משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתכנן מערכת אספקה שיכולה להעביר תרופות מולקולות קטנות כמו siRNA למוח. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הניוון העצבי, כגון האם siRNA הוא אופציה טיפולית בת קיימא למחלות קיפול חלבונים? והאם אנחנו יכולים לתכנן מערכת אספקת תרופות אמינה למוח?

היתרון העיקרי ביצירת מערכת אספקת תרופות ליפוזומלית הוא שאנו יכולים להעביר את ה-siRNA שלנו דרך הווריד או דרך זרם הדם ולא ישירות דרך רקמה עצבית, מה שגורם לנזק עצבי. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפולים ואבחון של מחלות נוירודגנרטיביות מכיוון שטכניקה זו מאפשרת העברה ספציפית דרך מחסום הדם-מוח, במיוחד לנוירונים המבטאים אצטילכולין. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד הזרקות וריד זנב עכבר בשל גודלו הקטן של וריד זנב העכבר.

התחל בהכנת יחס DOTAP לכולסטרול אחד לאחד. להכנת ליפוזום מבעלי חיים זרים, ערבבו שתי ננומול של DOTAP ושני ננומול של כולסטרול לעשרה מיליליטר של תמיסת כלורופורם אחד לאחד למתנול. לאחר מכן, תאדו תשעה מיליליטר מתמיסת הכלורופורם והמתנול באמצעות גז חנקן.

אידוי המיליליטר האחרון של ממס במכסה אדים למשך הלילה ללא גז. למחרת, סרט שומנים דק אמור להיות גלוי בתחתית הבקבוק. מחממים גם את הבקבוק הזה עם סרט השומנים וגם עשרה מיליליטר של תמיסת סוכרוז של עשרה אחוזים ל-55 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, פיפטה איטית את תמיסת הסוכרוז המחוממת על סרט השומנים הדק תוך כדי סיבוב עדין של הבקבוק. לאחר מכן, הרכיבו מכבש עם פילטר מיקרון אחד לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד מתרחיף הליפוזום המחומם לאחד המזרקים במכבש.

לאחר מכן העבירו את המתלה בין שני המזרקים 11 פעמים. תוך שמירה על תרחיף הליפוזום מחומם לגודל קל יותר, גודל את הליפוזומים דרך 45 מיקרון ומסנן 2 מיקרון כדי ליצור שלפוחיות גדולות וחד פעמיות, לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר מתרחיף ליפוזום ארבעת הננומול ל-200 מיקרוליטר של תמיסת siRNA של 20 מיקרומולר ולדגור במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסיפו 80 מיקרוליטר של מלאי 500 מיקרו-מולרי של RVG-9R המכוון פפטיד לתמיסת הליפוזום siRNA ודגרו במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.

הכן תרחיף ליפסומו של בעלי חיים זרים על ידי ערבוב של 2.2 ננומול של DSPE או DOTAP לעשרה מיליליטר של תמיסת כלורופורם למתנול שניים לאחד עם 1.6 ננומול של כולסטרול ו-2 ננומול של יתד DSPE. לאחר מכן, מרחו גז חנקן וכאשר רוב הממס התאדה, השאירו את הבקבוק במכסה האדים למשך הלילה. לאחר מכן, הוסיפו לאט עשרה מיליליטר של 1X PBS המחומם ל-75 מעלות צלזיוס לסרט השומנים הדק.

הניחו לשומנים להתייבש בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני הגודל. לאחר גודל תרחיף הליפוזום באמצעות מכבש כמו קודם, פיפטה 20 מיקרוליטר מכל אחד מארבעת מתלי הליפוזום הננומול לתוך שימוש חד פעמי וליופיליזציה למשך 30 דקות באמצעות מייבש הקפאה על ספסל. לאחר מכן, הוסף 1.4 מיקרוליטר של תמיסה מיקרו-מולרית של 26.6 של פרוטמין סולפט ל-200 מיקרוליטר של תמיסת siRNA של 20 מיקרו-מולרית ודגירה במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר כדי לעבות את ה-siRNA.

לאחר הדגירה, יש להחזיר לחות DSPE עם 201.4 מיקרוליטר של תמיסת פרוטמין siRNA. הרטיבו את פלטות ה-DOTAP עם 200 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של בעלי חיים זרים של siRNA. דגרו על כל תמיסת siRNA ליפוזום למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף עשרה מיקרוליטרים של תמיסת EDC של 60 מילי-מולרית לכל צינור של ליפוזומים מיובשים. לאחר מכן הוסף עשרה מיקרוליטרים של תמיסת סולפו-NHS של 150 מילי-מולרית לתמיסת ה-siRNA הליפוזומית עבור פלטות DOTAP ו-DSPE כאחד. דוגרים שעתיים בטמפרטורת החדר.

לבסוף, הוסיפו 80 מיקרוליטר של 500 מיקרו-מולרים של פפטיד RVG-9R לתמיסת הקישור הצולב של ליפוזום siRNA ודגרו במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הרדמת עכבר באמצעות שניים עד שלושה אחוזים איזופלורן בחמצן, יש לכסות את עיני העכבר במשחה אפלמולוגית ולאשר הרדמה על ידי ביצוע צביטה בבוהן. המשך רק אם אין תגובה.

תוך כדי שמירה על הרדמה, הנח את העכבר על גבו או על צדו כדי לגשת לווריד הזנב. נגב את הזנב עם 70 אחוז אתנול ולאחר מכן השתמש במזרק אינסולין בגודל 26 כדי להזריק 300 מיקרוליטר של LSPCs או פלטים לווריד הזנב. התחל להזריק דיסטלי וזז קרוב אם הווריד קורס או נקרע.

הנח את העכבר בכלוב נקי עד שהוא שומר על שכיבה עצם החזה. עקוב אחר בעל החיים במשך מספר שעות לאחר ההזרקה כדי לוודא שההרדמה מתפוגגת ואין תופעות לוואי של הטיפול. לאחר שאפשרתם ל-LSPCs או לפלטים להסתובב במשך 24 שעות לפחות ולאחר מכן המתת חסד של העכבר, נתחו חצי חצי כדור של המוח.

לאחר מכן הנח את חצי הכדור ו-2.5 מיליליטר של מאגר פקס על מסננת תאי רשת של 40 מיקרון והשתמש בבוכנה של מזרק כדי ללחוץ את הרקמה דרך המסנן לתוך צלחת פטרי. שטפו את מסננת התאים וצלחת הפטרי עם 2.5 מיליליטר נוספים של מאגר פקס. לאחר מכן העבירו את מתלה התא היחיד לצינור חרוטי של 15 מיליליטר והניחו על קרח.

לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-350 פעמים G.לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מאגר פקס וצנטריפוגה שוב. לאחר מכן, הוסף עוד מיליליטר של מאגר פקס והנח את מתלה התא על קרח. כעת, דגרו את התאים ב-100 מיקרוליטר של בלוק Fc נגד עכברים של חולדות במאגר פקס למשך 30 עד 60 דקות על קרח.

לאחר הגלולה והכביסה כמו קודם, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית פלואורסצנטית והניחו על קרח למשך 30 עד 60 דקות. לאחר שטיפה אחרונה, השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מאגר ליזה RVC למשך דקה אחת. לאחר מכן, גלולה את התאים.

לאחר השלכת המאגר, יש להשעות מחדש מיליליטר אחד של מאגר פקס ולהניח על קרח. התאים מוכנים כעת לניתוח פקס. עכברים שטופלו ב-siRNA המועבר באמצעות LSPCs הראו ירידה משמעותית ברמות חלבון פריון תאי בהשוואה לבקרת PBS המראה רמות חלבון פריון תאי.

העכברים שטופלו ב-LSPCs הראו רמות חלבון פריון תאי קרובות לאלו של חלבון פריון נוק אאוט. בשלושה ניסויים, עכברים שטופלו ב-LSPCs הראו ירידה משמעותית ברמות חלבון פריון תאי בהשוואה ל-PBS בזמן ביקורת הסוג. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שניתן לאחסן את הליפוזומים במקרר למשך מספר חודשים, אך יש להשתמש ב-LSPCs השלמים תוך 24 שעות לאחר ההרכבה.

לאחר פיתוחו, יצירת LSPCs או פלטים תסלול את הדרך לחוקרים לחקור אפשרויות טיפוליות נוספות בתחום המחלות הנוירודגנרטיביות.