקי אפטמר-זהב קולורימטרית לקוקאין ומולקולות בקרה מוצגות כאן. הנתונים משווים דגימות שהוכנו טריות לדגימות שהוקפאו עד ארבעה שבועות.

בעת ניסיון בתהליך זה, חשוב מאוד לקבוע את ריכוז כלוריד הנתרן הנכון כדי לייצב את ננו-חלקיקי הזהב ולקדם את שינוי הצבע הטיפוסי בעת הוספת המטרה. אז אחרי שצפית בסרטון הזה, אמור להיות לך הבנה טובה כיצד לפתח בדיקות קולורימטריות ננו-חלקיקי זהב לזיהוי מטרות מעניינות. ניתן להשתמש בגישות המפורטות כאן כדי להפחית את שיעורי התגובה החיובית השגויה ולשמור על הבדיקות שלך בתקיף למשך יותר מחודש.