ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד
23 ביוני 2016
אנו מציגים גישה להמחשת מולקולות DNA גדולות מוכתמות בפפטיד קושר DNA של חלבון פלואורסצנטי (FP-DBP) הקשורות על הפוליאתילן גליקול (PEG) ומשטח הזכוכית המצופה אבידין ונמתחות בזרימות גזירה מיקרופלואידיות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מערכת נוחה לניתוח DNA עבור מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי, לצורך מניפולציה של מולקולות DNA בודדות על משטחי זכוכית משופרים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום ההדמיה של DNA, בעת בחינת ה-DNA עצמו, כמו גם חלבונים נקשרי DNA ומולקולות קטנות אחרות.
היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לצפות בניא-DNA נע ולנתח אותו בקלות. ראשית, הניחו כיסויי זכוכית (coverslips) על גבי מעמד PTFE ואבטחו אותם במקומם באמצעות סרט דביק של PTFE למניעת דליפות. לאחר עטיפת כיסויי הזכוכית, השאירו קטע של 5 cm מהסרט שיישמש לאחיזה במעמד במהלך הליך הניקוי.
בתוך מנדף כימיים, ערבבו 350 milliliters של חומצה גופרית ו-150 milliliters של מי חמצן בתוך כלי זכוכית (beaker) בנפח של ליטר אחד כדי להכין תמיסת תקיפה מסוג piranha. לאחר מכן, הכניסו את מתקן כיסויי הזכוכית (coverslips) אל תוך התמיסה. לאחר שעתיים, רוקנו את הכלי ושטפו היטב את כיסויי הזכוכית במים דה-יוניים.
המשיכו לשטוף את כיסויי הזכוכית (coverslips) עד שה-pH של המים בכלי השקיף יגיע ל-pH ניטרלי. לאחר מכן, בצעו סוניקציה למסדי כיסויי הזכוכית בכלי שקיף המכיל מים למשך 30 דקות, כדי לנקות ולהכין את תשביות הזכוכית. רוקנו את המים מהכלי רגע לפני תהליך האמינוסילניזציה. כדי להתחיל, הכינו את תמיסת האמינוסילניזציה על ידי הוספת 2 milliliters של alkoxysilane ו-10 milliliters של glacial acetic acid ל-200 milliliters של methyl alcohol בתוך כלי פוליפרופילן נקי.
בשלב הבא, הכניסו את כיסויי הזריקה הנקיים לתוך התמיסה. לאחר מכן, הניחו את כיסויי הזריקה שנוקו בתמיסה שהוכנה ונערו אותם בטמפרטורת החדר ובמהירות של 100 rpm למשך 30 דקות. לאחר מכן, בצעו סוניקציה למכל עם כיסויי הזריקה שעברו דריבטיזציה למשך 15 דקות בהספק של 75 watts.
לאחר מכן, נער אותם שוב בטמפרטורת החדר ובמהירות של 100 rpm למשך 30 דקות לפחות. עם סיום התהליך, רוקנו את התמיסה מהכלי ושטפו את כיסויי הזכוכית שלוש פעמים, בזהירות. פעם אחת עם מתיל אלכוהול ופעמיים עם אתיל אלכוהול.
לאחר השטיפה האחרונה, יש לאחסן את כיסויי הזריקה (coverslips) באתיל אלכוהול ולהשתמש בהם תוך שבועיים. ראשית, הכינו 10 milliliters של תמיסת sodium bicarbonate בריכוז 0.1 molars וסננו אותה דרך מסנן מזרקה של 0.22 micron. לאחר מכן, המיסו שני milligrams של biotin PEG succinimidyl carbonate ו-80 milligrams של PEG succinimidyl valerate לתוך 350 micro liters של תמיסת sodium bicarbonate המסוננת.
הגנו על התמיסה מפני אור באמצעות מבחנה להגנה מאור. ערבבו את המבחנה במיקסר וורטקס (vortex) בעוצמה, למשך 10 שניות, ולאחר מכן סבבו אותה בצנטריפוגה ב-10,000 x g למשך דקה אחת כדי להסיר בועות אוויר. לאחר מכן, שטפו פלטה מזכוכית באצטון ולאחר מכן באתנול.
לאחר השטיפה, הניחו לשקופית להתייבש לחלוטין באוויר. טפטפו 50 µL מתמיסת ה-PEG על השקופית הזכוכית הנקייה. הניחו לאט כיסוי זכוכית שעבר סילניזציית אמינו (amino silanized) על הטיפה בזווית קלה, כדי למנוע היווצרות בועות אוויר מתחת לכיסוי.
לאחר מכן, הניחו את השקופיות בתא מאוזן, חשוך ולח למשך שלוש שעות לפחות ועד ללילה, בטמפרטורת החדר. בסיום, אטמו את תמיסת ה-PEG שנותרה בשפופרת הגנה מאור, ושמרו אותה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שטפו היטב את כיסויי הזכוכית שעברו פגילציה (PEGylated) במים דאיונזים, ולאחר מכן אחסנו אותם במקום חשוך ויבש עד לשימושם.
כדי ליצור את תא הזרימה, מקמו רצועות של סרט דביק דו-צדדי על מחזיק אקרילי, כך שיהיו מיושרות בניצב לחורי הכניסה והיציאה ולא יפריעו לאף אחד מחורי הערוץ. לאחר מכן, שפשפו את הסרט באמצעות קצה של פיפט כדי לאטום את הערוצים. בשלב הבא, הניחו כיסוי זכוכית (coverslip) PEGylated, כאשר הצד ה-PEGylated פונה כלפי מטה, על גבי הסרט כדי ליצור את תאי הזרימה.
כדי למנוע דליפה של תמיסות, לחץ את חלקו העליון של כיסוי זכוכית (coverslip) על האזור שבו ממוקם הסרט הדו-צדדי. לאחר מכן, הוסף דבק אפוקסי ליישוש מהיר לקצוות התאים כדי לקבע אותם במקומם. לאחר מכן, חבר קטע צינור באורך 2.5 סנטימטר למזרק אטום לגז ואטום את החיבור באמצעות דבק אפוקסי.
לאחר מכן, חברו צינור גמיש וארוך לצינור המגיע מהמזרק. שוב, אטמו את החיבור באמצעות דבק אפוקסי. מלאו את הצינור המחובר למזרק במים דה-יוניים, תוך כדי וידוא שאין בתוכו בועות אוויר.
בשלב הבא, הכניסו את הפיתול לתוך החור של תא הזרימה שנאטם בדבק אפוקסי. הניחו טיפ פניפטה של 200 microliter על החור השני, שישמש כמאגר. הגדירו את קצב הזרימה של משאבת מזרק ל-50 microliters per minute.
לאחר מכן, העבירו 20 µL של תמיסת חלבון אווידין (avidin) אל תוך התא והשאירו אותה שם למשך 10 דקות. לאחר מכן, טענו 20 µL של אוליגו-דאוקסי-נוקלאוטידים מביוטיניליים למזרק. העבירו אותם אל התא והשאירו אותם שם למשך 10 דקות.
אם נעשה שימוש בטרמינל טרנספראז, יש לדלג על טעינת האוליגו דאוקסי נוקלאוטידים. לאחר מכן, טענו 20 µl של תמיסת DNA למזרק, הזרים אותה אל התא בקצב של 10 µl לדקה והשאירו אותה שם למשך 30 דקות. לאחר דגירה של 30 דקות, שטפו את תא הזרימה עם 40 µl של באפר 1X TE בקצב של 50 µl לדקה.
לאחר השטיפה, טענו את התא ב-40 µL של אותו FP-DBP בריכוז של 80 nM, ב-1X TE. כדי לראות את מלוא טווח המתיחה של מולקולות ה-DNA, החילו קצבי זרימה שונים בהתאם לאורכי ה-DNA שבהם נעשה שימוש. צפו ב-DNA תחת עדשה אובייקטיבית של 60X, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. להלן סרטון ממיקרוסקופ פלואורסצנטי המציג מולקולות DNA של בקטריופאג lambda, המעוגנות לפני השטח ונמתחות על ידי זרימה לאחר ליגציה עם אוליגו-נוקלאוטידים משלימים בביוטיניציה.
תחת זרימה, מולקולות ה-DNA המתוחות במלואן מגיעות לאורך של 16.5 microns. לעומת זאת, מולקולות ה-DNA של הבקטריופאג T4 נמתחות לאורך של 56.4 microns תחת זרימה. התארכות זו היא הפיכה, וניתן להאריך ולהרפות את ה-DNA מספר פעמים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה על האופן שבו ניתן להשתמש ב-FP-DBP בניתוח של DNA גדול יותר, וכן תוכלו להדגים מתיחה והרפיה של פולימר DNA.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להדמיה של מולקולות DNA גדולות הצבועות באמצעות פפטיד קושר-DNA עם חלבון פלואורסצנטי (FP-DBP). הטכניקה כוללת קיבוע של מולקולות אלו על פני שטח זכוכית מצופה פוליאתילן גליקול (PEG) ואווידין, ומתיחתן באמצעות זרימות גזירה מיקרופלואידיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ויזואליזציה של DNA
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- מניפולציה של מולקולה בודדת
רקע
- המחקר מתמקד בניתוח של DNA וחלבונים נקשרי DNA.
- מטרתו היא לשפר את הנוחות של מערכות לניתוח DNA.
- שיטה זו מאפשרת תצפית על DNA בתנועה.
- היא מיועדת לשימוש עם מיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת למניפולציה של מולקולת DNA בודדת.
- שיפור הוויזואליזציה של ה-DNA ושל חלבונים נלווים.
- הקלה על ניתוח הדינמיקה של ה-DNA.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת לבישי זכוכית על גבי מעמד PTFE.
- קיבוע הלבישיים באמצעות סרט איטום PTFE.
- הליך ניקוי למשטחי הזכוכית המעובדים.
- שימוש בזרימות גזירה מיקרופלואידיות למתיחת DNA.
תוצאות עיקריות
- עיגון מוצלח של מולקולות DNA גדולות על משטחים שעברו שינוי.
- ויזואליזציה יעילה של דינמיקת DNA באמצעות צביעת FP-DBP.
- יכולת משופרת לניתוח DNA בתנועה בזמן אמת.
- הדגמה של פוטנציאל השיטה במחקר DNA.
מסקנות
- הטכניקה מציעה גישה חדשנית לוויזואליזציה של DNA.
- היא מספקת תובנות לגבי אינטראקציות של DNA עם חלבוני קישור.
- שיטה זו עשויה לקדם את המחקר בתחום הביולוגיה המולקולרית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
ויזואליזציה ישירה של מולקולות DNA גדולות הקשורות לפני השטח באמצעות פפטידים קושרי DNA המצומדים לחלבון פלואורסצנטי (FP-DBP) מאפשרת חקירה מדויקת של אינטראקציות DNA-חלבון ברמה של מולקולה בודדת. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשרשראות הגילוי בביופארמה. השיטה משפרת את הביטחון החזוי עבור פיתוח בדיקות וזרימות עבודה של סריקה בשלבים הבאים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על אירועי קישור של DNA-חלבון לצורך הבהרה מכניסטית.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות קישור ל-DNA בסביבה מבוקרת.
- מקל על בחינה מונחית-היפותזה של אינטראקציות מולקולריות הרלוונטיות למסלולי מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פלטפורמה הניתנת לשחזור להכנת תשמיות DNA מתוקפות עבור מבחנים בעלי תוכן גבוה.
- מאפשר מדידה כמותית של מתיחה והרפיה של DNA תחת תנאים מוגדרים.
- תומך בסטנדרטיזציה וביכולת הרחבה לסריקת תרכובות המכוונות לאינטראקציות בין DNA לחלבונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מחקרים מכניסטיים רלוונטיים למחלות על ידי מידול דינמיקה של DNA-חלבון ברמת המולקולה הבודדת.
- מציע רצף מהשלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני עבור שיטות טיפול המכוונות ל-DNA.
- מפחית עמימות ביולוגית בהערכת סיכונים בשלבים מוקדמים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים ועד לפיתוח בדיקות ומחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת בזיהוי מובילים ובתיקוף מטרות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות והבהרה של מסלולים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה של אינטראקציות DNA-חלבון.
- סריקה: מספקת substrates של DNA קשורים לפני השטח, המוכנים לבדיקה, עם תוצאות כמותיות.
- אנליטיקה: מספקת מדידה בזמן אמת של התארכות והרפיה של DNA לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תובנות מנגוניות לתיקוף של מודלים פרה-קליניים כאשר אינטראקציות DNA-חלבון רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מחקרים מגוונים של חלבונים נקשרי DNA לאורך תוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליך תיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה לוויזואליזציה של DNA לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבהרת סיכון ביולוגי בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסים המכוונים ל-DNA.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיה של משטחים, מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב גישה למיקרוסקופים אפי-פלואורסצנטיים ולמערכות בקרת זרימה מיקרופלואידיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת משטחים וסימון DNA.
- ייתכן הצורך בהתאמות עבור אורכי DNA שונים או מחלקות שונות של חלבוני קישור.
- פסיבציה של המשטח והפחתת קישור לא ספציפי הן קריטיות לקבלת תוצאות מהימנות.
