יצירת צומת תת-50 ננומטר ננו-נוזלי ב PDMS Microfluidic שבב באמצעות תהליך ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואיד
13 במרץ 2016
אנו מציעים טכניקת הרכבה עצמית פשוטה של ננו-חלקיקים קולואידיים של סיליקה כדי ליצור צומת ננו-פלואידית בין שני מיקרו-ערוצים בפולידימתילסילוקסן (PDMS). באמצעות טכניקה זו, קרום חרוז ננו-נקבובי בגודל נקבוביות של עד ~45 ננומטר נבנה בתוך מיקרו-ערוץ והוחל על ריכוז מוקדם אלקטרוקינטי של דגימות DNA.
פרוטוקול זה מדגים טכניקת הרכבה עצמית חדשה ופשוטה של ננו-חלקיקי סיליקה קולואידיים ליצירת צומת ננו-פלואידית בין שני מיקרו-ערוצים בפולידימתילסילוקסן. קרום החרוזים בגודל נקבוביות של כ-45 ננומטר, המשמש כקרום סלקטיבי של קטיון, יכול לשמש לריכוז האלקטרוקינטי של דגימות DNA וחלבון. סקירה כללית: בשלב הראשון, מכשיר ה-PDMS עם ננו-מלכודות יצוק בתהליך יציקה כפולה.
לאחר הדבקת פלזמה של המכשיר למצע זכוכית, מוזרקים חרוזי סיליקה פונקציונליים על פני השטח לתוך המיקרו-תעלות ליצירת הממברנה הקולואידית להרכבה עצמית. לבסוף, מתח מופעל על פני הממברנה באמצעות מד מקור ומחלק מתח. דלדול היונים ועליית הריכוז נצפים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך, עם מצלמת CCD.
הכנת תרחיפי חלקיקי סיליקה קולואידים: החל מחרוזי הסיליקה 300 ננומטר; מלאי חרוזי מערבולת למשך 30 שניות; משוך מתלים של 600 מיקרוליטר לתוך צינור אפנדורף, וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2,600 גרם. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט. השעו מחדש את החרוזים עם 400 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט של מילי-מולרית אחת, כדי להגיע לריכוז עבודה של 15%.
מערבולת כדי להגיע להשעיה הומוגנית. חזור על אותם שלבים להכנת חרוזי סיליקה בגודל 500 ננומטר. עבור חרוזי סיליקה קרבוקסילית של 500 ננומטר, שקלו 100 מיליגרם בשפופרת פלקון של 15 מיליליטר.
לאחר מכן העבירו 9.8 מיליליטר של נתרן כלורי מולארי אחד כדי להשעות מחדש את החרוזים. מערבל את הצינור במרץ. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לעקור את החרוזים שנפגעו בתחתית.
כדי לשנות את מטען פני השטח על החרוזים, אנו מכינים שני פוליאלקטרוליטים: PAH ו-PSS. ה-0.9% PSS מוכן על ידי המסת 180 מיליגרם של PSS עם 200 מיליליטר, נתרן כלורי מולארי אחד. ה-0.4%PAH מוכן על ידי הטעיית 300 מיקרוליטר מתמיסת המלאי ל-15 מיליליטר של נתרן כלורי מולארי אחד.
מערבולת את שני הפתרונות כדי להבטיח שהם מומסים לחלוטין. כדי להפקיד שכבת PAH טעונה חיובית, הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת PAH לתרחיף החרוזים. מערבולת למשך דקה אחת ודוגרים את המתלה במסובב למשך שעה בטמפרטורת החדר.
כדי לשטוף את ה-PAH הלא קשור, צנטריפוגה את המתלה ב-1, 801 גרם למשך דקה אחת, כדי לזרז את החרוזים. הסר את ה-supernatant. הכניסו 1 עד 2 מיליליטר מים לתוך הצינור כדי לשבש את החרוזים.
מוסיפים את שמונת מיליליטר המים הנותרים ואז מערבולת. חזור על הליך הכביסה ארבע פעמים נוספות. לאחר הכביסה והצנטריפוגה החמישית, השליכו את הסופרנטנט ושחזרו את החרוזים עם 9.8 מיליליטר נתרן כלורי מולארי אחד.
להפקדת שכבת ה-PSS הטעונה שלילית, הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת ה-PSS למתלה החרוזים. מערבולת למשך דקה אחת ודוגרים את המתלה במסובב למשך שעה בטמפרטורת החדר. שוטפים את החרוזים חמש פעמים במי DI כפי שנעשה לציפוי PAH.
לאחר הכביסה האחרונה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את החרוזים עם 650 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט מילי-מולרי אחד עם 0.05% טווין 20. העבירו את מתלה החרוזים לצינור אפנדורף. להכנת חרוזי סיליקה אמין 500 ננומטר, חזור על אותו הליך כדי להפקיד שכבת PSS אחת טעונה שלילית.
ייצור השבב המיקרופלואידי PDMS: כדי לייצר את מאסטר הסיליקון, תחילה ציפוי סיבוב של פוטו-רזיסט דק של מיקרומטר אחד ב-4,000 סל"ד על פרוסת סיליקון. לאחר מכן השתמש בליתוגרפיה של הקרנה ובתחריט יונים תגובתי כדי ליצור ננו-תעלות מישוריות בעומק 700 ננומטר וברוחב שני מיקרומטר כננו-מלכודות לחרוזים. לאחר מכן סובב את שכבת הפוטו-התנגדות השנייה ב-2,000 סל"ד ובצע יישור לננו-מלכודות בדוגמה הקודמת.
הוסף את המיקרו-ערוצים באמצעות ליתוגרפיה מגע ועל ידי תחריט יונים תגובתי עמוק של סיליקון. כדי ליצור את שכבת השחרור, סילן את מאסטר הסיליקון בצנצנת ואקום עם 50 מיקרוליטר טריכלורוסילן, למשך הלילה. כדי ליצוק את תבנית ה-PDMS, מערבבים את בסיס ה-PDMS עם חומר ריפוי ביחס של 10:1.
יוצקים את התערובת על גבי מאסטר הסיליקון. מניחים את המאסטר עם PDMS בצנצנת ואקום כדי להסיר את בועות האוויר ואופים אותו בתנור בחום של 70 מעלות צלזיוס כדי להצליב את ה-PDMS. לאחר אפייה של שעתיים, הסר בזהירות את לוח ה- PDMS ממאסטר הסיליקון.
טפל במשטח בפלזמה כדי ליצור מליטה קבועה לפרוסת סיליקון ריקה. חבר סרט לאורך הקצה כדי לסמן קו מחיצה עבור שלב הליהוק הבא של PDMS. כדי ליצור שכבה לשחרור עובש, סילנה את תבנית ה-PDMS בצנצנת ואקום למשך הלילה.
יצוק PDMS על גבי תבנית ה-PDMS והעביר אותו לצנצנת ואקום להסרת גזים. לאחר מכן אופים אותו בתנור. קלף את לוח ה- PDMS הנרפא מתבנית ה- PDMS לאורך קו המחיצה המסומן בסרט.
חותכים את המכשירים בזהירות ומנקבים חורים בעזרת אגרוף ביופסיה של 1.5 מילימטר במאגרים. לאחר ניקוי פני השטח עם סרט ו-IPA, פלזמה קושרת את מכשיר ה-PDMS על מגלשת זכוכית מיקרוסקופ בגודל 25 מילימטר על 75 מילימטר. מיד לאחר הדבקת הפלזמה, הזרקו 10 מיקרוליטר מהתרחיף לכניסות ארבע ושישה מתעלות אספקת החרוזים.
לאחר מילוי תעלות אספקת החרוזים, יש לכסות את כל המאגרים למעט שקעים אחד ותשע, של ערוצי אספקת החרוזים. יבש את המכשיר באוויר במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר ואחסן בארבע מעלות צלזיוס לפני השימוש. מיקרוגרפים של המכשיר מראים את החלקיקים הקולואידים מתאספים בתוך תעלות אספקת החרוזים העליונות והתחתונות.
תמונת ה-SEM מציגה חלקיקי סיליקה קולואידים בהרכבה עצמית של 300 ננומטר הכלואים במערכי הננו-מלכודות, בין הדגימה לתעלת החיץ. מלאו את הכניסות שלוש ושבע מתעלות החיץ ב-10 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט של מילי-מולרית אחת. מלא את כניסת תעלת הדגימה חמש ב-10 מיקרוליטר של דגימת DNA של 10 ננו-מולרי.
הפעל לחץ שלילי עדין עם קצה פיפטה הפוך על כל השקעים כדי למלא את התעלות בתמיסות ללא בועות אוויר. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט למאגרים 2 ו-8, ו-10 מיקרוליטר של דגימת DNA למאגר 10, כדי לייצב את הלחץ למשך חמש דקות. ניסוי לריכוז אלקטרוקינטי של DNA: חבר את השבב המיקרופלואידית עם מחלק מתח המחובר למד מקור.
הכנס את חוטי ה-PT למאגרים שלוש, שבע, חמש ו-10. הפעל מתח על פני צומת ננו-פלואידי. תחילה יש להחיל 30 וולט על מאגרים 5 ו-10, וקרקע על מאגרים 3 ו-7.
הפחת את המתח ל-25 וולט במאגר 10 לאחר כ-30 שניות. תוצאות של ריכוז מוקדם אלקטרוקינטי: התעלה המיקרופלואידית מלאה ב-DNA, עם ריכוז ראשוני של 10 ננו-מולר. מיקרוגרפים של זמן-lapse מראים היווצרות של אזור דלדול יונים, או צמתים קולואידיים ננו-פלואידיים.
אזור דלדול היונים התחיל תוך 10 שניות. תקע DNA מרוכז נוצר כאשר המתח מופעל על תעלת הדגימה, בעוד תעלות החיץ מקורקעות. הקווים המקווקוים שימשו להדגשת קירות התעלה.
מקדם ריכוז של פי 1,700 מושג תוך 15 דקות באמצעות ממברנה קולואידית של 300 ננומטר. עוצמת הקרינה הממוצעת של ה-DNA גדלה כפונקציה של זמן בממברב ננו-נקבובי. הקווים המקווקוים מייצגים את רמת האות עבור DNA של 10 ננו-מולר, 17 מיקרו-מולר, דו-מיקרומולר ו-10 מיקרו-מולרי.
התקע המרוכז נוצר בממברנה הננו-נקבובית של חרוזי הסיליקה בגודל 300 ננומטר; חרוזי הסיליקה בגודל 500 ננומטר; חרוזי סיליקה אמין בגודל 500 ננומטר, מצופים בשכבה אחת של PSS; וחרוזי סיליקה קרבוקסיל בגודל 500 ננומטר, מצופים בשתי שכבות של PAH ו-PSS. מסקנות: באמצעות ממברנת הסיליקה הקולואידית בהרכבה עצמית עם גודל נקבוביות משוער של 45 ננומטר, הדגמנו קיטוב ריכוז יונים ליד הצומת הננו-פלואידי, וריכזנו דגימת DNA פי 1700 תוך 15 דקות. בהשוואה לננו-תעלות מבוססות סיליקון, היתרון העיקרי של ממברנה קולואידית בהרכבה עצמית, הוא אפשרות לבצע פונקציונליזציה של פני השטח לחלוטין מחוץ למכשיר המיקרופלואידית האטום, בבקבוקון נפרד.
אנו מאמינים שגישה זו פותחת אפשרות לייצר פלטפורמה מיקרו-ננו-פלואידית במהירות עם גדלי נקבוביות הניתנים לכוונון בקלות, על ידי שליטה בגודל החרוז, החוזק היוני או ערך ה-pH של תמיסת החיץ כדי לחקור את ההובלה היונית והמולקולרית בטווח של 10 עד 100 ננומטר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים טכניקת הרכבה עצמית חדשנית ופשוטה של ננו-חלקיקים קולואידליים של סיליקה, ליצירת חיבור ננו-פלואידי בין שני מיקרו-ערוצים בפולידימეთילסילוקסן. ניתן להשתמש בממברנת החרוגים, בעלת גודל נקבוביות של כ-45 nanometers, עבור ריכוז אלקטרוקינטי של דגימות DNA וחלבונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ננוטכנולוגיה
- מיקרופלואידיקה
- ביוטכנולוגיה
רקע
- טכניקות של הרכבה עצמית חיוניות ליצירת ננו-מבנים פונקציונליים.
- ננו-חלקיקי סיליקה קולואידליים יכולים ליצור ממברנות עם תכונות ספציפיות.
- שיטות אלקטרוקינטיות יעילות לריכוז של ביו-מולקולות.
- Polydimethylsiloxane (PDMS) נמצא בשימוש נרחב במכשירים מיקרו-פלואידיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטת הרכבה עצמית ליצירת צמתי ננו-פלואידיקה.
- ייצור ממברנת חרוזי ננו-נקבוביות להובלה סלקטיבית של יונים.
- שיפור הריכוז האלקטרוקינטי של דגימות DNA וחלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יציקת התקן PDMS באמצעות תהליך יציקה כפולה.
- הדבקה באמצעות פלסמה של ההתקן למצע זכוכית.
- הזרקת חרוזי סיליקה בעלי פונקציונליזציה של הפנים אל תוך מיקרו-תעלות.
- הפעלת מתח על פני הממברנה כדי לצפות בדלדול יונים ובעלייה בריכוז.
תוצאות עיקריות
- נוצרה בהצלחה ממברנת חרוזיים ננו-נקבובית עם גודל נקבים של ~45 nm.
- הממברנה שימשה כמחסום ברירה קטיונית.
- הודגמה ביעילות ריכוז אלקטרוקינטי של דגימות DNA.
- דלדול יונים ועלייה בריכוזם הודגמו באמצעות מיקרוסקופיה.
מסקנות
- טכניקת ההרכבה העצמית היא שיטה מבטיחה ליישומים של ננו-פלואידיקה.
- ניתן להשתמש בממברנות המיוצרות לריכוז ביו-מולקולרי.
- גישה זו עשויה לקדם את הפיתוח של התקני מיקרו-פלואידיקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ייצור מהיר של צומתים ננו-פלואידיים בקנה מידה של פחות מ-50 nm בשבבי מיקרופלואידיקה מ-PDMS מאפשר פיתוח פלטפורמות בעלות סלקטיביות גבוהה וכיווןיות הניתנת לכיוון, לצורך מחקרים של תובעת יונים ומולקולות ביולוגיות בננו-קנה מידה. יכולת זו תומכת בפיתוח בדיקות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור תהליכי עבודה של ניתוח חומצות גרעיים וחלבונים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בביצועי התקני מיקרופלואידיקה, ומשפיעה באופן ישיר על נקודות המפנה בתהליכי גילוי וסריקה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני הובלה בננו-קנה מידה עבור חומצות גרעיניות וחלבונים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מחסומים ברירתיים סלקטיביים ליון במערכות מיקרופלואידיות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי מתן אפשרות לוויסות מבוקר של גודל הנקבים והמטען הפני.
- משפר את הביטחון החזוי בהפרדה ובריכוז מולקולרי מבוססי התקנים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה לריכוז מוקדם כמותי של DNA וחלבונים בבדיקות מיקרופלואידיות.
- מאפשרת ייצור הדיר שחזור של צומתים ננופלואידיים בעל סלקטיביות ניתנת לכיוונון.
- תומכת בסטנדרטיזציה של תהליכי טיפול וריכוז דגימות.
- מאפשרת אינטגרציה ניתנת להרחבה לתוך פלטפורמות סריקה מרובות (multiplexed).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקל על חקר הובלה בקנה מידה ננומטרי הרלוונטית לזיהוי סמנים ביולוגים ולאבחון מולקולרי.
- מאפשר רציפות משלב אב-טיפוס של מכשירים בשלב הגילוי ועד לתיקוף בדיקות פרה-קליניות.
- תומך בקידום מותאם-סיכונים של טכנולוגיות מיקרופלואידיקה עבור יישומים תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטה זו לייצור צומת ננו-פלואידי מתאימה החל משלבי הגילוי המוקדמים ועד לפיתוח בדיקות, ותומכת בזיהוי מובילים ובמחקר פרה-קליני כאשר הובלה בקנה מידה ננומטרי היא קריטית.
- ביולוגיה של הגילוי: מספקת מערכת ניתנת לבקרה לבדיקת השערות לגבי הובלת יונים ומולקולות בקנה מידה ננומטרי.
- סריקה: מאפשרת ריכוז מוקדם (preconcentration) כמותי וניתן לשחזור של ביו-מולקולות לצורך ניתוחים המשכיים.
- אנליזה: מאפשרת מדידה ישירה של מקדמי ריכוז ודלדול יונים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחקר תרגומי: תומכת בהתאמה לדרישות זיהוי סמנים ביולוגיים באבחון מיקרופלואידי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מודולרית וניתנת לכיוון, הניתנת להתאמה לצרכים מגוונים של פיתוח מכשירים ובדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתהליכי הפרדה וריכוז בננו-קנה מידה.
- ערך תפעולי: מפשט את הייצור והפונקציונליזציה מחוץ להתקנים אטומים, ובכך משפר את השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: מאיץ קבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח ושילוב של פלטפורמות מיקרופלואידיות.
- השפעה על פורטפוליו: מפחית סיכונים בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות לתיקוף וסטנדרטיזציה מוקדמים וניתנים לכיוונון של ההתקן.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור התקני מיקרופלואידיקה ובכימיה של פני ננו-חלקיקים.
- דורש גישה לתשתיות סטנדרטיות של מיקרו-פבריקציה ודימוי פלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת חרוזיים והרכבת ממברנות.
- ניתן להתאמה לגדלי חרוזים ולכימיות שטח שונות עבור יעדים מולקולריים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את רכות ה-PDMS ואפשרות לקריסת תעלות במהלך ההדבקה.
