Name: ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: למד לדמיין מולקולות DNA גדולות באמצעות חלבון פלואורסצנטי DNA binding peptide וזרימות מיקרופלואידיות. שיטה זו מאפשרת ניתוח DNA בודד במיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר של אוניברסיטת סוגאנג לשנת 201410036.

1. DNA biotinylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylation של DNA חוד מעוגל באמצעות מסוף transferase (TDT) הערה: השתמש T4 DNA (166 KBP), שהינה DNA חוד מעוגל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 2.5 מ&quot;מ 2 CoCl, 5 μl של 10 × חיץ התגובה, 0.5 μl של 10 מ&quot;מ ביוטין-11-dUTP, 0.5 μl של transferase הטרמינל (10 יחידות), ו -0.5 μl של ה- DNA T4 (0.5 מיקרוגרם / μl) לתערובת התגובה. הפוך לנפח סופי של 50 μl ידי הוספת 38.5 μl של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. הערה: זמן תגובה מורחבת עשוי להניב הדנ&quot;א הדו-קשור, כלומר, יתכן כי biotins מתויג בשני קצותיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי הוספת 5 μl של 0.5 מ &#39;EDTA, pH 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylation של DNA הסתיימה דביק שימוש DNA האנזים הערה: DNA λ השתמש (48.5 KBP), שהינה DNA דביק-סוף. &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של ה- DNA האנזים T4, 5 μl של חיץ קשירת 10 ×, 1 μl של 25 ng / μl DNA הפאג λ, ולהוסיף 43 μl של מים כדי ליצור נפח סופי של 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. derivatization Surface הפונקציונלי הערה:. על מנת לקשור קץ של מולקולת דנ&quot;א על משטח זכוכית, קבוצה אמינית העיקרי הוא silanized על coverslip ואחריו ציפוי ביוטין-PEG כפי שמוצג באיור 1 תהליך PEGylation זה חשוב הדמיה DNA מולקולה בודדת כי זה יכול להקטין אקראי רעש נוצר על ידי התקשרות של רצויי מולקולות משמעותיים על פני השטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיראנה ניקוי הערה: פתרונות פיראנה להגיב נמרצות עם חומרים אורגניים, ולכן זה צריך להיות מטופל בזהירות, עמידה בהנחיות בטיחות נאותה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslips על מדף polytetrafluoroethylene (PTFE), ולהחזיק אותם בy PTFE חותם חוט קלטת לאורכו, חצי על קצה משטחים וחצי על המדף. לאחר גלישה, להשאיר חתיכה ארוכה (~ 5 סנטימטרים) של סרט לטיפול המתל במהלך הליך הניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כוס זכוכית 1 ליטר עם 350 מ&quot;ל של H 2 SO 4 ו -150 מ&quot;ל של H 2 O 2 כדי להפוך פתרון פיראניה במנדף. מניחים את מתלה בתמיסה פיראניה במשך שעה 2.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון פיראניה ריק מן הקנקן, ולשטוף coverslips ביסודיות עם מים ללא יונים עד pH של המים בכוס מגיע נייטרלי. השתמש רצועות נייר pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate המדפים של תלושים לכסות במים המכילים המבחנה, למשך 30 דקות. מים ריקים מהקנקן רק לפני silanization אמינו. השתמש 75 ואט sonication לנקות derivatize מצעי הזכוכית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aminosilanization על משטח זכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine ו -10 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית 200 מ&quot;לשל מתיל אלכוהול במיכל פוליפרופילן נקי להכנת הפתרון aminosilanization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslips לנקות בתוך המיכל פוליפרופילן. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל&quot;ד ו החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate כוס עם מכסה מחליק derivatized במשך 15 דקות ב 75 W. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל&quot;ד ו מקום לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את הפתרון מן הקנקן, ולשטוף coverslips בזהירות, פעם עם אלכוהול מתיל, ופעמיים עם כוהל אתילי. coverslips אחסן כוהל אתילי ולהשתמש בהם תוך שבועיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PEGylation של coverslip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 10 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;סודיום ביקרבונט (NaHCO 3). סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2 מ&quot;ג של קרבונט ביוטין-PEG-succinimidyl (ביוטין-PEG-SC) ו -80 מ&quot;ג של valerate PEG-succinimidyl (MPEG-SVG) ב 350 μl של NaHCO 3. השתמש צינור הגנת אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס צינור נמרצות במשך 10 שניות, צנטריפוגות אותו ב 10,000 g × דקות 1 כדי להסיר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף שקופית זכוכית עם אצטון, ואחריו שטיפה עם כוהל אתילי. אפשר את השקופית אוויר יבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח ירידה (50 μl) של פתרון PEG בשקופית הזכוכית הנקיה. מכסים את אגל בעדינות עם תלוש כיסוי silanized אמינו, מבלי ליצור בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית עבור 3 שעות עד לילה חשוך, גם מפולס בתא לח בטמפרטורת חדר. השתמש בעל קצה פיפטה וריק כמו התא, עם מים בתחתית. חותם פתרון PEG שיורית בצינור ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את coverslip PEGylated ביסודיות עם מים ללא יונים. אחסן אותו במקום חשוך ויבש עד השימוש. </li></ol></li></ol> 3. הרכבת תא זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק בעל אקריליק אגרוף, כמו באיור 2. ודא בקוטר של להכניס צינורות הוא 0.762 מ&quot;מ, וציין חור אחד הוא מפרץ קטן והשני הואלשקע (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח רצועות סרט דביקות דו-צדדיות (רוחב 5-6 מ&quot;מ) על בעל אקריליק (איור 2), יישור בניצב חור כניסה ויציאה, לא מביך כל חורי ערוץ. השתמש רצועות קלטת אלה קירות רב ערוצית לעשות תאים. שפשפו את הקלטת באמצעות קצה pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip PEGylated על העליונה כדי ליצור תאי זרימה, כשהצד PEGylated עם הפנים כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע כל פתרון דליפה, לחץ על החלק העליון של coverslip על האזור שבו קלטות דו צדדית ממוקמות. להוסיף דבק אפוקסי מהיר יבש כדי לסגור את הקצוות של החדר בראש בתחתית (צבע צהוב באיור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קטע קצר (2.5 ס&quot;מ) של צינורות (קוטר חיצוני, OD, 0.042 &quot;) כדי מזרק חזק גז ולאטום המפרק עם דבק אפוקסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות (OD: 0.03 &quot;) ארוכים וגמישים אל הצינורות צמודים המזרק ולאטום מפרק עם דבק אפוקסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הטוביםng צמוד מזרק עם מים די. ודא שאין בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצינור לתוך החור של תא הזרימה חתום עם דבק אפוקסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפ צהוב (200 קצה μl) על החור אחרים כמאגר. </li></ol> 4. טוענים דוגמא אל לשכת התזרים הערה: Neutravidin ניתן להחליף חלבונים avidin אחרים כגון streptavidin. כל התגובות יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, אלא אם כן היא מוזכרת. קח פתרון מדגם טיפ צהוב, ולהתקין את הקצה עם הפתרון לתוך החור של בעל אקריליק (איור 2b). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הזרימה של המשאבה מזרק ב 50 μl / min. טען 20 μl של חלבון avidin (25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בתמיסה T50, טריס 10 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ NaCl, pH 8), ולשמור אותו במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 20 μl של oligodeoxynucleotides biotinylated (100 מיקרומטר 1 × TE), ולשמור אותו במשך 10 דקות. אם transferase הטרמינל משמש, לדלג על הטעינהשל oligodeoxynucleotides. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 20 μl של פתרון ה- DNA משלב 1 לתוך תא זרימה בקצב זרימה של 10 μl / min, ולשמור אותו במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את תא הזרימה עם 1 × TE, ולטעון 40 μl של 10 FP-DBP (~ 80 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים DNA תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם זרימה רציפה של מולקולות מכתימות ב 1 × TE על עדשה אובייקטיבית 60X. השתמש 488 לייזר מצב מוצק ננומטר עירור של FP (eGFP) -DBP. עבור מתיחה מלאה של מולקולות DNA, להחיל ספיקות שונות לפי אורכי DNA בשימוש. לדוגמה, להחיל 50 μl / min 48.5 KBP של DNA λ, ו 100 μl / min 166 KBP של דנ&quot;א T4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מחזור של בעל אקריליק, להשרות תאי זרימה התאספו בתמיסת דטרגנט בית 12. הסר קלטות אפוקסי עם סכין גילוח ולשפשף עם ידות כדי לקחת אותם לגמרי. סתימה חורה עם מחטי מזרק. שמור על הבעלים במי deionized עד לשימוש נוסף. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li>
<li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li>
<li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li>
<li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מציגים פלטפורמה המאפשר הדמיה מולקולות דנ&quot;א ארוכות biotinylated לעיגון על משטחים. דיווחנו גישה עבור מולקולות DNA קשור על משטח מצופה חלבון avidin עם אלבומין בסרום שור biotinylated. 6 לפי הגישה קודם לכן, מצאנו נושא מכריע של מחשוף צילום DNA הנגרם על ידי צבעי bis-העיבור כי להכתים מולקולות DNA קשור על משטח. כמו fluorophores נרגש הרף אלה יש סבירות גבוהה לתקיפה עמוד שדרה פוספט DNA, 9 הכוח אור עירור היה צריך להיות ממוזער כדי למנוע מחשוף התמונה. <p cla...

ויזואליזציה של מולקולות דנ&quot;א גדולות קשורות ברצועה על משטחי זכוכית או חרוז נוצלה על חקירת אינטראקציות חלבון דנ&quot;א, דינמיקת חלבון על מצע DNA, 1,2 ופיזיקת פולימר. 3,4 פלטפורמת מולקולות דנ&quot;א גדולות יחידות קשורות יש כמה ברור יתרונות בהשוואה לשיטות וקיבוע DNA אחרים. 5 ראשית, מולקולת דנ&quot;א גדולה הקשורה על פני השטח יש קונפורמציה טבעי אקראי סליל ללא אספקת גזירה, מהם החשיבות מכרעת עבור חלבון-DNA מחייבת להכיר אתר הקישור שלו. שנית, זה מאוד קל לשנות את הסביבה הכימית סביב מולקולות DNA לסדרת תגובות אנזימטיות בתא זרימה. שלישית, זרימת גזירת microfluidic גורמת DNA המולקולרית המתיח עד 100% של אורך המסלול המלא, וזה מאוד קשה להשיג באמצעות התארכות DNA גישות חלופית כגון משטח וקיבוע 6 וכליאת nanochannel. 7 מלא stretcheמולקולת הדנ&quot;א ד גם מספקת מידע מיקומית כי יכול להיות שימושי עבור ניטור תנועות האנזימטית על המפה הגנומי. אף על פי כן, גישת קשירת DNA יש חסרון קריטי כי לצבוע intercalating כגון YOYO-1 בדרך כלל גורם למולקולות DNA קשורות להישבר בקלות על ידי אור עירור קרינה. באופן כללי, מולקולות דנ&quot;א גדולות צריכות להיות מוכתמות עם פלורסנט לצבוע להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לשם כך, YOYO-1 או צבעי סדרת הטוטו אחרים משמשים בעיקר בגלל צבעים אלה לזרוח רק כשהם intercalate פעמיים גדילי דנ&quot;א. 8 עם זאת, ידוע כי bis-intercalating לצבוע גורם צילום מחשוף DNA האור הנגרמת בגלל של עיבור fluorophores. 9 יתר על כן, מולקולות DNA מוכתמות fluorescently הקשור על פני השטח הן יותר שבירות מאז תזרים גזירה יכול להפעיל שבירת כוחות על העברת מולקולות DNA באופן חופשי. לכן, פיתחנו FP-DBP כרומן DNA-מכתים חלבון לצבוע הדמית מולקולות דנ&quot;א גדולות קשורות ברצועה על פני השטח. היתרון של שימוש FP-DBP הוא שזה לא לגרום צילום מחשוף של מולקולות DNA שאליו הוא נקשר. 10 בנוסף, FP-DBP אינה מגדילה את אורך קווי המתאר של ה- DNA, ואילו צבעים-intercalating bis להגדיל את אורך המסלול בכ -33%. שיטת וידאו זה מציגה את הגישה ניסיון אולי לקשירת מולקולות דנ&quot;א גדולות משטח PEG-ביוטין. איור 1 מדגים גישות שונות של קשירת DNA עם קצוות בוטים קצוות דביקים. לכן, שיטה מכתימה זה יכול להיות מיושמת על כל סוג של מולקולת הדנ&quot;א. איור 2 מתאר ייצוג סכמטי של הרכבת תא הזרימה שיכולה להיות נשלטה על ידי משאבת מזרק כדי ליצור תזרים גזירה למתוח מולקולות דנ&quot;א וכן לטעון כימיים אנזים פתרונות. איור 3 מדגים micrographs של מולקולות DNA נמתח מלא קשורה על PEGylatמשטח ed 11 ומוכתם FP-DBP.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>1. DNA Biotinylation</td></tr><tr><td colspan="4">1.1) ביוטינילציה של DNA קהה באמצעות Terminal Transferase (TdT)</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>מסופק עם מאגר תגובה פי 10, 2.5 מ"מ קובלט כלוריד</td></tr><tr><td>ביוטין-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>ביוטין-ddNTP זמין גם</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>1.2) ביוטינילציה של DNA קצה דביק באמצעות DNA Ligase</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>מסופק עם מאגר תגובה פי 10</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>זמין גם ב-New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>2. פונקציונליזציה משטח נגזרת</חזק></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>2.1) פיראנה ניקוי</חזק></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 מ"מ x 22 מ"מ, מס' 1 עובי</td></tr><tr><td>מתלה</td><td></td><td></td> טפלון <td>ייצור מותאם אישית</td></tr><tr><td>PTFE חוט חותם קלטת</td><td>האן יאנג כימיקלים בע"מ</td><td>3032292</td><td>טפלון ומסחר; קלטת</td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H2SO4, 95% טוהר</td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H2O2, 35% במים</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>מנקה אולטרסאונד שולחני</td></tr><td colspan="4"><חזק>2.2) אמינוסילניזציה על משטח זכוכית</חזק>N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine Sigma-Aldrich 104884 חומצה אצטית קרחונית Duksan Chemicals 414 99% טוהר מתיל אלכוהול Jin Chemical Co. Ltd.<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>M300318</td> מיכל פוליפרופילן <td>99.9% טוהר</td></tr><tr><td></td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>אתיל אלכוהול</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300202</td><td>99.9% טוהר</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>2.3) PEGylation של הכיסוי</חזק></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין-PEG-SC</td><td>Laysan ביו</td><td>ביוטין-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>ג'ין כימיקלים בע"מ</td><td>A300129</td> שקופיות מיקרוסקופ <td>טוהר 99%</td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td> <td>~ 76 מ"מ x 26 מ"מ x 1&nbsp; mm</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>3. הרכבת תא זרימה</חזק></td></tr><tr><td>אקריליק תמיכה</td><td></td><td></td><td>בייצור מותאם אישית</td></tr><tr><td>סרט דו צדדי</td><td>3M</td><td></td><td>סוג שקוף</td></tr><tr><td>אפוקסי ייבוש מהיר</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>גז אטום 250 ומיקרו; l מזרק</td><td>המילטון</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>4. טעינת דגימה לתוך תא זרימה</חזק></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>מיקרוסקופ בסיס Trizma</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>לייזר מצב מוצק (488&nbsp; nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של מולקולות dna גדולות קשור surface עם dna חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

מולקולות DNA גדולות הקשורות על משטח הזכוכית הפונקציונלית שימשו בפיזיקה של פולימרים ובביוכימיה, במיוחד לחקירת אינטראקציות בין DNA לחלבוני הקישור שלו. כאן, אנו מדווחים על שיטה המשתמשת במיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיית מולקולות DNA גדולות הקשורות על פני השטח. ראשית, כיסויי זכוכית עוברים ביוטינילציה ופסיבציה על ידי ציפוי בפוליאתילן גליקול ביוטיניל, הקושר באופן ספציפי DNA ביוטיניל באמצעות מקשרים לחלבון אבידין ומפחית משמעותית קשירה לא רצויה מאינטראקציות לא ספציפיות של חלבונים או מולקולות DNA על פני השטח. שנית, מולקולות הדנ"א עוברות ביוטינילציה בשתי שיטות שונות בהתאם לטרמינלים שלהן. ה-DNA הקהה מתויג עם dUTP ביוטיניל בקצה ההידרוקסיל 3' שלו, על ידי טרנספראז טרמינלי, בעוד שה-DNA הדביק מוכלא עם אוליגונוקלאוטידים משלימים ביוטיניים על ידי DNA ליגאז. לבסוף, זרימת גזירה מיקרופלואידית גורמת למולקולות DNA בודדות להימתח לאורכי המתאר המלאים שלהן לאחר שנצבעו בפפטיד קושר חלבון-DNA פלואורסצנטי (FP-DBP).

איור 1 מציג שתי שיטות קשירת DNA שונות בהתאם מבני מסוף של מולקולת הדנ&quot;א. האיור 1 א ממחיש כיצד מולקולות DNA הסתיימו הדביקות הם הכלאה עם oligonucleotides biotinylated משלים, אשר משותק על פני שטח PEG מצופה avidin. 1B איור מראה תוספת של biotinylated ddNTP או dNTP לקבוצת הידרוקסיל &#39;3 של ה- DNA חוד מעוגל ידי transferase הטרמינל. הוספנו linkers גמישה בין מולקולות דנ&quot;א ביוטין. עובדה זו הגבירה ...

אנו מציגים גישה להמחשת מולקולות DNA גדולות מוכתמות בפפטיד קושר DNA של חלבון פלואורסצנטי (FP-DBP) הקשורות על הפוליאתילן גליקול (PEG) ומשטח הזכוכית המצופה אבידין ונמתחות בזרימות גזירה מיקרופלואידיות.

ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מערכת נוחה לניתוח DNA עבור מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי, לצורך מניפולציה של מולקולות DNA בודדות על משטחי זכוכית משופרים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום ההדמיה של DNA, בעת בחינת ה-DNA עצמו, כמו גם חלבונים נקשרי DNA ומולקולות קטנות אחרות.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לצפות בניא-DNA נע ולנתח אותו בקלות. ראשית, הניחו כיסויי זכוכית (coverslips) על גבי מעמד PTFE ואבטחו אותם במקומם באמצעות סרט דביק של PTFE למניעת דליפות. לאחר עטיפת כיסויי הזכוכית, השאירו קטע של 5 cm מהסרט שיישמש לאחיזה במעמד במהלך הליך הניקוי.בתוך מנדף כימיים, ערבבו 350 milliliters של חומצה גופרית ו-150 milliliters של מי חמצן בתוך כלי זכוכית (beaker) בנפח של ליטר אחד כדי להכין תמיסת תקיפה מסוג piranha. לאחר מכן, הכניסו את מתקן כיסויי הזכוכית (coverslips) אל תוך התמיסה. לאחר שעתיים, רוקנו את הכלי ושטפו היטב את כיסויי הזכוכית במים דה-יוניים.המשיכו לשטוף את כיסויי הזכוכית (coverslips) עד שה-pH של המים בכלי השקיף יגיע ל-pH ניטרלי. לאחר מכן, בצעו סוניקציה למסדי כיסויי הזכוכית בכלי שקיף המכיל מים למשך 30 דקות, כדי לנקות ולהכין את תשביות הזכוכית. רוקנו את המים מהכלי רגע לפני תהליך האמינוסילניזציה. כדי להתחיל, הכינו את תמיסת האמינוסילניזציה על ידי הוספת 2 milliliters של alkoxysilane ו-10 milliliters של glacial acetic acid ל-200 milliliters של methyl alcohol בתוך כלי פוליפרופילן נקי.בשלב הבא, הכניסו את כיסויי הזריקה הנקיים לתוך התמיסה. לאחר מכן, הניחו את כיסויי הזריקה שנוקו בתמיסה שהוכנה ונערו אותם בטמפרטורת החדר ובמהירות של 100 rpm למשך 30 דקות. לאחר מכן, בצעו סוניקציה למכל עם כיסויי הזריקה שעברו דריבטיזציה למשך 15 דקות בהספק של 75 watts.לאחר מכן, נער אותם שוב בטמפרטורת החדר ובמהירות של 100 rpm למשך 30 דקות לפחות. עם סיום התהליך, רוקנו את התמיסה מהכלי ושטפו את כיסויי הזכוכית שלוש פעמים, בזהירות. פעם אחת עם מתיל אלכוהול ופעמיים עם אתיל אלכוהול.לאחר השטיפה האחרונה, יש לאחסן את כיסויי הזריקה (coverslips) באתיל אלכוהול ולהשתמש בהם תוך שבועיים. ראשית, הכינו 10 milliliters של תמיסת sodium bicarbonate בריכוז 0.1 molars וסננו אותה דרך מסנן מזרקה של 0.22 micron. לאחר מכן, המיסו שני milligrams של biotin PEG succinimidyl carbonate ו-80 milligrams של PEG succinimidyl valerate לתוך 350 micro liters של תמיסת sodium bicarbonate המסוננת.הגנו על התמיסה מפני אור באמצעות מבחנה להגנה מאור. ערבבו את המבחנה במיקסר וורטקס (vortex) בעוצמה, למשך 10 שניות, ולאחר מכן סבבו אותה בצנטריפוגה ב-10,000 x g למשך דקה אחת כדי להסיר בועות אוויר. לאחר מכן, שטפו פלטה מזכוכית באצטון ולאחר מכן באתנול.לאחר השטיפה, הניחו לשקופית להתייבש לחלוטין באוויר. טפטפו 50 µL מתמיסת ה-PEG על השקופית הזכוכית הנקייה. הניחו לאט כיסוי זכוכית שעבר סילניזציית אמינו (amino silanized) על הטיפה בזווית קלה, כדי למנוע היווצרות בועות אוויר מתחת לכיסוי.לאחר מכן, הניחו את השקופיות בתא מאוזן, חשוך ולח למשך שלוש שעות לפחות ועד ללילה, בטמפרטורת החדר. בסיום, אטמו את תמיסת ה-PEG שנותרה בשפופרת הגנה מאור, ושמרו אותה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שטפו היטב את כיסויי הזכוכית שעברו פגילציה (PEGylated) במים דאיונזים, ולאחר מכן אחסנו אותם במקום חשוך ויבש עד לשימושם.כדי ליצור את תא הזרימה, מקמו רצועות של סרט דביק דו-צדדי על מחזיק אקרילי, כך שיהיו מיושרות בניצב לחורי הכניסה והיציאה ולא יפריעו לאף אחד מחורי הערוץ. לאחר מכן, שפשפו את הסרט באמצעות קצה של פיפט כדי לאטום את הערוצים. בשלב הבא, הניחו כיסוי זכוכית (coverslip) PEGylated, כאשר הצד ה-PEGylated פונה כלפי מטה, על גבי הסרט כדי ליצור את תאי הזרימה.כדי למנוע דליפה של תמיסות, לחץ את חלקו העליון של כיסוי זכוכית (coverslip) על האזור שבו ממוקם הסרט הדו-צדדי. לאחר מכן, הוסף דבק אפוקסי ליישוש מהיר לקצוות התאים כדי לקבע אותם במקומם. לאחר מכן, חבר קטע צינור באורך 2.5 סנטימטר למזרק אטום לגז ואטום את החיבור באמצעות דבק אפוקסי.לאחר מכן, חברו צינור גמיש וארוך לצינור המגיע מהמזרק. שוב, אטמו את החיבור באמצעות דבק אפוקסי. מלאו את הצינור המחובר למזרק במים דה-יוניים, תוך כדי וידוא שאין בתוכו בועות אוויר.בשלב הבא, הכניסו את הפיתול לתוך החור של תא הזרימה שנאטם בדבק אפוקסי. הניחו טיפ פניפטה של 200 microliter על החור השני, שישמש כמאגר. הגדירו את קצב הזרימה של משאבת מזרק ל-50 microliters per minute.לאחר מכן, העבירו 20 µL של תמיסת חלבון אווידין (avidin) אל תוך התא והשאירו אותה שם למשך 10 דקות. לאחר מכן, טענו 20 µL של אוליגו-דאוקסי-נוקלאוטידים מביוטיניליים למזרק. העבירו אותם אל התא והשאירו אותם שם למשך 10 דקות.אם נעשה שימוש בטרמינל טרנספראז, יש לדלג על טעינת האוליגו דאוקסי נוקלאוטידים. לאחר מכן, טענו 20 µl של תמיסת DNA למזרק, הזרים אותה אל התא בקצב של 10 µl לדקה והשאירו אותה שם למשך 30 דקות. לאחר דגירה של 30 דקות, שטפו את תא הזרימה עם 40 µl של באפר 1X TE בקצב של 50 µl לדקה.לאחר השטיפה, טענו את התא ב-40 µL של אותו FP-DBP בריכוז של 80 nM, ב-1X TE. כדי לראות את מלוא טווח המתיחה של מולקולות ה-DNA, החילו קצבי זרימה שונים בהתאם לאורכי ה-DNA שבהם נעשה שימוש. צפו ב-DNA תחת עדשה אובייקטיבית של 60X, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. להלן סרטון ממיקרוסקופ פלואורסצנטי המציג מולקולות DNA של בקטריופאג lambda, המעוגנות לפני השטח ונמתחות על ידי זרימה לאחר ליגציה עם אוליגו-נוקלאוטידים משלימים בביוטיניציה.תחת זרימה, מולקולות ה-DNA המתוחות במלואן מגיעות לאורך של 16.5 microns. לעומת זאת, מולקולות ה-DNA של הבקטריופאג T4 נמתחות לאורך של 56.4 microns תחת זרימה. התארכות זו היא הפיכה, וניתן להאריך ולהרפות את ה-DNA מספר פעמים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה על האופן שבו ניתן להשתמש ב-FP-DBP בניתוח של DNA גדול יותר, וכן תוכלו להדגים מתיחה והרפיה של פולימר DNA.

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים שילוב רומן רב עוצמה של nanophotonics (QD-סריג) ו מיקרופלואידיקה לחקור את היווצרות polyplexes polyelectrolyte, אשר צפוי לספק שליטה טובה יותר וסינתזה של polyplexes אחיד להתאמה אישית עבור חומצה מבוססי גרעין עתיד הרפוי.

שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

סרטון וידאו זה מתאר שיטה להמחשת הרכבה של חלבון היתוך מעובה על מולקולות DNA באתרים ספציפיים באמצעות הדמיה של מולקולה יחידה. עיבויים אלה נוצרים כתוצאה מאינטראקציות LCD-LCD ו-LCD-DBD, המאפשרות גיוס של RNA פולימראז II ושעתוק גנים משופר.

הדמיה של מולקולה בודדת להדמיית חלבון היתוך מעבה הרכבה על וילונות DNA

מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת מאפשרת התבוננות ישירה וכימות של אינטראקציות החלבון-DNA בתאי חיידקי Escherichia חיים.

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

מאמר זה מציג הליך ניסויי מפורט לבנייה מחדש של קשירי דנ"א המכילים נוקלאוזומים עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מתאר גם מספר ניסויים במורד הזרם שניתן לבצע כדי להמחיש את התנהגות הקישור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם כרומטין, ולנתח שינויים בתכונות הפיזיקליות של נוקלאוזומים.

מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

למד לדמיין מולקולות DNA גדולות באמצעות חלבון פלואורסצנטי DNA binding peptide וזרימות מיקרופלואידיות. שיטה זו מאפשרת ניתוח DNA בודד במיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת.

ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

גלה סרטונים נוספים