סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ידי שימוש photostable Cyanine צבעים
6 ביולי 2016
צבעי ציאנין עמידים לאור מחוברים לאוליגונוקלאוטידים כדי לנטר הכלאה על ידי העברת אנרגיה.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לדמיין את העברת האנרגיה מגדיל DNA שונה בצבע אחד למשנהו. שיטה זו יכולה לסייע בשאלות המפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית. כגון הפרעות RNA על ידי ניטור עיבוד ושלמות siRNA בתאים חיים בזמן אמת.
היתרון העיקרי בטכניקה זו, הוא קלות הניטור של הושטת היד הפריחה ושינוי הצבע, מה שנותן תוצאה ברורה. כך שתוצאות חיוביות כוזבות נמחקות. התחל הליך זה, הוסף את הריאגנטים המתאימים כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט לבקבוק תחתון עגול בנפח 20 מיליליטר, המצויד במוט ערבוב מגנטי ומעבה ריפלוקס.
לאחר מכן, הוסף אפס נקודה אפס שישה מיליליטר פיפרידין. ומחממים את תערובת התגובה ל 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר שהתגובה התקררה לטמפרטורת החדר, אספו את המשקעים המתקבלים על ידי סינון.
ולשטוף עם אתר דיאתיל שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסף מאה מיליליטר של אתר דיאתיל לסופרנטנט. ואוספים את המשקעים המתקבלים על ידי סינון.
לאחר שטיפה שלוש פעמים עם אתר דיאתיל, שלב את המשקעים עם מוצק מבודד מהסינון הראשון. באמצעות המחשב, המחובר לסינתיסייזר DNA, נכנסים לרצף ה-DNA הרצוי ולשיטת הצימוד. בהתאם להנחיות מפרוטוקול היצרן.
לאחר מכן, הרכיב את העמוד המכיל את המזיגה המבוקרת, שמשתנה עם מיקרו שומה אחת של הפנים הראשונות לתוך הסינתיסייזר. כעת, התחל את הסינתזה על סינתיסייזר ה-DNA. לאחר עיבוד גדילי ה-DNA, הוסף את העוצר המתאים כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט לדגימת ה-DNA הדיאתיליזציה, שונה.
דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך נקודה אחת וחמש שעות. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לצינור של 10 מיליליטר. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, הוסף לדגימת ה-DNA 150 מיקרוליטר של תמיסת מלח דיסודיום EDTA אפס אפס אפס חמש מולריות, ו-450 מיקרוליטר של תמיסת נתרן אצטט אפס נקודה שלוש מולריות.
לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר אתנול לדגימה. ושמור אותו על מינוס 32 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות באלף פעמים G.בסיום, הסר את הסופרנטנט.
שוטפים את כדור ה- DNA שהתקבל בשני מיליליטר אתנול קר 80%. לאחר מכן יבש את הגלולה בלחץ מופחת באמצעות מייבש הקפאה. טהר את גלולת ה-DNA הגולמית על ידי HP LC.עקוב אחר הריצה על ידי בדיקת 260 ננומטר, ו-459 ננומטר עבור Dye אחד.
או 542 ננומטר עבור Dye two. אסוף את השברים המראים ספיגה בשני ערוצי אורך הגל. למדידות ספקטרוסקופיה של ספיגת גדיל יחיד, רשום מדידה ריקה המכילה רק 200 מילי-מולרי נתרן כלורי ומאגר נתרן פוספט 50 מילי-מולרי.
לאחר מכן, העבירו את תמיסת ה- DNA 1 שהוכנה בעבר לקובטה מזכוכית קוורץ. רשום את הקליטה. לאחר מכן קבע את הערך המרבי של ספיגת הצבע.
למדידות ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של גדיל יחיד, רשום מדידה ריקה המכילה רק 200 מילימולרית נתרן כלורי ו-50 מילימולרית נתרן פוספט, תוך שימוש באורך גל העירור של Dye one. לאחר מכן, הנח את הקובט עם תמיסת ה-DNA1 לתוך הספקטרומטר. רשום את ספקטרום הפריחה.
כדי לבצע את מדידת הספקטרוסקופיה הפלואורסצנטית של הגדיל הכפול, הנח את הקובט עם הגדיל הכפול של תמיסת DNA1 ו-DNA2 לתוך הספקטרומטר. לאחר מכן רשום את ספקטרום הפלורסנט באמצעות אורך גל העירור של Dye one. כדי להבין טוב יותר מה הספקטרום המוקלט מראה, הקרינו את הקובטות עם מנורות UV המוחזקות ביד.
שימו לב לשינוי בצבע הפריחה מה-DNA היחיד ל-DNA הדו-גדילי. ספקטרום הספיגה המתועד מראה את המקסימום ב-465 ננומטר עבור DNA1 חד-גדילי ו-546 ננומטר עבור DNA חד-גדילי. הגדיל הכפול המחושל של DNA1 ו-DNA2 מראה מקסימום הן ב-469 והן ב-567 ננומטר.
שני מקסימום הספיגה מראים שינוי בתאהורומי. והשינויים הספקטרוסקופיים הקטנים ביותר הם תוצאה של אינטראקציות אקסיטוניות בין הצבעים בתוך ארכיטקטורת ה-DNA הסלילית הכפולה. הספקטרום הפלואורסצנטי המקביל מציג מקסימום של 537 ננומטר עבור DNA חד-גדילי.
ב-607 ננומטר עבור DNA2 חד-גדילי. וב -615 ננומטר עבור חישול, גדיל כפול של DNA1 ו- DNA2. גדיל כפול של DNA1 ו-DNA2, מראה רק את מקסימום הפליטה של צבע שתיים, אם כי צבע אחד נרגש באופן סלקטיבי, מה שמעיד על כך שהעברת האנרגיה מתרחשת ביעילות מצביעה אחת לצביעה שתיים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפרסם שינוי סינתטי של DNA על ידי תגובה קטליטית זוגית של גדיל DNA מסומן אלקין עם צד A.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את הסינתזה של גדילי DNA עם מודיפיקציית 2'-alkyne באמצעות סינתזה אוטומטית על פאזה מוצקה וכימיית phosphoramidite סטנדרטית. האוליגנוקלאוטידי DNA מסומנים לאחר הסינתזה עם שני צבעי cyanine חדשניים ויציבים פוטו-כימית באמצעות כימיית click המזורזת על ידי נחושת. גששי ה-DNA בעלי הסימון הכפול שנוצרו מאפשרים ויזואליזציה של העברת אנרגיה בעת היברידיזציה, ומספקים שינוי צבע פלואורסצנטי ברור שניתן לזיהוי באמצעות ספקטרוסקופיה או מנורת UV ניידת. גישה זו מציעה כלים חסונים לדימות מולקולרי ולתצפית בזמן אמת על תהליכים ביולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה מולקולרית
- כימיה של DNA
- ספקטרוסקופיה של פלואורסצנציה
רקע
- ניטור אינטראקציות של חומצות גרעיניות והיברידיזציה הוא חיוני בביולוגיה מולקולרית.
- גששים פלואורסצנטיים מסורתיים עלולים לסבול מפוטו-בליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית), המגביל תצפית בזמן אמת.
- העברת אנרגיה בין צבעים תורמים ומקבלים מאפשרת זיהוי רגיש של אירועים מולקולריים.
- צבעים יציבים פוטוכימית משפרים את אורך החיים של הגשש עבור יישומי דימיון.
מטרת המחקר
- סינתזה של גדילי DNA עם מודיפיקציית 2'-alkyne עבור סימון צבע ספציפי לאתרים.
- פיתוח של גששים (probes) של DNA המסומנים כפולה באמצעות צבעי cyanine פוטו-יציבים.
- הדמיה של היברידיזציית DNA באמצעות שינוי צבע פלואורסצנטי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סינתזה אוטומטית של DNA במוצק באמצעות כימיית פוספוראמידאיט.
- סימון פוסט-סינתטי של DNA בצבעי ציאנין באמצעות כימיית קליק מזורזת נחושת.
- טיהור של DNA מסומן באמצעות HPLC ואפיון באמצעות ספקטרוסקופיה של בליעה ופלואורסצנציה.
- ויזואליזציה ישירה של שינוי בצבע הפלואורסצנציה באמצעות מנורת UV ניידת.
תוצאות עיקריות
- סינתזה וסימון יעילים של גדילי DNA עם צבעי תורם ומקבל.
- מקסימומי בליעה מובחנים עבור DNA גדילי ו-DNA דו-גדילי, המעידים על שילוב מוצלח של הצבע והיברידיזציה.
- ספקטרומי פלואורסצנציה מראים העברה יעילה של אנרגיה מצבע התורם לצבע המקבל בעקבות היברידיזציה של ה-DNA.
- שינוי הצבע נצפה בקלות, ובכך מספק קריאה ברורה של התקרנות (annealing) של ה-DNA.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר סינתזה וסימון אמינים של DNA למחקרי העברת אנרגיה.
- גששים בעלי סימון כפול עם צבעים פוטו-יציבים מאפשרים דימוי מולקולרי חסון בזמן אמת.
- שיטה זו מפחיתה תוצאות חיוביות שגויות ופוטו-بلیצ'ינג (הבהרה פוטוכימית), ובכך משפרת את חקר האינטראקציות של חומצות גרעיניות במערכות ביולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גששים להיברידציה של DNA בעלי יציבות פוטוסטבילית והסטת אורך גל מאפשרים ויזואליזציה חזקה ובזמן אמת של אינטראקציות של חומצות גרעיניות, ובכך תומכים ישירות בגילוי מוקדם ובפיתוח בדיקות במחקר ופיתוח (R&D) בביופארמה. הגששים בעלי הסימון הכפול מספקים קריאות פלואורסצנציה כמותיות וברורות, המפחיתות תוצאות חיוביות שגויות ומגבירות את הביטחון החזוי בזרימות עבודה של דימוי מולקולרי. יכולת זו מחזקת את תיקוף המטרה ואת הפחתת הסיכונים המכניסטיים בנקודות השבח הקריטיות של תהליך הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ובפיתוח של ביו-פרמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של היברידיזציה של חומצות גרעין לצורך חקירה פונקציונלית של המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת שינוי צבע פלואורסצנטי חד-משמעי בעת היברידיזציה.
- משפר את הביטחון החזוי במחקרי תיקוף מטרות המבוססים על חומצות גרעין.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מסייע בהכנת גשושים (probes) של DNA שעברו תיקוף עבור פלטפורמות של סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
- מספק תוצרי פלואורסצנציה סטנדרטיים, הניתנים לשחזור וכמותיים לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- מפחית תוצאות חיוביות שגויות, ובכך תומך בהערכה מהימנה של תרכובות וביכולת הרחבה (scalability) של הסריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר ניטור בזמן אמת של תהליכי חומצות גרעין, כגון עיבוד siRNA, במערכות חיות.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה בדימות מולקולרי של אירועים ביולוגיים.
- משפר את ההלימה של ביומרקרים תרגומיים באמצעות ביצועים חסונים ויציבים פוטו-גרפית של הגששים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו של גששות DNA בעלות סימון כפול משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם, דרך פיתוח הבדיקה ועד למחקר תרגומי, ובכך היא תומכת בבדיקת השערות ובקבלת תוצאות כמותיות לאורך כל רצף המחקר והפיתוח (R&D).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקה מונחית-השערה של אינטראקציות של חומצות גרעין ובבירור מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת פלטי פלואורסצנציה כמותיים וניתנים לשחזור עבור מוכנות של בדיקות ושימוש חוזר בפלטפורמה.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה מדויקת של אירועי היברידיזציה והעברת אנרגיה באמצעות אנליזה ספקטרוסקופית.
- מחקר תרגומי: תואמת את הצרכים של דימות פרה-קליני לניטור תהליכים מבוססי חומצות גרעין בזמן אמת.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמת גששים הניתנת לשימוש חוזר ויציבה פוטו-כימית, הניתנת להתאמה למגוון יעדי חומצות גרעין.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של חומצות גרעיניות.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה סטנדרטיות, ניתנות להרחבה וניתנות לשחזור של סינתזה וסימון של גששים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי מזעור תוצאות חיוביות שגויות וסיכוני דהייה פוטו-כימית (photobleaching).
- השפעה על תיק הפעילות: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות גילוי מבוססות חומצות גרעיניות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסינתזה אוטומטית של DNA ובסימון צבעים לאחר הסינתזה.
- נחוש גישה לתשתית של ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה וטיהור באמצעות HPLC.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של סינתזת גששים ופרוטוקולים אנליטיים.
- ניתן להתאמה לרצפי חומצות גרעיניות שונות ולמודלים של היברידיזציה.
- תלוי בזמינות של צבעים פוטו-יציבים ובתאימות למערכות המטרה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Synthesis of the Dyes
1:48
Synthesis of the DNA Strands
2:25
"Clicking" Procedure and HPLC Purification
4:15
Sample Preparation and Spectroscopy
5:52
Results: Absorption and Fluorescence Spectroscopy Changes upon DNA Hybridization
7:18
Conclusion
