פנוטיפי אנליזה פונקציונלית של תאים תקינה T הופעל מבודדת מן עכברים הנגועים בנגיף לימפוציטית כרונית Choriomeningitis

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את תפקוד הדיכוי במבחנה של תאי T רגולטוריים, המבודדים מעכברים נגועים בנגיף כרוני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות לגבי הפנוטיפ ותפקוד הדיכוי במבחנה של תאי T רגולטוריים מופעלים במהלך זיהום וירוס כרוני. טכניקה זו יכולה להעריך את ההשפעה הישירה של תאי T רגולטוריים על הפרט עם תגובה חיובית לתאי T במבחנה.

זהו יתרון גדול של טכניקה זו. התחל בהעברת חמש פעמים עשר עד החמישית סך הלימפוציטים הטחוליים ב-50 מיקרוליטר של מאגר פאקס לכל באר של צלחת U תחתונה חדשה של 96 בארות, ואחריה 150 מיקרוליטר של מאגר פאקס. צנטריפוגה את הצלחת והשליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן מערבבים את כדורי התאים ושוטפים את התאים פעמיים נוספות ב-200 מיקרוליטר של מאגר פאקס לבאר. לאחר השטיפה השנייה, השעו את הכדורים ב -50 מיקרוליטר קוקטייל נוגדנים לבאר, למשך 20 דקות בחושך בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים במאגר פאקס, ושפכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, תקן את התאים למשך 20 דקות בחושך בארבע מעלות צלזיוס עם 100 מיקרוליטר של מאגר קיבוע, ואחריו שתי שטיפות עם מאגר שטיפת חדירה. לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את התאים ב -50 מיקרוליטר של נוגדן נגד FOXP3. להכנת החרוזים המצופים נגד CD3 CD28, העבירו את הנפח המתאים של חרוזים מגנטיים לצינור של 15 מיליליטר, והוסיפו נפח שווה של PPS.

מערבבים בעדינות את התמיסה על ידי פיפטינג, וצנטריפוגה את החרוזים המגנטיים. בתום הכביסה יש להשליך את הסופרנטנט ולדלל את החרוזים ב -50 מיקרוליטר של מדיום שלם לבאר. לאחר מכן, זרעו 50 מיקרוליטר של אחד כפול עשר לתאי T רגולטוריים חיוביים חיוביים CD4 חיוביים לבאר בצלחת תחתונה של 96 באר U, ואחריהם 50 מיקרוליטר של אחד כפול עשר לתאי T חיוביים ל-CD8 החמישי לכל באר.

לאחר שכל התאים מצופים, הוסיפו 50 מיקרוליטר של החרוזים המצופים נגד CD3 CD28 המדוללים לכל באר, והוסיפו עד 50 מיקרוליטר של מדיום כדי להביא את הנפח הכולל של כל באר עד 200 מיקרוליטר. לאחר מכן מכסים את הצלחת בנייר כסף ומניחים אותה על 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני למשך 72 שעות. כדי לנתח את ייצור הציטוקינים של תאי T חיוביים CD8, לאחר שלושה ימים של תרבית, העבירו את הסופרנטנטים לצלחת נוספת של 96 בארות ונתחו את הסופרנטנטים על ידי ELISA, על פי הוראות היצרן.

כדי לנתח את התפשטות תאי ה-T החיוביים CD8, שטפו את צלחת התאים עם מאגר facs שלוש פעמים. לאחר מכן השעו מחדש את הכדורים ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים מתאים כנגד תאי T חיוביים CD8 שהתרבו למשך 20 דקות בחושך בארבע מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים פעמיים במאגר facs ולתקן אותם למשך 20 דקות בחושך בארבע מעלות צלזיוס עם 100 מיקרוליטר של מאגר קיבוע.

לבסוף, שטפו את התאים פעמיים נוספות במאגר facs והשעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של מאגר facs. לאחר מכן מדוד את אחוז התפשטות תאי ה-T החיוביים CD8 המסומנים בפילאט על ידי ציטומטריית זרימה. בלימפוציטים של הטחול המתקבלים מעכברים תמימים ונגועים, PD-1 מווסת באופן ספציפי הן בתאים חיוביים ל-CD4 שליליים של FOXP3 והן בתאים חיוביים ל-CD8 שליליים של עכברים נגועים ב-LCMV.

השכיחות של תאי T חיוביים ל-CD4 חיוביים ל-FOXP3 גבוהה פי שניים בעכברים נגועים בשיבוט LCMV 13 מאשר בעכברים נאיביים, כאשר רוב התאים החיוביים ל-CD4 חיוביים ל-FOXP3 מציגים גם פנוטיפ גבוה של PD-1 מופעל. ניתן להפריד תאי T חיוביים ל-CD8 בהצלחה ללא זיהום משמעותי על ידי תאים חיסוניים אחרים. לאחר בידוד תאי T רגולטוריים, ניתן להשיג אוכלוסייה דומיננטית של תאי T חיוביים ל-CD25 עם טוהר של יותר מ-80 אחוזים.

הגירוי של תאי T מווסתים ומגיבים מבודדים על ידי חרוזים מצופים CD3 CD28 מביא לעיכוב של תאי T מגיבים חיוביים CD8 באופן תלוי מינון. ואכן, כאשר תאי T מגיבים חיוביים ל-CD8 עוברים תרבית משותפת עם תאי T רגולטוריים כרוניים ביחס של אחד לאחד, התפשטות תאי ה-T החיוביים ל-CD8 מעוכבת באופן משמעותי. ייצור גמא אינטרפרון על ידי תאי מגיבים חיוביים CD8 מעוכב באופן משמעותי גם כאשר תאי T מגיבים חיוביים ל-CD8 עוברים תרבית משותפת עם תאי T רגולטוריים מופעלים מעכברים נגועים כרוניים, בהשוואה לתרבית משותפת עם תאי T רגולטוריים במנוחה מעכברים נאיביים.

מצאנו שניתן להשלים טכניקה זו תוך 80 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן שאתה מנסה הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בתאי T רגולטוריים מבודדים טריים מיד לאחר בידודם. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הרפואה לחקור את תפקודם של תאי T רגולטוריים במחלה דלקתית כרונית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר הליך דיכוי תאי T רגולטורי במבחנה, באמצעות מערכת תרבית משותפת של תאי T רגולטוריים ומגיבים.