פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את ההערכה התפקודית של ספריות מוטגנזה מקיפות של חלבונים באתר יחיד, תוך שימוש בריצוף תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביוכימיה והאבולוציה המולקולרית. כגון, מהם האילוצים הביוכימיים המבניים והאבולוציוניים על חלבונים?

וכיצד נוכל להנדס חלבונים עם פונקציות חדשות? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ממקסמת מספר קריאות ריצוף שימושיות במחקר מוטגנזה של רוויה של חלבון שלם, על ידי ריבוי בנייה וריצוף של ספריות. לאחר הכנת צלחת של PCR Master Mix על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 10 מיקרוליטר מלוחות 96 הבארות המכילים את פריימרים למוטגנזה חושית שדוללו בעבר לבארות הקוגנטיות בלוחות ה-PCR.

השתמש בחותם צלחת כדי לכסות כל צלחת PCR, וצנטריפוגה ב-200 גרם למשך שתי דקות. לאחר מכן, העבר את לוחות ה-PCR ל-thermocycler, והפעל את התוכנית הבאה. לאחר ביצוע PCR נוסף ודילול התגובות, אחד ל-100, העבירו מיקרוליטר אחד ממוצרי ה-PCR המוטגניים המעורבים והמדוללים בסיבוב הראשון, לבארות המקבילות של לוחות PCR חדשים המכילים Master Mix.

השתמש בחותם צלחת כדי לכסות כל לוחית PCR. צנטריפוגה את הצלחות בכ -200 גרם למשך שתי דקות. לאחר מכן העבירו את הלוחות ל-thermocycler, והפעילו את אותה תוכנית שצוינה קודם לכן בסרטון.

לאחר אימות גדלי מוצרי ה-PCR, ומדידת הריכוזים לפי פרוטוקול הטקסט, ערבבו 100 ננוגרם מכל מוצר PCR של תת-ספריית NNS לחמש קבוצות תת-ספריות NNS. לאחר הפעלת תגובות PCR תת-ספריות ועיכול וקטורי שיבוט בתגובות ה-PCR, על פי פרוטוקול הטקסט, הגדר תגובות קשירה בהתאם להנחיות אלה עבור כל קבוצת תת-ספריית NNS מעוכלת, עם וקטור השיבוט המעוכל של ההגבלה הקוגנטית שלה. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר הפשרת תאי E.coli, הוסיפו עשרה מיקרוליטרים של תאים לכל תגובת קשירה מטוהרת, והעבירו לקובטה חשמלית. אלקטרו-פרואט את התאים ב-1.8 קילו-וולט, ואז הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום SOB ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, השעו מחדש 10 מיקרוליטר מכל תרבית התאוששות ב-990 מיקרוליטר של LB. ומורחים 100 מיקרוליטר על צלחות מקדחה LB המכילות 12 מיקרוגרם למיליליטר טטרציקלין.

לכל תרבית התאוששות, הכינו בקבוק תרבית של 250 מיליליטר עם 50 מיליליטר LB ו-50 מיקרוליטר מלאי טט. העבירו את הנותר כמיליליטר אחד של תרבית התאוששות לבקבוקון. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך הלילה.

לאחר ספירת מספר הטרנספורמנטים המוצלחים על הצלחות, ובידוד ה-DNA של הפלזמה מתרביות הלילה, מערבבים יחד 100 ננוגרם מכל פלסמיד. לאחר הפיכת ספריית ה-DNA בהתאם לפרוטוקול הטקסט, יש לדלל את תרבית הלילה של הספרייה ל-OD-600 השווה ל-0.1. ולהוסיף מיליליטר אחד לבקבוק אחד.

דגרו את תרבית הבחירה המוקדמת ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. עקוב מעת לעת אחר הגידול על ידי מדידת OD-600, עד שהוא שווה ל-0.1. העבירו 100 מיליליטר מתרבית הבחירה המוקדמת לשני צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר, וצנטריפוגה ב -4, 000 גרם למשך שש דקות, בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את רוב הסופרנטנט ושלב את הכדורים לצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר. לאחר מכן, לאחר חזרה על הצנטריפוגה, הסר את כל הסופרנטנט. לשתי הצלוחיות האחרות יש להוסיף טטרציקלין לריכוז סופי של 12 מיקרוגרם למיליליטר.

ונפח של תרבות הבחירה המוקדמת, כך שה-OD-600 הסופי שווה ל-0.001. לבקבוק אחד מוסיפים מיליליטר אחד של 50 מיליגרם למיליליטר אמפיצילין בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר. זוהי תרבות הבחירה.

בזמן הדגירה של התרביות ב-37 מעלות צלזיוס ב-200 סל"ד, עקוב אחר צמיחת התרבית שאינה מכילה אמפיצילין עד שהיא מגיעה ל-OD-600 השווה ל-0.1. מדוד גם את ה-OD-600 של תרבות הבחירה. לאחר חלוקת ה-OD-600 של תרבית הברירה ל-0.1, והכפלה ב-100, העבירו את הנפח הזה לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר, וצנטריפוגה ב-4,000 G וארבע מעלות צלזיוס למשך שש דקות.

אחרי שסילקתם את רוב הסופרנטנט, שלבו את הכדוריות לתוך שפופרת אחת לפני שתסובבו שוב ותסירו את כל הסופרנטנט. כדי לבצע ריצוף בתפוקה גבוהה, הכינו PCR Master Mix והעבירו 23 מיקרוליטר ל-10 צינורות PCR. הוסף מיקרוליטר אחד של 0.5 ננוגרם למיקרוליטר של DNA פלסמיד מטוהר מתרבית הבחירה המוקדמת לצינורות אחד עד חמש.

ומתרבות הבחירה לצינורות 6 עד 10. מערבבים יחד 50 מיקרוליטר של 50 פריימרים מיקרו-מולאריים-אורתוגונליים, OP1F עד OP5F, עם הפריימרים האורתוגונליים ההפוכים בהתאמה, OP1R עד OP5R. באותו סדר, העבירו מיקרוליטר אחד לצינורות PCR אחד עד חמש, ושישה עד 10.

העבר את צינורות ה-PCR ל-thermocycler, והפעל את התוכנית הבאה. לאחר מכן, יש לדלל את תגובות ה-PCR פי 100, על ידי העברת מיקרוליטר אחד מכל צינור ל-99 מיקרוליטר מים. מערבבים היטב, ואז פיפטה 99 מיקרוליטר מהצינורות, וזורקים.

מערבבים יחד 50 מיקרוליטר של הפריימרים הקדמיים, והפוכים בהתאמה. לאחר מכן, העבירו מיקרוליטר אחד לצינורות ה-PCR אחד עד חמש, ושישה עד 10. לאחר מכן, לאחר הכנת PCR Master Mix, הוסף 23 מיקרוליטר לכל צינור PCR, והפעל את התוכנית הבאה.

כדי לבצע את ה-PCR הסופי להוספת רצפי אינדקס, לאחר דילול תגובות ה-PCR פי 100, כמו קודם, ושמירה על מיקרוליטר אחד, הוסף 23 מיקרוליטר של PCR Master Mix. עבור צינורות עם תבנית שמקורה בקבוצות תת-ספריות NNS אחת עד חמש, הוסף 0.5 מיקרוליטר של פריימרים קדמיים 501F עד 505F, בהתאמה. עבור צינורות עם תבנית הנובעת מתרבויות הבחירה המוקדמת והבחירה, הוסף 0.5 מיקרוליטר של פריימרים הפוכים 701R ו-702R.

הפעל את אותה תוכנית PCR כפי שצוין זה עתה. לאחר מכן, לאחר מדידת הריכוזים של כל תגובה על פי פרוטוקול הטקסט, מערבבים 100 ננוגרם מכל מוצר PCR לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד. לאחר הוספת צבע טעינת ג'ל 6X, טען את דגימת ה-PCR המשולבת כולה על ג'ל אגרוז של שני אחוזים.

והפעל את הג'ל ב 100 וולט, למשך 50 דקות. בעזרת תאורת UV באורך גל ארוך, דמיין ולאחר מכן כרת את הפרוסה המכילה את תוצר ה-PCR של כ-360 זוגות בסיסים. לטהר, לרצף ולנתח את הדגימה בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

מפת הפלסמיד עבור חמשת הפלסמידים pBR322 ששונו המכילים אתרי תחול אורתוגונליים מוצגת כאן. בדיקת הספציפיות של הפריימרים האורתוגונליים באמצעות PCR, הראתה כי תוצר ה-PCR הנכון הושג רק כאשר הפלסמיד התואם נכלל בתגובה. ושום מוצר בשום גודל לא הושג בהיעדרו.

לאחר עיבוד הניסוי, התקבלו 6.2 פעמים 10 עד הקריאות השישית מתנאי הבחירה המוקדמת, ו-6.3 פעמים 10 עד השישית ממצב האמפיצילין. הספירה עבור כל מוטציה של חומצת אמינו ממצב הברירה המוקדמת מציגה התפלגות לוג-נורמלית. איור זה מתאר את אפקט הכושר היחסי, FIA, עבור כל מוטציה בכל מיקום של TEM-one.

ותפוצתו מוצגת כאן. תחת סלקציה של 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, לרוב המוטציות יש אפקט כושר ניטרלי, או כמעט ניטרלי. מקביל לפיקסלים הלבנים כאן, ולפסגה הגדולה כאן.

לחלק קטן מהמוטציות בריכוז האנטיביוטיקה הזה יש השפעות משמעותיות על הכושר. כצפוי, אלה כוללים מוטציות בתוך שאריות האתר הפעיל השמור ביותר. לעומת זאת, פיקסלים מעטים נראים אדומים באופן משמעותי.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשבוע. אם זה מבוצע כראוי, וכל הריאגנטים זמינים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להישאר מאורגן במהלך השיבוט כדי לשלב את תוצרי ה-PCR המוטגניים לקבוצות הנכונות, ולשכפל לווקטורים נכונים.

ובמהלך הכנת הרצף, להשתמש בפריימרים הנכונים. בהמשך להליך זה, ניתן לשנות את השלבים העיקריים של הפרוטוקול כדי לבחון שילובי מוטציות, סביבות ברירה שונות ומערכות חלבון אחרות, על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לתלות הגנטית והסביבתית של מוטציות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את העבודה הנדרשת לבניית ספריית מוטגנזה של רוויה של חלבון שלם, ולהעריך את ההשפעות התפקודיות של כל מוטציה בו זמנית, באמצעות ריצוף תפוקה גבוהה.

אל תשכח שעבודה עם אתידיום ברומיד ואור אולטרה סגול עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון כפפות, מעיל מעבדה ומגן UV בעת ביצוע חלקים מפרוטוקול זה.