האוטומטי לחלוטין צנטריפוגלי Microfluidic מכשיר לגילוי חלבון רגיש מן הדם מלא

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשפר את רגישות הזיהוי של ELISA באמצעות ננו-סיבים טבעיים. סרטון זה מדגים כיצד להשיג רגישות לזיהוי פמטומולרי של חלבונים ב-10 מיקרוליטר של דגימות דם מלא תוך 30 דקות. בפלטפורמת מעבדה על דיסק, הכוח הצנטריפוגלי משמש להעברת הנוזל דרך תאים, והתהליך הכולל הוא אוטומטי לחלוטין.

ניתן לשפר מאוד את רגישות הזיהוי על ידי שילוב של ננו-סיבים. עם זאת, הבעיה הייתה שהננו-סיבים שבירים מאוד וקשים לטיפול. בסרטון זה, אנו מציגים תהליך פשוט לחיבור מחצלות ננו-סיבים שבירות טיטניום דו חמצני על דיסק פלסטיק.

כדי לייצר מחצלות ננו-סיבים מטיטניום דו חמצני על מצע סיליקון על ידי אלקטרו-ספינינג, מצע הסיליקון מסולל תחילה, מצופה ב-PDMS ונרכש מראש. לאחר מכן מועבר מחצלת ננו-סיבים ל-PDMS הנרכש מראש ומוצר זה מנוקב כדי לייצר חתיכה עגולה לחיבור. מצפים את תא התגובה בטיפת PDMS כדבק, ומחברים את החלק העגול לתחתית החדר.

לאחר מכן, רפאו את ה-PDMS בתנור. לבסוף, הרכיבו את שכבות הדיסק למכשיר שלם אחד עבור ELISA. טכניקת העברת ננו-סיבים זו מאפשרת לנו לנצל את שטח הפנים הגבוה של ננו-סיבים לביואנליזה.

המכשיר המיקרופיליטי הצנטריפוגלי מציע אינטגרציה ואוטומציה מלאה של כל התהליכים הנדרשים ב-ELISA. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות הוא שהיא יכולה לזהות ריכוזים פמטומולריים של חלבונים מ-10 מיקרוליטר בלבד של דם מלא. הכן את פתרונות המבשרים כמתואר בפרוטוקול הבדיקה הנלווה.

לאחר מכן טען את התמיסה באלקטרוספינר ויצר את הננו-סיבים על ידי אלקטרו-ספינינג, תוך שימוש בתנאים האופטימליים. כאשר מכינים את מחצלות הננו-סיבים הפולימריים, יש לסייד אותן בתנור בוואקום. לאחר ההסתיידות, מכינים סוף סוף את מחצלות הננו-סיבים מטיטניום דו חמצני.

הכן את הפריסה המיקרופיליטית באמצעות תוכנת עיצוב תלת מימד כגון SOLIDWORKS, והעביר את העיצוב למכונת כרסום CNC. הפעל את מכונת כרסום CNC כדי לייצר את הדיסק עם תעלות ותאים. מחצלת הדיסק והננו-סיבים מוכנה כעת לשילוב.

הכן תא ואקום, מצע סיליקון ופלואורוסילן. סילן את מצע הסיליקון עם פלואורוסילן בוואקום למשך 30 דקות. הכן את ה-PDMS האורח על ידי הכנת פרה-פולימר עם חומר ריפוי ביחס של 10 לאחד, וסובב את המעיל על מצע הסיליקון הסילאני ב-650 סל"ד למשך 60 שניות.

רפאו את ה-PDMS המצופים על הוופל הסילני ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להפוך אותו לדביק. כעת העבירו את מחצלות הננו-סיבים הללו על הסיליקון המצופה PDMS על ידי הפעלת לחץ מתאים באמצעות חפץ שטוח כגון מגלשת זכוכית. אופים את הדגימה בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לרפא לחלוטין את ה-PDMS הדביק.

הוציאו כמה טיפות אתנול על מחצלות הננו-סיבים המחוברות לשכבת ה-PDMS, וצרו חור בקוטר של שישה מילימטרים באמצעות PunchIt. לאחר מכן מקלפים את מחצלות הננו-סיבים המנוקבות המחוברות על ה-PDMS ממצע הסיליקון. לאחר מכן, מצפים את תא תגובת הקישור בדיסק בכ-20 מיקרוליטר של תערובת PDMS, ומניחים את הננו-סיבים המחוברים על ה-PDMS לתוך התאים.

לאחר מכן, דגרו את הדיסק המשולב במחצלת ננו-סיבים ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעה. הכן תמיסת נפח של 1% לנפח של GPDES באתנול. לאחר מכן, טפל בננו-סיבים בדיסק עם פלזמת חמצן.

יש להוציא 100 מיקרוליטר של תמיסת GPDES על כל מחצלת ננו-פייבר, ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים במיכל אטום. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת ה-GPDES על ידי הקשה על הדיסק על מגב. שוטפים באתנול, מוציאים ואופים בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר האפייה יש לשטוף עם אתנול ולטפוח להסרה. חזור על תהליך זה וייבש עם זרם חנקן. לקיבוע נוגדנים, יש לחלק תמיסת נוגדנים מדוללת שנלכדה.

שמור את הדיסקים בתא לח, ודגר בחום של 37 מעלות למשך ארבע שעות. שוטפים את התמיסה שנותרה בעזרת מאגר כביסה. כעת, הרכיבו את הדיסק באמצעות סרט דבק דו צדדי.

הפעל לחץ סביר כדי להרכיב את השכבות לדיסק שלם. מלאו את תאי תגובת הקישור במאגר חוסם ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. שטפו פעמיים עם מאגר כביסה ואחסנו את הדיסק בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

טען את הריאגנטים, מאגרי הכביסה ו -10 מיקרוליטר דם מלא בתאי המגיב והדגימה. הנח את הדיסק במכונת הדמיה שנבנתה בהתאמה אישית לבדיקה חיסונית אוטומטית. מערכת ההדמיה מכילה רוטור המחובר למחשב להפעלת דיסק אוטומטי יחד עם אור מהבהב ומצלמת CCD לצילום תמונות.

סובב את הדיסק במהירות של 3,600 סל"ד למשך 60 שניות כדי להפריד בין כדוריות הדם האדומות. מערבבים פלזמה עם נוגדנים לזיהוי. העבירו את התערובת לתא התגובה המשולב במחצלת ננו-סיבים טיטניום דו חמצני.

לאחר תגובה חיסונית, שטפו את הננו-סיבים על ידי העברת מאגר הכביסה לתא התגובה. לאחר מכן, העבירו את תמיסת המצע הכימילומינסנט לתא התגובה המחייבת, ודגרו במצב ערבוב למשך דקה אחת. לבסוף, העבר את תמיסת המצע המגיב לתא הזיהוי.

בסיום כל התגובה, העבירו את הדיסק למערכת גילוי וקראו את האות הכימילומינסנט באמצעות תוכנה מותאמת אישית. ניתן לשלב את פעולת הדיסק ומערכת הזיהוי בפלטפורמה אחת. על ידי אופטימיזציה של המתח והפלואוראט, התקבלו מחצלות ננו-סיבים אחידות כפי שמוצג בתמונת SEM זו.

על מנת לייעל את זמן הריפוי של PDMS, נמדד כוח ההדבקה. אם הוא היה קצר מדי, שטיח הננו-סיבים היה מוטבע ב-PDMS, או התקלף אם הוא ארוך מדי. לאחר האופטימיזציה, מחצלת הננו-סיבים חוברה ביציבות על ה-PDMS.

הטווח הליניארי לזיהוי חלבון מגיב C משתי פלטפורמות מוצג בגרף זה. באמצעות מעבדת שלמות הננו-סיבים בדיסק, הצלחנו להשיג רגישות זיהוי משופרת ביותר של חלבון מגיב C מ-10 מיקרוליטר סרום בלבד תוך 30 דקות. טכנולוגיות זמינות כיום, כגון ELISA מבוססת צלחות 96 בארות דורשות נפח דגימה גדול יותר וזמן זיהוי ארוך יותר.

בסך הכל, ELISA מבוסס דיסק משולב ננו-סיבים הראה טווח רחב ודינמי של שישה סדרי גודל עם מגבלת זיהוי של שישה פמטומולים של חלבון מגיב C. רגישות זיהוי זו בסיוע שטח פנים גבוה שסופק על ידי ננו-סיבים המשולבים בדיסקה עלתה על זו של ה-ELISA הקונבנציונלית, שהייתה מוגבלת ל-2,000 פמטומולים. לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שיש לך הבנה טובה כיצד להכין מכשיר מיקרופיליטי צנטריפוגלי, כיצד לשלב ננו-סיבים פאזאליים וכיצד לבצע זיהוי חלבונים באמצעות ELISA.

טכניקה זו יכולה להיות שימושית לאיתור חלבונים בעלי קשרים נמוכים בכמות קטנה מאוד של דגימות ביולוגיות.