ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד
23 ביוני 2016
אנו מציגים גישה להמחשת מולקולות DNA גדולות מוכתמות בפפטיד קושר DNA של חלבון פלואורסצנטי (FP-DBP) הקשורות על הפוליאתילן גליקול (PEG) ומשטח הזכוכית המצופה אבידין ונמתחות בזרימות גזירה מיקרופלואידיות.
המטרה הכוללת של הליך זה, היא ליצור מערכת ניתוח DNA נוחה למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, לתפעל DNA של מולקולה בודדת על משטחי זכוכית ששונו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדמיית DNA. כאשר בוחנים את ה-DNA העצמי, כמו גם חלבונים קושרים DNA ומולקולות קטנות אחרות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להתבונן ולנתח DNA נע בקלות. כדי להתחיל, הנח כיסויי זכוכית על מתלה PTFE ואבטח אותם במקומם, באמצעות חתיכת סרט איטום חוט PTFE. לאחר עטיפת הכיסויים, השאירו חתיכה באורך חמישה סנטימטרים מהסרט שתשמש לטיפול במתלה במהלך הליך הניקוי.
במכסה אדים, שלבו 350 מילילטר של חומצה גופרתית ו -150 מיליליטר מי חמצן בכוס זכוכית של ליטר אחד ליצירת תמיסת תחריט פיראנה. לאחר מכן, הנח את מתלה הכיסויים לתוך התמיסה. לאחר שעתיים, רוקנו את הכוס ושטפו היטב את הכיסויים במים נטולי יונים.
המשך לשטוף את הכיסויים עד שה-PH של המים בכוס מגיע ל-PH ניטרלי. לאחר מכן, סוניקציה של מדפי הכיסויים בכוס המחברת מים למשך 30 דקות, כדי לנקות ולגזור את מצעי הזכוכית. מים ריקים מהכוס, רגע לפני אמינוסילניזציה. כדי להתחיל, הכינו את תמיסת האמינוסילניזציה, על ידי הוספת שני מיליליטר אלקוקסילן, וחומצה אצטית קרחונית של 10 מיליליטר ל -200 מיליליטר אלכוהול מתיל במיכל פוליפרופילן נקי.
לאחר מכן הנחת הכיסויים הנקיים לתוך התמיסה. לאחר מכן, הניחו את הכיסויים הנקיים בתמיסה המוכנה ונערו אותם בטמפרטורת החדר וב -100 סל"ד למשך 30 דקות. לאחר מכן, סוניקציה של המיכל עם הכיסויים הנגזרים למשך 15 דקות ב 75 וואט.
לאחר מכן, יש לנער אותם שוב בטמפרטורת החדר וב-100 סל"ד למשך 30 דקות לפחות. לאחר שתסיים, רוקן את התמיסה מהכוס ושטוף את הכיסויים שלוש פעמים, בזהירות. פעם אחת עם אלכוהול מתיל ופעמיים עם אלכוהול אתילי.
לאחר השטיפה האחרונה, אחסן את הכיסויים באלכוהול אתילי והשתמש בהם תוך שבועיים. ראשית, הכינו 10 מיליליטר מתמיסת נתרן ביקרבונט טוחנת 0.1 וסננו אותה דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון. לאחר מכן, ממיסים שני מיליגרם של ביוטין PEG succinimidyl carbonate ו-80 מיליגרם של PEG succinimidyl valerate לתוך 350 מיקרו ליטר של תמיסת הנתרן ביקרבונט המסוננת.
הגן על התמיסה מפני אור באמצעות צינור הגנה מפני אור. מערבל את הצינור במרץ, למשך 10 שניות ולאחר מכן, צנטריפוגה אותו ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת כדי להסיר בועות. לאחר מכן, יש לשטוף שקופית זכוכית עם אצטון ואחריה אלכוהול אתילי.
לאחר השטיפה, הניחו לשקופית להתייבש לחלוטין באוויר. הניחו טיפה של 50 מיקרוליטר מתמיסת ה-PEG על מגלשת הזכוכית הנקייה. הורד לאט כיסוי סילני אמינו על הטיפה בזווית קלה, כדי לא ליצור בועות אוויר מתחת לכיסוי.
לאחר מכן, הנח את המגלשות בתא ישר, חשוך ולח למשך שלוש שעות לפחות עד לילה, בטמפרטורת החדר. בסיום, אטמו את תמיסת ה-PEG הנותרת בצינור ההגנה מפני האור, ושמרו אותה על ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שטפו היטב את כיסויי PEGylated במים נטולי יונים ולאחר מכן אחסן אותם במקום חשוך ויבש עד לשימוש.
על מנת ליצור את תא הזרימה, הניחו רצועות סרט דו צדדיות ודביקות על מחזיק אקרילי, כך שהוא מיושר בניצב לחורי כניסה ויציאה ולא יפריע לאף אחד מחורי התעלה. לאחר מכן, שפשפו את הקלטת, בעזרת קצה פיפט, כדי לאטום את התעלות. לאחר מכן, הנח כיסוי PEGylated, כשהצד PEGylated פונה כלפי מטה, על החלק העליון של הסרט כדי ליצור תאי זרימה.
כדי למנוע דליפה של תמיסה כלשהי, לחץ על החלק העליון של הכיסוי מעל האזור שבו מונח סרט דו צדדי. לאחר מכן, הוסף דבק אפוקסי יבש מהיר לשולי התאים, כדי לאבטח אותו במקומו. לאחר מכן, חבר חתיכת צינור באורך 2.5 ס"מ למזרק אטום לגז ואטום את המפרק בדבק אפוקסי.
לאחר מכן, חבר צינור ארוך וגמיש לצינור המגיע מהמזרק. ושוב, אטמו את המפרק בדבק אפוקסי. מלאו את הצינור המקושר למזרק במים נטולי יונים, וודאו שאין בועות אוויר.
לאחר מכן, הכנס את הצינור לחור של תא הזרימה האטום בדבק אפוקסי. והניחו קצה פיפט של 200 מיקרוליטר על החור השני, שישמש כמאגר. הגדר את קצב הזרימה של משאבת מזרק ל -50 מיקרוליטר לדקה.
לאחר מכן, הזרימו 20 מיקרוליטר של תמיסת חלבון avidin לתא ושמרו אותה שם למשך 10 דקות. לאחר מכן, טען 20 מיקרוליטר של נוקלאוטידים של אוליגו דאוקסי ביוטיניל, למזרק. הזרימו אותו לתא, ושמרו אותו שם למשך 10 דקות.
אם נעשה שימוש בטרנספראז טרמינל, דלג על העמסת נוקלאוטידים של אוליגו דאוקסי. לאחר מכן, טען 20 מיקרוליטר של תמיסת DNA למזרק, הזרים אותו לתא בקצב של 10 מיקרוליטר לדקה ושמור אותו שם למשך 30 דקות. לאחר הדגירה של 30 דקות, שטפו את תא הזרימה עם 40 מיקרוליטר של מאגר TE 1X ב-50 מיקרוליטר לדקה.
לאחר הכביסה, טען את החדר ב-40 מיקרוליטר של אותו FP-DBP בריכוז של 80 ננו-מולר, ב-1X TE.To לראות את טווח המתיחה המלא של מולקולות ה-DNA, להחיל קצבי זרימה שונים בהתאם לאורכי ה-DNA המשמשים. התבונן ב-DNA תחת עדשת אובייקטיבית של פי 60, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הנה סרטון מיקרוסקופ פלואורסצנטי המציג מולקולות DNA של בקטריופאג' למבדה, קשורות לפני השטח, נמתחות על ידי זרימה לאחר קשירה עם נוקלאוטידים משלימים של אוליגו ביוטיניל.
תחת זרימה, מולקולות ה-DNA המוארכות במלואן, נמדדות באורך של 16.5 מיקרון. לעומת זאת, הבקטריופאג' T4 DNA momlecules, מוארך לאורך של 56.4 מיקרון, תחת זרימה. התארכות זו הפיכה, וניתן להאריך ולהרגיע את ה- DNA מספר פעמים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להשתמש ב- FP-DBP בניתוח DNA גדול יותר כמו גם להדגים מתיחה והרפיה של פולימר DNA.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להדמיית חלבון פלואורסצנטי המקושר ל-DNA בפפטיד (FP-DBP) המצופה ב-DNA גדול. הטכניקה כוללת עיגון מולקולות אלו על פני שטח זכוכית מצופה פוליאתילן גליקול (PEG) ואווידין ומתיחתן באמצעות זרימות גזירה מיקרופלואידיות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- הדמיית DNA
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- מניפולציה של מולקולה יחידה
רקע
- המחקר מתמקד בניתוח DNA וחלבוני הקישור ל-DNA.
- הוא נועד לשפר את הנוחות של מערכות ניתוח DNA.
- שיטה זו מאפשרת תצפית על DNA נע.
- היא מיועדת לשימוש במיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים.
מטרת המחקר
- לפתח מערכת למניפולציה של DNA ממולקולה יחידה.
- לשפר את ההדמיה של DNA וחלבונים קשורים.
- להקל על ניתוח הדינמיקה של ה-DNA.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת מכסי זכוכית על מתלה PTFE.
- אבטחת מכסי הזכוכית באמצעות סרט חותם חוט PTFE.
- נוהל ניקוי למשטחי הזכוכית המותאמים.
- שימוש בזרימות גזירה מיקרופלואידיות למתיחת ה-DNA.
תוצאות עיקריות
- עיגון מוצלח של מולקולות DNA גדולות על משטחים מותאמים.
- הדמיה יעילה של דינמיקת ה-DNA באמצעות צביעה FP-DBP.
- יכולת משופרת לניתוח DNA נע בזמן אמת.
- הדגמה של הפוטנציאל של השיטה במחקר ה-DNA.
מסקנות
- הטכניקה מציעה גישה חדשנית להדמיית DNA.
- היא מספקת תובנות לגבי אינטראקציות ה-DNA עם חלבוני קישור.
- שיטה זו יכולה לקדם מחקר בתחום הביולוגיה המולקולרית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Direct visualization of surface-tethered large DNA molecules using fluorescent protein DNA binding peptides (FP-DBP) enables precise interrogation of DNA-protein interactions at the single-molecule level. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma discovery pipelines. The method enhances predictive confidence for downstream assay development and screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of DNA-protein binding events for mechanistic clarification.
- Supports functional validation of DNA-binding targets in a controlled environment.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular interactions relevant to disease pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for preparing validated DNA substrates for high-content assays.
- Enables quantitative measurement of DNA stretching and relaxation under defined conditions.
- Supports standardization and scalability for compound screening targeting DNA-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by modeling DNA-protein dynamics at the single-molecule level.
- Offers continuity from discovery through preclinical validation for DNA-targeting modalities.
- Reduces biological ambiguity in early-stage risk assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to assay development and preclinical research, supporting lead identification and target validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing DNA-protein interactions.
- Screening: Delivers assay-ready, surface-tethered DNA substrates with quantitative readouts.
- Analytics: Provides real-time measurement of DNA elongation and relaxation for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical model validation when DNA-protein interactions are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse DNA-binding protein studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes DNA visualization workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by clarifying early-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of DNA-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, microfluidics, and fluorescence microscopy.
- Demands access to epifluorescent microscopes and microfluidic flow control systems.
- Necessitates cross-team standardization of surface preparation and DNA labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different DNA lengths or binding protein classes.
- Surface passivation and non-specific binding reduction are critical for reliable outputs.
