A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Michael Allen Stiffler; Subu K Subramanian; Victor H Salinas; Rama Ranganathan

doi:10.3791/54119

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

Full Text

11,331 Views

11:36 min

July 3, 2016

DOI: 10.3791/54119-v

Michael Allen Stiffler¹, Subu K Subramanian¹, Victor H Salinas¹, Rama Ranganathan¹

¹Green Center for Systems Biology,University of Texas Southwestern Medical Center

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

אנו מציגים פרוטוקול עבור ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי אתר יחיד המקיפות של חלבוני ניצול רצף תפוקה גבוהה. חשוב לציין, גישה זו משתמשת זוגות פריימר מאונכים לבצע ריבוב בניית רצף ספרייה. תוצאות נציג באמצעות TEM-1 β-lactamase שנבחר במינון רלוונטי קליני של אמפיצילין מסופקות.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את ההערכה התפקודית של ספריות מוטגנזה מקיפות של חלבונים באתר יחיד, תוך שימוש בריצוף תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביוכימיה והאבולוציה המולקולרית. כגון, מהם האילוצים הביוכימיים המבניים והאבולוציוניים על חלבונים?

וכיצד נוכל להנדס חלבונים עם פונקציות חדשות? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ממקסמת מספר קריאות ריצוף שימושיות במחקר מוטגנזה של רוויה של חלבון שלם, על ידי ריבוי בנייה וריצוף של ספריות. לאחר הכנת צלחת של PCR Master Mix על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 10 מיקרוליטר מלוחות 96 הבארות המכילים את פריימרים למוטגנזה חושית שדוללו בעבר לבארות הקוגנטיות בלוחות ה-PCR.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos