אימות של Terminators ראפיד שימוש פלסמיד PGR-כחול גולדן גייט האסיפה

המטרה הכוללת של פרוטוקול הביולוגיה הסינתטית היא לקבוע במהירות את פונקציונליות הטרמינטור ולכמת את חוזק הטרמינטור במערכת in-vitro המשתמשת במכלול שער הזהב. פרוטוקול זה משמש לבדיקת סיומות שמצאנו בסיליקו באמצעות ביו-אינפורמטיקה ובדיקתם בסביבה ביולוגית. זה מאפשר אישור מהיר ופשוט של טרמינטורים שזוהו ביו-אינפורמטית בסביבת ספסל מעבדה.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא המהירות שלו. אנו יכולים לעבור מזיהוי ביו-אינפורמטי לאישור ביולוגי תוך פחות משבוע. ובכך אנו יכולים גם לוודא שטרמינטור הוא אכן טרמינטור ואנו יכולים לכמת את חוזק הסיום שלו.

באופן כללי, אנשים יתקשו בתחילה עם טכניקה זו, מכיוון שזה נשמע מנוגד לאינטואיציה להוסיף את אנזים ההגבלה עם ליגאז באותו צינור. עם זאת, אנו משתמשים באנדונוקלאזות הגבלה מסוג 2S ואתר הזיהוי של האנזים נפרד מאתר החיתוך בפועל. ברגע שהטרמינטור נקשר לפלסמיד הכחול pGR, זוהי קשירה קבועה.

עם זאת, על ידי כך שהאנזים המגביל והליגאז נמצאים באותו צינור, עוברים מספר מחזורים, אנו יכולים להשיג יעילות סגירה גבוהה. התחל הליך זה על ידי השעיה מחדש של האוליגונוקלאוטידים הבודדים במים נטולי נוקלאז בריכוז של 100 מיקרומולר, ולאחר מכן הכין מאגר חישול פי 10. לאחר מכן, סמן צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליטר עבור כל טרמינטור שייבדק.

לכל צינור, הוסף 16 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד, 2 מיקרוליטר של מאגר חישול פי 10, ו-1 מיקרו ליטר כל אחד מהאוליגונוקלוטידים של הגדיל העליון והתחתון מהטרמינטורים הרצויים. חשוב מאוד לוודא שלאוליגונוקלוטידים שהזמנת יש את הקצוות הדביקים הנכונים. מכיוון שברגע שהם מחוסלים יחד, חשוב לוודא שהטרמינטור נמצא בכיוון הנכון.

אם הטרמינטור נמצא בכיוון שגוי, pGR כחול לא יוכל לאמת אם הוא מסיים מתפקד. לאחר מכן, הניחו את צינורות המיקרו-צנטריפוגה בציפה והרתיחו אותם במשך ארבע דקות באמבט מים. לאחר ארבע דקות, כבו את צלחת החום אך השאירו את הצינור במים למשך הלילה להתקרר לאט.

אחסן את הסיומות המחוסמות ב-20 מעלות צלזיוס. כדי לבצע דילול של 40 ננו-מולרי של הטרמינטורים המחוסמים, יש להפשיר אותם תחילה על קרח, ואז בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר, להוסיף 124 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, למיקרוליטר אחד של הסיומות המחוסמות. צנטריפוגה את הדגימות למשך 30 שניות בטמפרטורה של 10, 000x גרם.

לאחר הסיבוב, אחסן את הדגימות על קרח. בצינור תרמו-ציקלר חדש המתאים מוסיפים 6 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של מאגר DNA ליגאז מסחרי.

בצע את כל השלבים הבאים על קרח. לאחר מכן, הוסף 1 מיקרוליטר המכיל 35 עד 50 ננוגרם למיקרוליטר של פלסמיד היעד הכחול pGR, 1 מיקרוליטר של 40 ננו-מולרים מחוסמים, 0.5 מיקרוליטר של אנדונוקלאז הגבלת BSA1 מסחרי בנאמנות גבוהה, ו-0.5 מיקרוליטר של DNA ליגאז מסחרי. צנטריפוגה את תערובת התגובה ב-10, 000x גרם למשך 120 שניות.

לאחר מכן הנח את הצינור ישירות בתרמו-סייקלר והפעל את התוכנית הבאה. 20 מחזורים של דקה אחת ב-37 מעלות צלזיוס, ואחריהם דקה אחת ב-16 מעלות צלזיוס ולאחר מכן מחזור אחד של 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הריצה, הקפיאו ואחסנו את הדגימות ב-20 מעלות צלזיוס, או המשיכו מיד לטרנספורמציה.

הפוך את תגובות הקשירה לתאי אי קולי בעלי יכולת כימית באמצעות כל פרוטוקול טרנספורמציה מתאים. כאן, תאי JM109 עוברים טרנספורמציה באמצעות טרנספורמציה zippy.

בעזרת מקל הוקי זכוכית בצורת L, מורחים 25 מיקרוליטר מהתאים שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר LB מחוממות מראש המכילות 1 אמפיצילין מולארי ו-10 מילי-מולארי ארבינוז. דגרו את הצלחות למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. אל תדגרו אותם יותר מ-24 שעות.

אמפיצילין מתכלה במהירות. למחרת, בדוק את צבע המושבות. קשירה מוצלחת צריכה להיות לבנה או צהובה באור נראה, ותזוהר בירוק באור כחול או UV.

קשירה לא מוצלחת תייצר מושבה בצבע כחול באור נראה. עבור כל אחד מהטרמינטורים והבקרות, הכינו מבחנה המכילה 5 מיליליטר מרק LB סטרילי עם 1 אמפיצילין מילי-מולרי ו-10 מילי-מולרי ארבינוז. בעת ביצוע פרוטוקול זה, עם pGR חשוב מאוד לוודא שהבקרות הנכונות קיימות.

השליטה הראשונה צריכה להיות רק מרק LB. הבקרה הבאה צריכה להיות תאים שיש להם עמידות לאמפיצילין, אך אינם זוהרים תחת אור כחול. אלה ישמשו כריק.

הבקרה הבאה היא פלסמיד pGR שאינו נחתך כך שאין לו טרמינטור במקום וזה ישמש כבסיס לחוזק הטרמינטור והאחרון של הצינורות שלך יהיה עבור הדגימה שלך. תחת אור נראה, השתמש בלולאה סטרילית כדי לבחור 2 עד 3 מושבות לבנות או צהובות, ולהעביר אותן למרק LB. אפשר לדגימות לדגור על שייקר ב-37 מעלות צלזיוס ב-160 סל"ד למשך 16 עד 18 שעות.

למחרת, השתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את צפיפות התאים האופטיים של כל דגימה ב-600 ננומטר. בדרך כלל, לאחר פרק זמן זה, צפוי OD 600 של 0.8 עד 1.0. מניחים צלחת באר סטרילית 96 לתוך מכסה המנוע.

עבור כל דגימה או בקרה, הכינו 3 בארות עם 199 מיקרוליטר מרק LB סטרילי עם אמפיצילין וארבינוז. לאחר מכן, פיפטה 1 מיקרוליטר מתמיסת התא ממרק הלילה לבארות בודדות של צלחת 96 הבאר. מלאו את הצלחות בכיסוי נושם ולאחר מכן נערו אותן במשך 18 עד 20 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-160 סל"ד.

למחרת, השתמש בקורא צלחות כדי לקבוע את ה-OD 600, שאמור להיות בערך 0.5. כמו כן, מדוד את הקרינה G של P באורך גל עירור של 395 ננומטר ובפליטה של 509 ננומטר. למדוד פלואורסצנטיות RFP באורך גל עירור של 575 ננומטר ופליטה של 605 ננומטר.

באמצעות Excel, נרמל את השונות בצמיחה על ידי חלוקת התפרחת ב-OD 600. לאחר הנורמליזציה, קבע את חוזק המסיים היחסי על ידי לקיחת הקרינה של מסוף GFP על פני הקרינה של בקרת GFP וחלוקתו בפלואורסצנטיות של מסוף RFP על פני הקרינה של בקרת RFP. תיקון סיומות משוערות T1 עד 6 שזוהו ביו-אינפורמטית במיקרובקטריה, פאג' ברנל 13 נותחו כמתואר בסרטון זה.

תוצאות אלה מראות פלואורסצנטיות יחסית. כל התוצאות נורמלו באמצעות תאים המכילים PGR לא חתוך ולא שונה כביקורת. T3 נמצא כטרמינטור חזק.

כל התוצאות מייצגות מושבות בודדות שגדלו בשלושה עותקים וממוצע לייצוג חזותי. קווי שגיאה מייצגים סטיות בין נקודות נתונים ממוצעות. כדי לקבוע את בקרת הייחוס הטובה ביותר לכימות חוזק המסיים, הושוו נתונים גולמיים באמצעות הפלסמיד המקורי pGR שאינו מכיל טרמינטור, וכחול pGR משובט עם רצף שידוע שאינו טרמינטור.

כפי שניתן לראות כאן, שני הבקרות הראו רמות דומות של ביטוי GFP ו-RFP וחשוב מכך, ייצרו יחסי GFP ל-RFP דומים. כל התוצאות הללו מייצגות מושבות בודדות שגודלו במשולש וממוצע לייצוג חזותי. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להימשך עד 72 שעות כולל זמן משלוח והזמנה.

חשוב לציין שכחול pGR עובד רק ב-e.coli. בנוסף, מכיוון שאנו מסתכלים רק על חלק קטן מהטרמינטור, אין לנו באמת מושג על אלמנטים רגולטוריים אחרים שעשויים לשלוט בתמלול. כדי לאמת את התוצאות שאתה משיג עם פרוטוקול זה באמצעות pGR כחול, ניתן להשתמש בשיטות נוספות כמו PCR כמותי.

בנוסף, ניתן לחתוך את תוספת ה-pGR ולקשור אותה לפלסמיד לבחירתך.