סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

המטרה הכוללת של שיטת מיקרו-דפוס מבוססת שבלונה זו, עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, היא לספק אמצעי פשוט וחזק ליצירת שיפועים סביבתיים מרחביים השולטים בדפוסי התמיינות תאי גזע. שיטה זו יכולה לעזור לך לענות על שאלות מפתח בדפוסי רקמות באמצעות מודל תאי גזע אנושיים, כגון כיצד שיפועים מרחביים בכוחות הידבקות של תא תא ומטריצת תא יכולים לעזור לארגן גורלות התמיינות של תאי גזע. היתרון בשיטה זו הוא שהיא אינה דורשת שינוי משטח נוסף כדי ליצור דפוסי ECM דביקים לתאים לחיבור אליהם.

המשמעות היא שהשיטה תואמת לתצורות ECM ומצע שונות, ספציפיות לכל קו תאים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי המיקרו-דפוס. כי זה דורש טיפול מדויק וזהיר בשבלונה ובתאים.

לצורך הליך זה, יש לתכנן ולייצר את שבלונות ה-PTMS. כמו כן, יש תאי EFC אנושיים הגדלים על מטריצת קרום הבסיס, כך שהמושבות יהיו מוכנות לזריעה בהמשך ההליך. כדי להתחיל, העמיסו צלחת עם 700 מיקרוליטר של אתנול בדרגה אנליטית של 70%, במים טהורים במיוחד.

לאחר מכן, הניחו את שבלונה ה-PDMS על התמיסה, והכניסו את הכלי לארון בטיחות ביולוגית לייבוש למשך הלילה. למחרת, בדוק שלא נוצרו בועות מתחת לשבלונה. לאחר מכן, יש לזרוע את המנה עד שניתן לזרוע את התאים על השבלונה.

הכן כמות גדולה של מטריצת ממברנת מרתף אנושית באיכות ESC על ידי הוספת 16.7 מיליליטר של DMF12, כדי ליצור תמיסה פי 1.5 ולשמור אותה על קרח. טפל במצע עם 100 וואט פלזמת חמצן למשך 90 שניות. אל תפתחו את הכלי עד שהוא נמצא בתוך תא הפלזמה, וכסו אותו במהירות לאחר הטיפול.

טיפול זה ימנע היווצרות בועות כאשר המצע טובל בתמיסה. כעת, כסו את השבלונה ב -450 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת קרום מרתף מוכנה פי 1.5. לאחר מכן, אטמו את המנה עם פרפילם ודגרו אותה למשך חמש שעות.

לפני שתמשיך, בדוק את שש לוחות הבאר של מושבות HESC מוכנות. לזהות ולשאוף ממושבות של תאים מובחנים שאיבדו את מורפולוגיה ה-HESC האופיינית להם. כולם צריכים להיראות מעוגלים, בעלי מורפולוגיה אפיתלית צפופה, ובעלי יחס גרעין לציטופלזמה גבוה עם גרעינים בולטים.

לאחר מכן, שטפו כל באר של תאים מצופים עם שני מיליליטר של DMF12 פעמיים. לאחר השטיפה השנייה, הוסיפו מיליליטר אחד של אנזימי עיכול לכל באר, כמו אקוטאז ודגרו על הצלחת למשך שמונה דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק את כל המושבות מהמצע.

לאחר מכן, יש לשטוף כל באר עם לפחות ארבעה מיליליטר מדיה עבור כל מיליליטר של אנזים עיכול המופעל על הבאר, ולאסוף את תרחיפי התאים לצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים ב-200 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר ליצירת כדור תא. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים ב-400 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה HESC, בתוספת 10 מיקרו-מולרי של מעכב סלע.

יש לשלש את התאים בעדינות שלוש פעמים כדי לפרק את הגושים. לאחר מכן, תקן את צפיפות המתלים. מערבבים אותו היטב, ויוצרים דילול של 200 מיקרוליטר 1:20 במדיה.

ספרו את התאים בדילול באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, יש לדלל את המתלה הראשי לפי הצורך, באמצעות מדיה עם מעכב סלע. כדי להמשיך, הוסף את מספר התאים הנדרש לכל שבלונה מוכנה.

יש להפקיד רק שכבה אחת של תאים, לכן פזרו אותם באופן שווה. הניחו לשבלונה לשבת ללא הפרעה במשך חמש דקות, כדי שהתאים יוכלו להתייצב. לאחר מכן, העבירו בזהירות את השבלונות העמוסות לחממה, תוך שמירה על הכלים ברמה לאורך כל ההעברה.

תן לתאים להיצמד לשבלונות במשך דגירה של שעה. לאחר שהתאים הורשו להיצמד, בחנו אותם במיקרוסקופ כדי לוודא שהם עשו זאת כראוי. העבירו את השבלונה בחזרה למכסה המנוע, ושאבו את התאים הלא מחוברים מהסטנסיל.

לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של חומר פעילי שטח לא יוני תואם 0.5% ב-DMF12 לאזור המקיף את השבלונה. סובבו את התמיסה כדי לכסות את השבלונה. לאחר מכן, השתמש בזוג מלקחיים חיטוי כדי לקלף בעדינות את השבלונה מהמנה.

לאחר הסרת השבלונה, בדוק את תאי המיקרופטרנד תחת מיקרוסקופ. חומר פעילי השטח הלא יוני מונע התאים הללו להתייבש. תנו לתאי המיקרו-פטרנד לדגור בתמיסת המדיה בתוספת פעילי שטח למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 10 דקות, שאפו את התמיסה ושטפו את הצלחת בשני מיליליטר של מדיום DMF12 רגיל, שלוש פעמים. לאחר השטיפות, הוסף שני מיליליטר של מדיום תחזוקה HESC עם מעכב סלעים. שוב, בדוק את התאים כדי לבדוק שהמיקרו-תבניות נוצרו כראוי.

לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, שאפו את המדיום, שטפו את התאים פעם אחת עם DMF12, ולאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של מדיום התמיינות משלים, כדי לגרום לתאים לעבור התמיינות מזואנדודרם. מאוחר יותר, נתח את התוצאות.

ייצור שבלונה התא באמצעות חותך לייזר, סיפק תכונות של 1000 מיקרון. השבלונה הייתה מורכבת מיריעת שבלונה דקה עם מיקרו-דפוס דרך חורים, ואטם PDMS ששימש להכיל את התאים. באמצעות כלי זה, נחקרו HESCs מיקרו-פטרניים במהלך התמיינות מזואנדודרם.

להיקפי מושבת H9-HESC יש הידבקויות אינטגרין גבוהות יותר מאשר לתאים בפנים המושבה. לפיכך, התאים מתמיינים לתאי מזואנדודרם חיוביים ל-T, כאשר הם מושרים עם activan, BMP4 ו-FGF2. כאשר תאים כאלה עוצבו לחד-שכבות של גיאומטריות שונות, זוויות ישרות גיאומטריות ואיזוטרופיות ובעקמומיות קמורות, הובילו לריכוז מקומי של כוחות משיכה בתיווך אינטגרין, והביאו להתמיינות מוגברת של מזואנדודרם.

עוצמת ביטוי T במקומות שונים בתוך מושבה אחת הראתה כי היקף האינדוקציה של אנדודרם מזו אכן היה גבוה יותר בפינות חדות של מושבות מרובעות ומלבניות, ובעקמומיות הקמורות של קשת חצי עגולה. זה מדגים שניתן לווסת כוחות מכניים בתיווך הידבקות תאים באמצעות השיטה המתוארת. לפני שתנסה את ההליך, חשוב לייעל את זמן ציפוי המטריצה, עיכול התאים וזמן ההצמדה, עבור קו תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים הספציפי איתו אתה עובד.