Name: סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ידי שימוש photostable Cyanine צבעים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: למדו לסנתז DNA מסומן בציאנין פוטוסטביל לזיהוי הכלאה באמצעות שינוי צבע פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תהליכים מולקולריים בתאים חיים ללא דעיכת אותות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה כספית על ידי (DFG, ווה 1386 / 17-1), את GRK קבוצת הדרכת המחקר 2039 (ממומן על ידי DFG) והערכה היא הודתה בהכרת תודה.

<ol><li>Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+for+fluorescent+probe+design+in+medical+diagnostic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging.</a> Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).</li>
<li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Lifetime+Measurements+and+Biological+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging.</a> Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li>
<li>Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity-oriented+optical+imaging+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diversity-oriented optical imaging probe development.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).</li>
<li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2334%3BDNA+Traffic+Lights%26%2334%3B%3A+Concept+of+Wavelength-Shifting+DNA+Probes+and+Application+in+an+Aptasensor%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">#34;DNA Traffic Lights&#34;: Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).</li>
<li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%3A+Synthetic+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Probes+Based+on+Nucleic+Acid+Base+Substitutes+for+Molecular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA &#34;Traffic Lights&#34;: Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging.</a> J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).</li>
<li>Berndl, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Color+Readout+of+DNA+Hybridization+with+Thiazole+Orange+as+an+Artificial+DNA+Base%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).</li>
<li>Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+Photostable+Energy-Transfer+Pair+for+%26%2334%3BDNA+Traffic+Lights%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for &#34;DNA Traffic Lights&#34.</a> Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).</li>
<li>Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Module+for+the+Adenosine+Aptamer+Using+Photostable+Cyanine+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes.</a> ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).</li>
<li>Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+as+a+reliable+method+for+the+high-density+postsynthetic+functionalization+of+alkyne-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA.</a> Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).</li>
<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+deoxyoligonucleotides+on+a+polymer+support%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support.</a> J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%2C+Volume+1%3A+Nucleic+Acids%22">Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids</a>. Fasman, G. D. , CRC Press. 589(1975).</li>
<li>Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbance+melting+curves+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Absorbance melting curves of RNA.</a> Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).</li>
<li>Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Dimers%3A+A+New+Strategy+to+Fluorescence+Quenching+in+Dual-Labeled+Oligonucleotide+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).</li>
<li>Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Duplex+Stability+for+Wavelength-Shifting+Fluorescent+DNA+Probes%3A+Energy+Transfer+vs+Excition+Interactions+in+DNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%2C+Photochem%5BTitle%5D)+AND+%22Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA &#34;Traffic Lights&#34;, Photochem.</a> Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

<html> פרוטוקול זה מראה את הנוהל המלא לתייג DNA שלאחר סינטטי באמצעות CuAAC ידי צבעי ניאון-modified יזידו. זה כולל את הסינתזה של צבעים ואת DNA שונה-אלקין וכן הליך התיוג. הסינתזה של צבעים כדלקמן ארבעה שלבים. כל המוצרים ניתן להשיג על ידי משקעים פשוטים למדי בשל המטען החיובי שלהם ולא כרומטוגרפיה עמודת זמן רב נדרשה. המבוא של פונקציות תזיד לפני מדרגות הצימוד המרכזיות מקצר את הסינתזות של הצבעים ארבעה במקום חמישה צעדי תגוב...

הדמיה מולקולרית מייצגת טכניקה בסיסית להבנת תהליכים ביולוגיים בתוך תאי חיים. 1-3 פיתוח בדיקות מבוססות חומצת פלורסנט גרעין עבור יישומים כימיים-ביולוגית כזה הפך לשדה מחקר הרחבה. בדיקות ניאון אלו צריכים לעמוד בכמה דרישות הופכים לכלי שרת מתאים הדמיה תא. ראשית, צבעים מיושם צריך להפגין הקרינה עם תשואות קוונטית גבוהה, משמרות &#39;גדול סטוקס, והכי חשוב, photostabilities גבוה כדי לאפשר לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo. ושנית, הם צריכים להראות הודעת קרינה אמינה. כרומופור-מרווה-מערכות קונבנציונליות מבוססות על ההודעה של צבע פלואורסצנטי אחת על ידי שינויים פשוטים עוצמות קרינה. 4 גישה זו נושאה את הסיכון של תוצאות שליליות חיוביות או שקר שקר בשל autofluorescence של רכיבים תאיים או יחסי אות לרעש נמוכים בשל מרווה רצוי על ידי com האחרponents. 4 דיווחנו לאחרונה על הרעיון של &quot;רמזור DNA&quot; שמראה readouts צבע פלואורסצנטי הכפול באמצעות שני chromophores שונה. 5-6 התפיסה מבוססת על העברת האנרגיה (ET) מ צבען התורם כדי לצבוע acceptor אשר משנה את הקרינה צבע (ראה איור 1). זה מאפשר הודעה אמינה יותר ובכך מספק כלי רב עצמה עבור בדיקות דימות פלואורסצנטי. תוויות של oligonucleotides עם צבעי ניאון יכול להיות מושגת על ידי שתי גישות שונות. צבעים ניתן לשלב במהלך סינתזת ה- DNA הכימית על שלב מוצק באמצעות אובניים בניין phosphoramidite שונה בהתאם. 7 שיטה זו מוגבלת צבעים כי הם יציבים בתנאי phosphoramidite ו deprotection סטנדרטיים. כחלופה, מתודולוגיות שינוי שלאחר סינתטי הוקמו בכימיה oligonucleotide. הנה, אנחנו מדגימים את הסינתזה של אחד התמונות החדשות שלנושולחן אנרגיה העברת זוגות 8,9 ואת תיוג שלאחר סינתטי של דנ&quot;א באמצעות-זרז נחושת 1,3-cycloaddition בין azides ו alkynes (CuAAC). 10

<table><tbody><tr><td colspan="4">synthesis</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC כיתה</td></tr><tr><td>אתיל אצטט</td><td>פישר Scientific</td><td>10456870</td><td>טכני</td></tr><tr><td>כיתה נתרן אזיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>71290</td><td>p.a.</td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>פישר 10626642 מדעי</td><td></td><td>בדרגה טכנית</td></tr><tr><td>אינדול-3-קרבוקסלדהיד; 98%</td> <td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פחמתי, 99+%</td> <td>אקרוס</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>דימתילקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>N,N-דימתילפורממיד, 99.8%, יבש במיוחד מעל מסננת מולקולרית</td><td>אקרוס</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>נתרן גופרתי</td><td>ברנד קראפט</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, 99.5%</td> <td>אקרוס</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>פיפרידין, 99%</td> <td>אקרוס</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיאתר</td><td>פישר 10407830 טכני</td><td></td><td>דרגה טכנית</td></tr><tr><td>2-פנילינדול-3-קרבוקסלדהיד; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-מתילקינולין</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>סינתזת DNA</חזק></td></tr><tr><td>אקספדיט 8909 סינתיסייזר חומצות גרעין</td><td>יישומי ביוסיסטמות</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) פוספורמידיט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT פוספורמידיט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td></td>T111081</tr><tr><td>DMT-dG(dmf) פוספורמידיט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) פוספורמידיט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>מדלל אמידיט לסינתזת DNA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל טהור במיוחד לסינתזת DNA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>טור CPG dT 1.0&nbsp; ומיקרו; שומה</td><td>Proligo ריאגנטים</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) טור 1.0&nbsp; ומיקרו; שומה</td><td>פרוליגו ריאגנטים</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) טור 1.0&nbsp; ומיקרו; שומה</td><td>Proligo ריאגנטים</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) עמודה 1.0&nbsp; ומיקרו; שומה</td><td>פרוליגו ריאגנטים</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>אמוניה (תמיסה מימית)&nbsp;</td><td>פלוקה מכשירים צנטריפוגליים אנליטיים</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>ננוספ 0.45&nbsp; ומיקרו; m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>Chem Genes</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" >workup</td></tr><tr><td>vacar רכז Christ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>click </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טטראקיס(אצטוניטריל)נחושת(I) הקספלואורופוספט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-נתרן L-אסקורבט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA מלח דיסודיום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ליגנד</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>מסונתז על פי נוהל ספרות1</td></tr><tr><td colspan="4">HPLC</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>ספקטרומטר Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV Bruker</td><td>Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 column</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>קביעת ריכוז</td></tr><tr><td>ND 1000 ספקטרופוטומטר</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">הכנת דגימה וספקטרוסקופיה</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorimeter</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1 ר. צ'אן טימותי, ר. הילגרף, ק. ב. שארפלס, ו. פוקין ואלרי, Org Lett 2004, <חזק>6</חזק>, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

סינתזה של בדיקות הכלאה dna הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable cyanine צבעים

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים שיטה לסינתזה של 2&#39;-אלקין שונה חומצת deoxyribonucleic (DNA) גדילים בסינתזת שלב מוצק אוטומטית באמצעות כימית phosphoramidite סטנדרטית. Oligonucleotides מסומנים שלאחר סינטטי על ידי שני צבעים cyanine photostable חדשים באמצעות זרז-נחושת-כימיה קליק. הסינתזה של שניהם צבע תורם acceptor מתוארת והיא מבוצעת בשלושה שלבים רצופים. עם DNA כמו הארכיטקטורה שמסביב, הצבעים שני אלה עוברים מעבר אנרגיה כשהם מובאים לתוך בסמיכות ידי כלאה. לכן, חישול של שני גדילי DNA גדילי יחיד הוא מדמיין על ידי שינוי של צבע פלואורסצנטי. שינוי צבע זה מאופיין ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי אבל יכול להיות גם ציין ישירות באמצעות מנורת כף יד אולטרה סגול (UV). הקונספט של הודעת צבע פלואורסצנטי כפולה עושה בדיקות oligonucleotide אלה כלי מעולה עבור הדמיה מולקולרית במיוחד כאשר Pho תארצבעי tostable משמשים. ובכך, photobleaching של בדיקות ההדמיה נמנע, ותהליכים ביולוגיים ניתן לצפות בזמן אמת עבור תקופת זמן ארוכה יותר.

ספקטרום קליטת הקרינה של גדילי הדנ&quot;א היחיד וכפול נרשם כפי שמוצג באיור 4. ספקטרום הקליטה רשם (איור 4 מימין) מקסימום λ המקסימום קליט ​​להראות בבית 465 ננומטר עבור DNA1 חד גדילים (צבע 1) ו 546 ננומטר עבור DNA2 חד גדילים (צבע 2). DNA1_2 annealed (צבע 1 &amp; צבע 2) מראה מקסימום הוא 469 ננומטר 567 ננומטר....

צבעי ציאנין עמידים לאור מחוברים לאוליגונוקלאוטידים כדי לנטר הכלאה על ידי העברת אנרגיה.

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להמחיש חזותית את העברת האנרגיה מגדיל DNA אחד שעבר מודיפיקציה על ידי צבע, לגדיל אחר. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית, כגון התערבות RNA (RNA interference) באמצעות ניטור העיבוד והשלמות של siRNA בתאים חיים בזמן אמת.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הקלות בניטור התפשטות הפלואורסצנציה והשינוי בצבע, המעניקים תוצאה ברורה. כך נמנעות תוצאות חיוביות שגויות. כדי להתחיל בהליך זה, הוסיפו את הרכיבים המתאימים כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב לבקבוק תחתית עגולה בנפח 20 milliliter, המצויד במגנט Stir bar ומקבל רפלקס (reflux condenser).לאחר מכן, הוסיפו 0.06 milliliters של piperidine. חממו את תערובת התגובה ל-80 °C למשך ארבע שעות. לאחר שהתגובה התקררה לטמפרטורת החדר, אספו את המשקוב שהתקבל באמצעות סינון.שטפו עם diethyl ether שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסיפו מאה מיליליטר של diethyl ether לנוזל העילאי. אספו את המשקוב שהתקבל באמצעות סינון.לאחר שטיפה של שלוש פעמים בdiethyl ether, חברו את המשקע עם המוצק שהופרד בסינון הראשון. באמצעות המחשב המחובר למסנתז DNA, הזינו את רצף ה-DNA הרצוי ואת שיטת הצימוד, בהתאם להנחיות בפרוטוקול של היצרן.בשלב הבא, התקינו במסנתיזה את העמודה המכילה את זכוכית השפיכה המבוקרת, אשר עברה מודיפיקציה באמצעות מיקרו-מול אחד של הפנים הראשון. כעת, התחילו את הסינתזה במסנתיזת ה-DNA. לאחר שלב המעבדה (workup) של גדילי ה-DNA, הוסיפו את הריאגנטים המתאימים, כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב, לדגימת ה-DNA המודיפית עם אלקין די-אתילדגרו את הדגימה בטמפרטורה של 60 °C למשך 1.5 שעות. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לפקום של 10 mL. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, הוסיפו לדגימת ה-DNA‏ 150 µL של תמיסת EDTA disodium salt בריכוז 0.05 M, ו-450 µL של תמיסת sodium acetate בריכוז 0.3 M.לאחר מכן, יש להוסיף 10 milliliters של אתנול לדגימה, ולשמור אותה בטמפרטורה של 32- °C למשך 16 שעות. לאחר מכן, יש לסבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-1000 ×g. עם הסיום, יש להסיר את הנוזל העליון (supernatant).שטפו את משקע ה-DNA שהתקבל ב-2 mL של 80% ethanol קר. לאחר מכן, ייבשו את המשקע בלחץ מופחת באמצעות מייבש בהקפאה. טהרו את משקע ה-DNA הגולמי באמצעות HPLC. עקבו אחר הריצה על ידי בדיקה ב-260 nm, וב-459 nm עבור Dye one.או 542 ננומטר עבור צבע שניים. אספו את הפראקציות המראות בליעה בשני ערוצי אורך הגל. עבור מדידות ספקטרוסקופיית בליעה של גדיל יחיד, רשמו מדידת רקע (blank) המכילה רק 200 millimolar של sodium chloride ו-50 millimolar של sodium phosphate buffer.בשלב הבא, העבירו את תמיסת ה-DNA1 שהוכנה קודם לכן לקוובט מזכוכית קוורץ של סנטימטר אחד. רשמו את הבליעה. לאחר מכן, קבעו את ערך הבליעה המקסימלי של הצבע.עבור מדידות ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של גדיל בודד, רשום מדידת רקע (blank) המכילה רק 200 millimolar sodium chloride ו-50 millimolar sodium phosphate, תוך שימוש באורך גל העירור של Dye one. לאחר מכן, הנח את הקובטה עם תמיסת ה-DNA1 בתוך הספקטרומטר. רשום את ספקטרום הפלואורסצנציה.כדי לבצע את מדידת הספקטרוסקופיה הפלואורסצנטית של הגדיל הכפול, הכניסו את הקובטה עם תמיסת הגדיל הכפול של DNA1 ו-DNA2 לספקטרומטר. לאחר מכן, רשמו את ספקטרום הפלואורסצנציה באמצעות אורך גל העירור של Dye one. כדי להבין טוב יותר את התוצאות המוצגות בספקטרומים שהוקלטו, הקרינו את הקובטות באמצעות מנורות UV ידניות.הבחינו בשינוי בצבע הפלואורסצנציה מה-DNA החד-גדילי ל-DNA הכפול-גדילי. ספקטראי הבליעה שהוקלטו מראים מקסימום ב-465 nanometers עבור DNA1 חד-גדילי וב-546 nanometers עבור DNA2 חד-גדילי. הגדיל הכפול שנוצר מההיברוד של DNA1 ו-DNA2 מראה מקסימום הן ב-469 והן ב-567 nanometers.שני מקסימלי הספיגה מראים הזזה באת'וכרומית. והשינויים הספקטרוסקופיים הקטנים ביותר הם תוצאה של אינטראקציות אקסיטוניות בין הצבעים בתוך מבנה ה-DNA הסלילי הכפול. ספקטרומי הפלואורסצנציה התואמים מראים מקסימום ב-537 nanometers עבור DNA1 בעל גדיל יחיד.ב-607 ננומטר עבור DNA2 גלגול יחיד. וב-615 ננומטר עבור DNA1 ו-DNA2 גלגול כפול שנוצר על ידי היסננה (annealing). גלגול כפול של DNA1 ו-DNA2 מראה אך ורק את מקסימום הפליטה של Dye two, למרות ש-Dye one עורר באופן סלקטיבי, דבר המעיד על כך שהעברת האנרגיה מתבצעת ביעילות מ-Dye one ל-Dye two.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע שינוי סינתטי של DNA באמצעות מספר תגובות קטליטיות של גדיל DNA מסומן באלקין עם צד A.

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרט הווידאו הזה הוא הפגנה טכני של פרוטוקול הכלאה עבור כל ריצוף הגנום נתיב מערך CGH, שסורקת את הגנום האנושי כולו רק באמצעות 25-100 ng של DNA כי ניתן לבודד מתוך מגוון של מקורות, כולל חומר ארכיוני קבוע פורמלין.

הפגנה טכנית של הכלאה שלמות מערך הגנום הגנום השוואתי

אנו מציגים שילוב רומן רב עוצמה של nanophotonics (QD-סריג) ו מיקרופלואידיקה לחקור את היווצרות polyplexes polyelectrolyte, אשר צפוי לספק שליטה טובה יותר וסינתזה של polyplexes אחיד להתאמה אישית עבור חומצה מבוססי גרעין עתיד הרפוי.

שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם...

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

הסרטון מדגים שיטה להערכת כוחות קולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון באמצעות ננו-חלקיקי זהב מעוגני פוליאתילן גליקול ובדיקות מתח של סיכות שיער DNA. אינטראקציות תאי T חיוביים ל- CD8 מעוררות התפתחות בדיקה, פולטות פלואורסצנטיות בעוד שגדילי נעילה מקיימים את האות לכימות הכוחות המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון.

שימוש בבדיקות מתח מבוססות DNA כדי להעריך את כוחות הקולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון

אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לביצוע הכלאה של DNA פלואורסצנטי באתרו (DNA ISH) כדי לדמיין רצפים הטרוכרומטיים חוזרים ונשנים על כרומוזומים המותקנים בשקופיות. השיטה דורשת ריאגנטים מינימליים והיא רב-תכליתית לשימוש עם בדיקות קצרות או ארוכות, רקמות שונות וזיהוי עם אותות פלואורסצנטיים או שאינם מבוססי פלואורסצנטיות.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש thiazole כתום זיהוי ה-DNA בניסויים ג'ל אלקטרופורזה. השימוש thiazole כתום מאפשר חיסול של אתידיום ברומיד, וכן זיהוי קרינה פלואורסצנטית יכולה להיות מושגת באמצעות UV או אור כחול.

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

פרוטוקול זה מתאר יישום של פלואורסצנטיות מולקולה אחת בהכלאה situ (smFISH) כדי למדוד את הקינטיות vivo של סינתזה mRNA והשפלה.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקות מתח מבוססות דנ"א כדי לדמות את כוחות הקולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון. גישה זו יכולה למפות כוחות קולטן &gt;4.7pN בזמן אמת ויכולה לשלב כוחות לאורך זמן.

בדיקות מתח DNA כדי למפות את כוחות קולטן פיקוניוטון חולפים על ידי תאים חיסוניים

פרוטוקול זה מתאר את התכנון של בדיקות הכלאה מפוצלות תוך שימוש באפטמר מואר פלואורסצנטי DAP-10-42 כמדווח אותות ויישומם לזיהוי חומצות גרעין והבחנה בין מטרות עם החלפות נוקלאוטידים בודדים.

בדיקת הכלאה מפוצלת המשתמשת באפטמר אור פלואורסצנטי של DNA כמדווח אותות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף

למדו לסנתז DNA מסומן בציאנין פוטוסטביל לזיהוי הכלאה באמצעות שינוי צבע פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תהליכים מולקולריים בתאים חיים ללא דעיכת אותות.

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים

גלה סרטונים נוספים

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ידי שימוש photostable Cyanine צבעים