Name: ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: למד שיטת ריצוף RNA ממוקד לאפיון ביטוי גנים וזיהוי מוטציות. השיטה כוללת הכנת ספריות cDNA, היברידיזציה ולכידה באמצעות בדיקות מותאמות אישית, וניתוח נתונים לזיהוי שילובי גנים ושינויים בנוקלאוטיד בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים במיוחד לעזרא ליון, אליוט ז'ו, מישל ווינג, אסקו קאוטו ואריק סמורודניצקי על התמיכה הטכנית. ברצוננו גם להודות לג'ני בדילו על תמיכתה האדמיניסטרטיבית בצוות שלנו. אנו מודים למרכז מחשבי העל של אוהיו (OSC) על מתן שטח דיסק, יכולת עיבוד ותמיכה בהפעלת הניתוחים שלנו. אנו מודים למרכז הסרטן המקיף (CCC) במרכז הרפואי וקסנר של אוניברסיטת אוהיו על תמיכתם האדמיניסטרטיבית בעבודה זו. S.R. והצוות נתמכים על ידי האגודה האמריקאית לסרטן (MRSG-12-194-01-TBG), פרס החוקר הצעיר של הקרן לסרטן הערמונית, NHGRI (UM1HG006508-01A1), קרן פור לחקר הסרטן, איגוד הריאות האמריקאי ופלוטוניה.

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+for+gene+discovery+and+quantification+using+RNA+CaptureSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq.</a> Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).</li>
<li>Maher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+transcript+discovery+by+paired-end+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).</li>
<li>Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+identification+of+genomic+variants+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data.</a> Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).</li>
<li>Quinn, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+strategies+for+SNP+detection+in+RNA-seq+data%3A+application+to+lymphoblastoid+cell+lines+and+evaluation+using+1000+Genomes+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data.</a> PLoS One. 8, e58815(2013).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eSNV-detect%3A+a+computational+system+to+identify+expressed+single+nucleotide+variants+from+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 42, e172(2014).</li>
<li>Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf">http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf</a> (2010).</li>
<li>Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf</a> (2013).</li>
<li>Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf</a> (2013).</li>
<li>Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html">https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html</a> (2012).</li>
<li>Andrews, S. FastQC. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2015).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14, R36(2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Broad Institute. Picard. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> (2014).</li>
<li>DeLuca, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-SeQC%3A+RNA-seq+metrics+for+quality+control+and+process+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization.</a> Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).</li>
<li>Van der Auwera, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+FastQ+data+to+high+confidence+variant+calls%3A+the+Genome+Analysis+Toolkit+best+practices+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChimeraScan%3A+a+tool+for+identifying+chimeric+transcription+in+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data.</a> Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).</li>
<li>Kim, D., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat-Fusion%3A+an+algorithm+for+discovery+of+novel+fusion+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts.</a> Genome Biol. 12, R72(2011).</li>
<li>Fernandez-Cuesta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+fusion+genes+in+lung+cancer+using+breakpoint+assembly+of+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 7(2015).</li>
<li>Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncofuse%3A+a+computational+framework+for+the+prediction+of+the+oncogenic+potential+of+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions.</a> Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+profiling+of+long+noncoding+RNAs+with+targeted+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing.</a> Nat Methods. 12, 339-342 (2015).</li>
<li>Cieslik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exome+capture+RNA-seq+for+highly+degraded+RNA+with+application+to+clinical+cancer+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing.</a> Genome Res. , (2015).</li>
<li>Cabanski, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+hybrid+capture+improves+transcriptome+analysis+on+low-input+and+archived+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples.</a> J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).</li>
<li>Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+screening%3A+from+the+RT-PCR+to+the+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Lung+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq.</a> Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+by+poly+%28A%29+capture%2C+ribosomal+RNA+depletion%2C+and+DNA+microarray+for+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling.</a> BMC Genomics. 15, 419(2014).</li>
</ol>

S.R. מקבלת מימון מנוברטיס ואריאד פרמצבטיקה לביצוע ניסויים קליניים. בני המשפחה הקרובים של ס.ר. מחזיקים במניות בג'ונסון אנד ג'ונסון.

לכידת RNA-seq היא אסטרטגית ביניים בין RNA-seq ו microarray גישות לשערוך חלק נבחר של transcriptome. היתרונות של לכידה כולל עלות מופחתת, זמן אספקה ​​מהיר על ברצף שולחן עבודה, קצב העברת נתונים גבוהים, וזיהוי של שינויים הגנומי. השיטה יכולה להיות מותאמת לאפיין RNAs ללא קידוד 23, לזהות נוקלאוטיד בודד גרסות 4-6, לבחון שחבור, ולזהות בשילובי גן או rearrangements המבני 24. יתר על כן, ניתן ליישם גישה זו דגימות קליניות או מעובד שעברו קיבוע עם בפורמלין מוטבע בב...

Whole transcriptome or RNA sequencing (RNAseq) היא שיטת ריצוף בלתי משוחדת להערכת כל תוצרי ה-RNA. המטרה של RNAseq ממוקד (לכידה) היא הערכה ממוקדת של תעתיקים נבחרים עם רגישות מוגברת, טווח דינמי, עלות או קנה מידה מופחתים ותפוקה מוגברת בהשוואה ל-RNAseq סטנדרטי. בדומה ל-RNAseq סטנדרטי, ניתן להשתמש בגישות העשרה ממוקדות כדי להעריך ביטוי גנים, מיני RNA מרובים כגון mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, RNAs אחרים שאינם מקודדים2, איחוי גנים3 ומוטציות4-6.
לכידה כוללת הכלאה של אוליגונוקלאוטידים משלימים כדי להעשיר ספריות cDNA לריצוף. הרציונל ללכידת RNAseq דומה לגישות מיקרו-מערך שבהן אוליגונוקלאוטידים או בדיקות משלימים מוכלאים לדגימות ולאחר מכן נמדדים לשפע יחסי. עבור טכנולוגיות מיקרו-מערך, הביטוי מבוסס על אות יחסי שנמדד עבור תעתיקים הנקשרים לבדיקות אלה. מיקרו-מערכים מוגבלים אפוא על ידי טווח, רעשי רקע פוטנציאליים מקשירה לא ספציפית והכלאה צולבת של בדיקות. יתר על כן, למערכים יש טווח דינמי מוגבל עבור תעתיקים נמוכים וביטויים גבוהים בהשוואה ל-RNAseq1. מיקרו-מערכים נמצאים בשימוש נרחב בשל עלותם המופחתת ויכולת התפוקה הגבוהה שלהם בהשוואה ל-RNAseq. 
כאן, אנו מדגימים שיטה ללכידת RNAseq המציעה דרך ביניים בין גישות RNAseq ומיקרו-מערך להערכת הטרנסקריפטום. ל-RNAseq Capture יש תפוקה בינונית, טווח דינמי ורגישות גדולים יותר, והוא מותאם לסיבוב מהיר בסיקוונסרים שולחניים. לכידת RNAseq דורשת גם משאבי חישוב מופחתים במונחים של שטח אחסון ועיבוד נתונים.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית אתנול</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock 24 x 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2 (300- מחזורים)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Desktop Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Kit עם RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; אוליגו חוסם אוניברסלי - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; אוליגו חוסם אוניברסלי - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; אוליגו חוסם אוניברסלי - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; XP - חרוזי טיהור PCR&nbsp;</td><td>בקמן-קולטר</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg; M-270 Streptavidin</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT DNA אנושי, דרגה פלואורומטרית, 1 מ"ג</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; שפופרות בדיקה&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; ערכת בדיקה dsDNA HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; ערכות הכלאה ושטיפה של EZ&nbsp; (24 או 96 תגובות)</td><td>רוש נימבלגן&nbsp;</td><td>05634261001 או 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; פלואורומטר 2.0&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 מ"ל IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)</td> <td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr>Water <td>Life Technologies</td><td>ללא נוקלאז</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade; Thermal Cycler עם 96&ndash; מודול תיקון מהיר היטב</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ ערכות הכלאה ושטיפה</td><td>Roche Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcript 200 U/&#956; l</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 מ"ל</td><td>בקמן קולטר בע"מ</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Ladder</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape מאגר דגימה</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 SIDE EACH</td><td>Life Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block מיני</td><td>אמבט יבש מדד</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ריאגנטים</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>ואקופוגה פלוס</td><td>אפנדורף</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ממוקד rna רצף assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

רצף RNA (RNA-seq) הוא שיטה צדדית שיכול להיות מנוצל כדי לזהות ולאפיין ביטוי גנים, מוטציות, בשילובי גן, RNAs noncoding. תקן RNA-seq דורש 30 - 100 מיליון רצף קורא ויכול לכלול מוצרים RNA מרובות כגון mRNA ו RNAs noncoding. אנו מדגימים כיצד ממוקד RNA-seq (לכיד) מתירה מחקר ממוקד על מוצרי RNA שנבחרו באמצעות ברצף שולחן עבודה. לכידת RNA-seq יכולה לאפיין תמלילים ללא ביאור, נמוכים, או זמני הביעו שאחרת עשויה להחמיץ בשיטות RNA-seq מסורתיות. כאן אנו מתארים את החילוץ של RNA מן שורות תאים, דלדול RNA ריבוזומלי, סינתזת cDNA, הכנת ספריות המינימרקטים, כלת לכידתו של תמלילי ממוקד וסדר זמנית על ברצף שולחן עבודה. אנחנו גם להתוות את צינור ניתוח חישובית, הכולל הערכה בקרת איכות, יישור, זיהוי היתוך, כימות ביטוי גנים וזיהוי nuc יחידגרסאות leotide. assay זה מאפשר רצף תמליל ממוקד לאפיין ביטוי גנים, בשילובי גן, ומוטציות.

צעדים מפתח סכמטי הדגשת ב לכידת RNA-seq מוצג באיור 1. ארבע שורות תאי סרטן עם מוטציות ידועות שימשו כדי להדגים את האפקטיביות של טכניקה לכידת RNA-seq (K562 עם פיוז&#39;ן ABL1, LC2 עם פיוז&#39;ן RET, EOL1 עם פיוז&#39;ן PDGFRalpha ו RT- 4 עם פיוז&#39;ן FGFR3). ארבע הדוגמאות היו נקווה יחד להפיק ולרצף עם 2x 100 נ&quot;ב קורא על ברצף שולחן העבודה, אשר מייצר קבצי FASTQ. קבצי FASTQ נוהלו באמצעות צינור ניתוח...

אנו מתארים שיטה מבוססת ריצוף RNA ממוקדת הכוללת הכנת ספריות cDNA באינדקס, הכלאה ולכידה עם בדיקות מותאמות אישית וניתוח נתונים כדי לחקור תעתיקים נבחרים לביטוי גנים, מוטציות ואיחוי גנים. RNAseq ממוקד מאפשר הערכה חסכונית ומהירה של תמלילים נבחרים ברצף שולחני.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

המטרה הכללית של בדיקה זו היא להעשיר תמלילי מטרה עבור ריצוף דור הבא (next generation sequencing). בדיקת ריצוף RNA ממוקדת זו היא הליך רב-שלבי המתחיל בהסרה של RNA ריבוסומלי מתוך RNA כולל, ולאחריה פרגמנטציה כימית וסינתזה של DNA משלים, הכנת ספריות עם ברקודים, היברידיזציה ולכידה של תמלילי מטרה, ריצוף מרובה (multiplexed sequencing), ומסתיים בניתוח נתונים. סרטון זה ידגים את ההליכים להיברידיזציה, לכידת מטרה והגברה באמצעות PCR לאחר הלכידה עבור ארבע דגימות.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה מולקולרית, כגון זיהוי איחודי גנים (gene fusions), וריאציות של נוקלאיד בודד, ביטוי גנים יחסי, ושחלוף חלופי (alternative splicing) המערב תמלילים מטרתיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להתאימה לכל הגנים הרצויים. כדי להתחיל בהליך ההibridiזציה, הוצאו מהמקפיא בטמפרטורה של 20 degrees Celsius והפשיקו על קרח את הרכיבים הבאים: גששים (probes) מותאמים שספגו מים, Cot-1 DNA, אוליגו-חוסמים אוניברסליים, ואוליגו-חוסמים ספציפיים לאדפטור.במבחנה של 1.5 מיליליטר בעלת קישור נמוך, ערבבו 500 ננוגרם של דגימות DNA, 5 מיקרוליטר של Cot-1 DNA, מיקרוליטר אחד של אוליגו-נוקליאוטידים חוסמים אוניברסליים, 0.5 מיקרוליטר של אוליגו-נוקליאוטידים חוסמים ספציפיים למתאם בעל שישה נוקליאוטידים, ו-0.5 מיקרוליטר של אוליגו-נוקליאוטידים חוסמים ספציפיים למתאם בעל שמונה נוקליאוטידים. הניחו את מבחנת הדגימה במרכז ריכוז בוואקום כאשר המכסה פתוח ופונה לכיוון ההפוך לכיוון הסיבוב. ייבשו את התוכן בטמפרטורה של 45 degrees Celsius למשך 20 דקות, או עד לאידוי מלא של הנוזל.בשלב הבא, השביחו מחדש את התוכן המיובש עם 8.5 microliters של 2x hybridization buffer, 3.4 microliters של hybridization component A, ו-1.1 microliter של nuclease-free water. המתינו 10 דקות להשביחה מחדש, תוך ביצוע vortexing בכל 2.5 דקות. העבירו את החומר שהושבח מחדש לתוך מבחורת PCR בנפח 0.2 milliliter ודגרו במכשיר thermal cycler בטמפרטורה של 95 degrees Celsius למשך 10 דקות.הוצא את מבחנת דגימת ההיברידיזציה מהסייקלר התרמי והוסף שני µL של גשושים מותאמים אישית שהומסו מחדש בריכוז של 1.5 pmol/µL. דגרו את תגובת ההיברידיזציה למשך הלילה בטמפרטורה של 65 °C. השלב הבא לאחר היברידיזציה מרובת יעדים (multiplexed hybridization) הוא לכידת RNA ממוקד באמצעות חרוזי פראמגנטים המצומדים לסט렙טאבידין.הוצאו בקבוק חרוזים מטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס והמתינו להגעה לשיווי משקל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הכינו תמיסות עבודה בריכוז 1x של כל הבאפרים הדרושים. העבירו מנה של 140 microliters של באפר שטיפה one בריכוז 1x למבחנה נקייה בנפח 1.5 milliliter.חממו את בופר העליקוט הזה ואת כל הכמות של בופר מחמיר (stringent buffer) 1x בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס בבלוק חימום למשך שעתיים לפחות. העבירו עליקוט של כמות החרוזים המתאימה לשפרופה של 1.5 מיליליטר. הניחו את השפרופה במערכת הפרדה מגנטית ושפכו את הנוזל העליון (supernatant).הוסיפו בופר שטיפת חרוזיים וערבבו ב-vortex למשך 10 שניות. הניחו את המבחנה במעמד ההפרדה המגנטית למשך שתיים עד חמש דקות או עד שהנוזל העליון (supernatant) יהיה שקוף. השליכו את הנוזל העליון.חזור על הפעולה עד לשני שטיפות בסך הכל. לאחר הסרת תמיסת השטיפה של החרוזיים, הוסף נפח של תמיסת שטיפה של חרוזיים השווה לנפח ההתחלתי. השהה מחדש והעבר למס管 PCR בנפח של 0.2 milliliter.הניחו את הפחית במעמד המגנטי למשך שתי עד חמש דקות או עד שהנוזל העליון (supernatant) יהיה צלול. השליכו את הנוזל העליון. הניחו את הפחית עם החרוזים בבלוק חימום מיניטייר בטמפרטורה של 65 °C.העבירו את דגימת ההיברידיזציה לשפופרת עם החרוזים, בצעו שאיבה ושחרור (pipette up and down) 10 פעמים כדי לערבב, והדגירו בטמפרטורה של 65 °C למשך 45 דקות. מדי 15 דקות, ערבבו את הדגימה ב-vortex וסובבו (spin down) למשך ארבע שניות באמצעות מיני-צנטריפוגה שולחנית במהירות קבועה. עם סיום ההדגרה של 45 הדקות, הוציאו את שפופרת הלכידה מבלוק החימום.הוסף 100 µL של wash buffer one 1x שחומם מראש למבחנה, ולאחר מכן ערבל ב-vortex למשך 10 שניות כדי לערבב. העבר את התערובת למבחנה חדשה של 1.5 mL בעלת קישוריות נמוכה (low-binding). הנח את המבחנה במערך המגנטים והמתן שתיים עד חמש דקות להפרדה, או עד שהנוזל העליון (supernatant) יהיה צלול.שפכו את הנוזל העליון. הוסיפו 200 µL של בופר שטיפה מחמיר 1x שחומם מראש, ושאבו עם פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב. דגרו בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות.הניחו את המבחנה במעמד המגנטי והמתינו שתי עד שלוש דקות להפרדה. השליכו את הנוזל העליון. חזרו על השטיפה הקפדנית פעם נוספת, לסך הכל שתי שטיפות.הוסיפו 200 µL של 1x wash buffer one בטמפרטורת החדר וערבלו במכשיר vortex למשך שתי דקות כדי להומיס. הניחו את המבחנה במגנט, המתינו שתי עד חמש דקות להפרדה, והשליכו את העל-משקע. הוסיפו 200 µL של 1x wash buffer two בטמפרטורת החדר וערבלו במכשיר vortex למשך דקה אחת כדי להומיס.יש להניח את המבחנה במערך הפרדה מגנטית למשך שתיים עד חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את הנוזל העליון (supernatant). יש להוסיף 200 microliters של 1x wash buffer three בטמפרטורת החדר ולערבל במכשיר vortex למשך 30 שניות. יש להניח את המבחנה במערך הפרדה מגנטית למשך שתיים עד חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את הנוזל העליון.לבסוף, הוציאו את המבחנה ממעמד ההפרדה המגנטית והוסיפו 20 µL של מים נקיים מנוקליאוז כדי לסספנד מחדש את החרוזים. ערבבו היטב על ידי פיפטור מעלה ומטה 10 פעמים. לפני ביצוע הגברת ה-PCR לאחר הלכידה, הוציאו את החרוזים הפרה-מגנטיים מטמפרטורה של 4 °C והמתינו 30 דקות להגעה לשיווי משקל בטמפרטורת החדר.הוצא את תערובת ה-2x hot start PCR ready mix ואת תערובת הפריימרים ל-PCR מהמקפיא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, הפסק את הקפאתם בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הנח אותם על קרח. הכן תערובת מאסטר להגברת הספריה על ידי שילוב של 27.5 µL של 2x hot start PCR ready mix,‏ 2.75 µL של PCR primer one ו-2.75 µL של PCR primer two. הכן את התגובה בפסולת PCR על ידי הוספת 20 µL של חרוזים עם DNA לכוד יחד עם 30 µL מתערובת המאסטר להגברת הספריה.סגור את המבחנה כראוי וערבב באמצעות וורטקס. סבב את המבחנה בצנטריפוגה שולחנית קטנה במהירות קבועה למשך ארבע שניות ב-6$\times$g. הכנס את המבחנה למכשיר ה-thermal cycler והפעל את הגברת ה-PCR באמצעות תוכנית ה-PCR הבאה: דנטורציה ראשונית ב-98 °C למשך 45 שניות, 10 עד 12 מחזורים של דנטורציה ב-98 °C למשך 15 שניות, אינוילציה (annealing) ב-65 °C למשך 30 שניות, והארכה (extension) ב-72 °C למשך 60 שניות.מחזור הארכה סופי אחד ב-75 °C למשך 60 שניות, ושמירה ב-4 °C. עם סיום ה-PCR, הוצא את הדגימה מהמעגל התרמי (thermal cycler). הוסף 75 µL של חרוזי פראמגנטיים, ערבב היטב, והדגר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.הניחו את המבחנה במגנט למשך שתי עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו את הנוזל העליון. שטפו את החרוזים על המגנט על ידי הוספת 200 µL של אתנול 80%, דגירה למשך 30 שניות, ולאחר מכן הסרת הנוזל העליון. חזרו על הפעולה עד לשני שטיפות בסך הכל.לאחר הסרת הנוזל העליון משטיפת האתנול השנייה, הדגרימו בטמפרטורת החדר למשך חמש עד עשר דקות כדי לאפשר לחרוזי הניגוריה להתייבש, אך הימנעו מייבוש יתר שעלול להוביל לסדקים. השעיקו מחדש את החרוזים ב-22 µL של Tris-EDTA pH 8.0 והמתינו שלוש דקות לאלוציה. הניחו את הדגימה על המגנט למשך שלוש עד חמש דקות.לבסוף, העבירו 20 µL מהמוצר שנשטף (eluted product) לתוך מבחנה נקייה של 1.5 mL בעלת קישור נמוך (low-binding), תוך וידוא ששום חרוז לא הועבר. השוואת ביטוי גנים בין שיטת הלכידה (capture method) לבין ריצוף RNA לא מכוון בארבעה קווי תאי סרטן גילתה כי שיטת הלכידה העשירה גנים ממוקדים, המופיעים בכחול, פי 10 עד 1000 לעומת גנים לא ממוקדים, המופיעים באפור. בנוסף, אחוז הקריאות הממשיכות לאזורים ממוקדים היה גבוה יותר בספריות ריצוף RNA של לכידה לעומת ריצוף RNA לא מכוון.הערכה של מדדי בקרת איכות הראתה כי ריצוף RNA בשיטת capture וריצוף RNA שאינו ממוקד (non-targeted) מניבים תוצאות דומות מבחינת יישור (alignment) לטרנסקריפטום וגודל המקטע (insert size) העיקרי. בשימוש בשיטת ה-capture, אחוז גבוה יותר של אזורים אקסוניים ואחוז נמוך יותר של אזורים אינטרוניים עברו ריצוף. כצפוי, ריצוף RNA שאינו ממוקד הניב פי 50 יותר קריאות ריצוף כוללות לדגימה מאשר שיטת ה-capture.בשימוש בשיטת הלכידה (capture), אחוז רצפי ה-RNA הריבוסומלי הנוכחים בכל דגימה היה נמוך יותר. לבסוף, השוואות של וריאנטים של נוקליאוטיד בודד (single nucleotide variants) שזוהו באזורים חופפים של לכידה ושל רצף RNA עבור כל אחד מארבעת קווי התאים, מעידות על הלימה גבוהה של השונות בין לכידה לרצף RNA בתוך אזור המטרה. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה תוך שלושה עד ארבעה ימים, אם היא מבוצעת כהלכה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד במהירות במהלך לכידת המטרות ההיברידיות ולהבטיח שהתגובה תישאר בטמפרטורה של 65 °C. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה המולקולרית ללימוד תמלילים רלוונטיים בשיטה בעלת תפוקה גבוהה ובעלות אפקטיבית.

targeted-rna-sequencing-assay-to-characterize-gene-expression-genomic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ולכידת אקסון הבא המבוסס על הכלאה לזיהוי של מוטציות סרטן קשור מפתח בדגימות גידול קליניים על ידי רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי. רצף אקסון ממוקד מציע יתרונות של תפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מניב רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

ניתוחי RNA-רצף וביואינפורמטיקה שמשו לזהות גורמי שעתוק הביעו באופן משמעותי ואופן דיפרנציאלי בתת אוכלוסיות לין-CD34 + ולין-CD34- של EMLcells עכבר. גורמי שעתוק אלו עשויים לשחק תפקיד חשוב בקביעה לעבור בין תאי לין-CD34- לין-CD34 + ומובחן באופן חלקי עצמי חידוש.

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

כאן, אנו מתארים בחיי עיר הכלאה assay המאפשרת זיהוי רגיש וספציפי של רצפי קצר ככל נוקלאוטידים 50 עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ברמת תא בודד. וזמינותו, אשר יכול להתבצע באופן ידני או אוטומטי, באפשרותך לאפשר ויזואליזציה של גרסאות splice, רצפים קצרים מוטציות בתוך ההקשר רקמות.

וריאציות גנטיות להמחיש מטרות קצרות, מוטציות נקודה בהקשר רקמות מורפולוגי עם RNA בחיי עיר Assay הכלאה

miRNA הרפוי יש פוטנציאל משמעותי בוויסות התקדמות סרטן. המודגמות כאן גישות אנליטיות משמשים לצורך זיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורית להפסקת מחזור התא, אנגיוגנזה.

ניתוח של miRNA קומבינטורית טיפולים כדי להסדיר מחזור התא, אנגיוגנזה

כאן, המחברים מציגים את התועלת של MULTI-seq עבור פנוטיפ והצמד הבא scRNA-seq ו- scATAC-seq באפיון פרופילי הנגישות של תעתיק וכרומטין ברשתית.

ניתוח מרובב של ביטוי גנים ברשתית ונגישות כרומטין באמצעות scRNA-Seq ו- scATAC-Seq

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע נוקאאוטים של גנים שהם in vivo קטלניים עובריים בגידולים שמקורם במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ולאחר מכן מעריכים את ההשפעה שיש לנוקאאוט על צמיחת הגידול, התפשטותו, הישרדותו, הגירה, פלישה, והתעתיק in vitro ו- in vivo.

הגדרת תפקודי גנים בגידולים סרטניים על ידי אבלציה Ex vivo של אללים פלוקסים בתאי גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג'ין מערכת MXCell electroporation.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

למד שיטת ריצוף RNA ממוקד לאפיון ביטוי גנים וזיהוי מוטציות. השיטה כוללת הכנת ספריות cDNA, היברידיזציה ולכידה באמצעות בדיקות מותאמות אישית, וניתוח נתונים לזיהוי שילובי גנים ושינויים בנוקלאוטיד בודד.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

גלה סרטונים נוספים