סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ידי שימוש photostable Cyanine צבעים
6 ביולי 2016
צבעי ציאנין עמידים לאור מחוברים לאוליגונוקלאוטידים כדי לנטר הכלאה על ידי העברת אנרגיה.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להמחיש חזותית את העברת האנרגיה מגדיל DNA אחד שעבר מודיפיקציה על ידי צבע, לגדיל אחר. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית, כגון התערבות RNA (RNA interference) באמצעות ניטור העיבוד והשלמות של siRNA בתאים חיים בזמן אמת.
היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הקלות בניטור התפשטות הפלואורסצנציה והשינוי בצבע, המעניקים תוצאה ברורה. כך נמנעות תוצאות חיוביות שגויות. כדי להתחיל בהליך זה, הוסיפו את הרכיבים המתאימים כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב לבקבוק תחתית עגולה בנפח 20 milliliter, המצויד במגנט Stir bar ומקבל רפלקס (reflux condenser).
לאחר מכן, הוסיפו 0.06 milliliters של piperidine. חממו את תערובת התגובה ל-80 °C למשך ארבע שעות. לאחר שהתגובה התקררה לטמפרטורת החדר, אספו את המשקוב שהתקבל באמצעות סינון.
שטפו עם diethyl ether שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסיפו מאה מיליליטר של diethyl ether לנוזל העילאי. אספו את המשקוב שהתקבל באמצעות סינון.
לאחר שטיפה של שלוש פעמים בdiethyl ether, חברו את המשקע עם המוצק שהופרד בסינון הראשון. באמצעות המחשב המחובר למסנתז DNA, הזינו את רצף ה-DNA הרצוי ואת שיטת הצימוד, בהתאם להנחיות בפרוטוקול של היצרן.
בשלב הבא, התקינו במסנתיזה את העמודה המכילה את זכוכית השפיכה המבוקרת, אשר עברה מודיפיקציה באמצעות מיקרו-מול אחד של הפנים הראשון. כעת, התחילו את הסינתזה במסנתיזת ה-DNA. לאחר שלב המעבדה (workup) של גדילי ה-DNA, הוסיפו את הריאגנטים המתאימים, כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב, לדגימת ה-DNA המודיפית עם אלקין די-אתיל
דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 60 °C למשך 1.5 שעות. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לפקום של 10 mL. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, הוסיפו לדגימת ה-DNA 150 µL של תמיסת EDTA disodium salt בריכוז 0.05 M, ו-450 µL של תמיסת sodium acetate בריכוז 0.3 M.
לאחר מכן, יש להוסיף 10 milliliters של אתנול לדגימה, ולשמור אותה בטמפרטורה של 32- °C למשך 16 שעות. לאחר מכן, יש לסבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-1000 ×g. עם הסיום, יש להסיר את הנוזל העליון (supernatant).
שטפו את משקע ה-DNA שהתקבל ב-2 mL של 80% ethanol קר. לאחר מכן, ייבשו את המשקע בלחץ מופחת באמצעות מייבש בהקפאה. טהרו את משקע ה-DNA הגולמי באמצעות HPLC. עקבו אחר הריצה על ידי בדיקה ב-260 nm, וב-459 nm עבור Dye one.
או 542 ננומטר עבור צבע שניים. אספו את הפראקציות המראות בליעה בשני ערוצי אורך הגל. עבור מדידות ספקטרוסקופיית בליעה של גדיל יחיד, רשמו מדידת רקע (blank) המכילה רק 200 millimolar של sodium chloride ו-50 millimolar של sodium phosphate buffer.
בשלב הבא, העבירו את תמיסת ה-DNA1 שהוכנה קודם לכן לקוובט מזכוכית קוורץ של סנטימטר אחד. רשמו את הבליעה. לאחר מכן, קבעו את ערך הבליעה המקסימלי של הצבע.
עבור מדידות ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של גדיל בודד, רשום מדידת רקע (blank) המכילה רק 200 millimolar sodium chloride ו-50 millimolar sodium phosphate, תוך שימוש באורך גל העירור של Dye one. לאחר מכן, הנח את הקובטה עם תמיסת ה-DNA1 בתוך הספקטרומטר. רשום את ספקטרום הפלואורסצנציה.
כדי לבצע את מדידת הספקטרוסקופיה הפלואורסצנטית של הגדיל הכפול, הכניסו את הקובטה עם תמיסת הגדיל הכפול של DNA1 ו-DNA2 לספקטרומטר. לאחר מכן, רשמו את ספקטרום הפלואורסצנציה באמצעות אורך גל העירור של Dye one. כדי להבין טוב יותר את התוצאות המוצגות בספקטרומים שהוקלטו, הקרינו את הקובטות באמצעות מנורות UV ידניות.
הבחינו בשינוי בצבע הפלואורסצנציה מה-DNA החד-גדילי ל-DNA הכפול-גדילי. ספקטראי הבליעה שהוקלטו מראים מקסימום ב-465 nanometers עבור DNA1 חד-גדילי וב-546 nanometers עבור DNA2 חד-גדילי. הגדיל הכפול שנוצר מההיברוד של DNA1 ו-DNA2 מראה מקסימום הן ב-469 והן ב-567 nanometers.
שני מקסימלי הספיגה מראים הזזה באת'וכרומית. והשינויים הספקטרוסקופיים הקטנים ביותר הם תוצאה של אינטראקציות אקסיטוניות בין הצבעים בתוך מבנה ה-DNA הסלילי הכפול. ספקטרומי הפלואורסצנציה התואמים מראים מקסימום ב-537 nanometers עבור DNA1 בעל גדיל יחיד.
ב-607 ננומטר עבור DNA2 גלגול יחיד. וב-615 ננומטר עבור DNA1 ו-DNA2 גלגול כפול שנוצר על ידי היסננה (annealing). גלגול כפול של DNA1 ו-DNA2 מראה אך ורק את מקסימום הפליטה של Dye two, למרות ש-Dye one עורר באופן סלקטיבי, דבר המעיד על כך שהעברת האנרגיה מתבצעת ביעילות מ-Dye one ל-Dye two.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע שינוי סינתטי של DNA באמצעות מספר תגובות קטליטיות של גדיל DNA מסומן באלקין עם צד A.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את הסינתזה של גדילי DNA עם מודיפיקציית 2'-alkyne באמצעות סינתזה אוטומטית על פאזה מוצקה וכימיית phosphoramidite סטנדרטית. האוליגנוקלאוטידי DNA מסומנים לאחר הסינתזה עם שני צבעי cyanine חדשניים ויציבים פוטו-כימית באמצעות כימיית click המזורזת על ידי נחושת. גששי ה-DNA בעלי הסימון הכפול שנוצרו מאפשרים ויזואליזציה של העברת אנרגיה בעת היברידיזציה, ומספקים שינוי צבע פלואורסצנטי ברור שניתן לזיהוי באמצעות ספקטרוסקופיה או מנורת UV ניידת. גישה זו מציעה כלים חסונים לדימות מולקולרי ולתצפית בזמן אמת על תהליכים ביולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה מולקולרית
- כימיה של DNA
- ספקטרוסקופיה של פלואורסצנציה
רקע
- ניטור אינטראקציות של חומצות גרעיניות והיברידיזציה הוא חיוני בביולוגיה מולקולרית.
- גששים פלואורסצנטיים מסורתיים עלולים לסבול מפוטו-בליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית), המגביל תצפית בזמן אמת.
- העברת אנרגיה בין צבעים תורמים ומקבלים מאפשרת זיהוי רגיש של אירועים מולקולריים.
- צבעים יציבים פוטוכימית משפרים את אורך החיים של הגשש עבור יישומי דימיון.
מטרת המחקר
- סינתזה של גדילי DNA עם מודיפיקציית 2'-alkyne עבור סימון צבע ספציפי לאתרים.
- פיתוח של גששים (probes) של DNA המסומנים כפולה באמצעות צבעי cyanine פוטו-יציבים.
- הדמיה של היברידיזציית DNA באמצעות שינוי צבע פלואורסצנטי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סינתזה אוטומטית של DNA במוצק באמצעות כימיית פוספוראמידאיט.
- סימון פוסט-סינתטי של DNA בצבעי ציאנין באמצעות כימיית קליק מזורזת נחושת.
- טיהור של DNA מסומן באמצעות HPLC ואפיון באמצעות ספקטרוסקופיה של בליעה ופלואורסצנציה.
- ויזואליזציה ישירה של שינוי בצבע הפלואורסצנציה באמצעות מנורת UV ניידת.
תוצאות עיקריות
- סינתזה וסימון יעילים של גדילי DNA עם צבעי תורם ומקבל.
- מקסימומי בליעה מובחנים עבור DNA גדילי ו-DNA דו-גדילי, המעידים על שילוב מוצלח של הצבע והיברידיזציה.
- ספקטרומי פלואורסצנציה מראים העברה יעילה של אנרגיה מצבע התורם לצבע המקבל בעקבות היברידיזציה של ה-DNA.
- שינוי הצבע נצפה בקלות, ובכך מספק קריאה ברורה של התקרנות (annealing) של ה-DNA.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר סינתזה וסימון אמינים של DNA למחקרי העברת אנרגיה.
- גששים בעלי סימון כפול עם צבעים פוטו-יציבים מאפשרים דימוי מולקולרי חסון בזמן אמת.
- שיטה זו מפחיתה תוצאות חיוביות שגויות ופוטו-بلیצ'ינג (הבהרה פוטוכימית), ובכך משפרת את חקר האינטראקציות של חומצות גרעיניות במערכות ביולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גששים להיברידציה של DNA בעלי יציבות פוטוסטבילית והסטת אורך גל מאפשרים ויזואליזציה חזקה ובזמן אמת של אינטראקציות של חומצות גרעיניות, ובכך תומכים ישירות בגילוי מוקדם ובפיתוח בדיקות במחקר ופיתוח (R&D) בביופארמה. הגששים בעלי הסימון הכפול מספקים קריאות פלואורסצנציה כמותיות וברורות, המפחיתות תוצאות חיוביות שגויות ומגבירות את הביטחון החזוי בזרימות עבודה של דימוי מולקולרי. יכולת זו מחזקת את תיקוף המטרה ואת הפחתת הסיכונים המכניסטיים בנקודות השבח הקריטיות של תהליך הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ובפיתוח של ביו-פרמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של היברידיזציה של חומצות גרעין לצורך חקירה פונקציונלית של המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת שינוי צבע פלואורסצנטי חד-משמעי בעת היברידיזציה.
- משפר את הביטחון החזוי במחקרי תיקוף מטרות המבוססים על חומצות גרעין.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מסייע בהכנת גשושים (probes) של DNA שעברו תיקוף עבור פלטפורמות של סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
- מספק תוצרי פלואורסצנציה סטנדרטיים, הניתנים לשחזור וכמותיים לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- מפחית תוצאות חיוביות שגויות, ובכך תומך בהערכה מהימנה של תרכובות וביכולת הרחבה (scalability) של הסריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר ניטור בזמן אמת של תהליכי חומצות גרעין, כגון עיבוד siRNA, במערכות חיות.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה בדימות מולקולרי של אירועים ביולוגיים.
- משפר את ההלימה של ביומרקרים תרגומיים באמצעות ביצועים חסונים ויציבים פוטו-גרפית של הגששים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו של גששות DNA בעלות סימון כפול משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם, דרך פיתוח הבדיקה ועד למחקר תרגומי, ובכך היא תומכת בבדיקת השערות ובקבלת תוצאות כמותיות לאורך כל רצף המחקר והפיתוח (R&D).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקה מונחית-השערה של אינטראקציות של חומצות גרעין ובבירור מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת פלטי פלואורסצנציה כמותיים וניתנים לשחזור עבור מוכנות של בדיקות ושימוש חוזר בפלטפורמה.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה מדויקת של אירועי היברידיזציה והעברת אנרגיה באמצעות אנליזה ספקטרוסקופית.
- מחקר תרגומי: תואמת את הצרכים של דימות פרה-קליני לניטור תהליכים מבוססי חומצות גרעין בזמן אמת.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמת גששים הניתנת לשימוש חוזר ויציבה פוטו-כימית, הניתנת להתאמה למגוון יעדי חומצות גרעין.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של חומצות גרעיניות.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה סטנדרטיות, ניתנות להרחבה וניתנות לשחזור של סינתזה וסימון של גששים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי מזעור תוצאות חיוביות שגויות וסיכוני דהייה פוטו-כימית (photobleaching).
- השפעה על תיק הפעילות: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות גילוי מבוססות חומצות גרעיניות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסינתזה אוטומטית של DNA ובסימון צבעים לאחר הסינתזה.
- נחוש גישה לתשתית של ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה וטיהור באמצעות HPLC.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של סינתזת גששים ופרוטוקולים אנליטיים.
- ניתן להתאמה לרצפי חומצות גרעיניות שונות ולמודלים של היברידיזציה.
- תלוי בזמינות של צבעים פוטו-יציבים ובתאימות למערכות המטרה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Synthesis of the Dyes
1:48
Synthesis of the DNA Strands
2:25
"Clicking" Procedure and HPLC Purification
4:15
Sample Preparation and Spectroscopy
5:52
Results: Absorption and Fluorescence Spectroscopy Changes upon DNA Hybridization
7:18
Conclusion
