Name: Mucin Agarose גל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למד הפרדה אלקטרופורטית של מוקינים בעלי משקל מולקולרי גבוה באמצעות ג'ל אגרוז ומערב סופג. שיטה זו מאפשרת ניתוח מצב פולימרי וכימות יחסי של גליקופרוטאינים בדגימות עשירות בריר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד"ר ג'ון שיהאן ולד"ר לובנה עבדאללה על ההדרכה וההדרכה שהיו מרכזיים בהשלמת עבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהמכונים הלאומיים לבריאות (P01HL108808, UH2HL123645) וקרן סיסטיק פיברוזיס Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). קתרין רמזי נתמכת על ידי מלגת מחקר קריירה מוקדמת של NHMRC.

1. הכינו חוצצים עבור סופג mucin ג&#39;ל המערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 ליטר של 50x טה (טריס-תצטט-EDTA) חיץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת 700 מ&quot;ל של מים מזוקקים (O DH 2) להוסיף 242 גרם של בסיס טריס (0.4 M), 57.1 גרם של חומצה אצטית קרחונית (שוקל נוזלי) (0.2 M) ו 14.61 גרם של חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (50 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל- pH 8.0 ולעשות את נפח עד 1 ליטר עם DH 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של חיץ טעינת 10x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ&quot;ל של חיץ 1x טה. לשם כך, להוסיף 5 מ&quot;ל של גליצרול (50%), 25 מ&quot;ג של כחול bromophenol (0.25%), ו -100 מ&quot;ג של סולפט dodecyl נתרן (SDS) (1%). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 2 ליטר ציטראט מלוח 20x נתרן (SSC) החיץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 1.5 ליטר של DH 2 O, להוסיף 350.6 גרם של NaCl (3 M) ו 176.4 גרם של ציטראט Trisodium (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0.3 M). התאם ל- pH 7.0 ולעשות את הווליום עד 2 ליטר עם DH 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 ליטר של חיץ 1x טה-0.1% SDS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל של 50x TAE כדי 980 מ&quot;ל של DH 2 O. הוסף 1 גרם של SDS לבצע פתרון 0.1% SDS-טה. </li></ol></li></ol> 2. טה-SDS Agarose ג&#39;ל הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (. כלומר, 150 מ&quot;ל) יוצקים נפח מספיק של חיץ 1x טה-0.1% SDS בבקבוק Erlenmeyer במיקרוגל לבצע 5 - ג&#39;ל 7 מ&quot;מ בעובי. להוסיף 0.8% (1.2 גרם) אבקת agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוק המיקרוגל ב 30 מרווחי שניות עם מתערבל לסירוגין עד agarose נמס לגמרי (בדרך כלל 1 - 3 דקות). השתמש כריות יד חמות במהלך תהליך זה. היזהר של רתיחה המתפרץ בעוד מתערבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון agarose להתקרר למשך 5 - 10 דקות. הערה: פתרון agarose יהיה מוכן להיות שפך כאשר החלק תחתון של הבקבוק ניתן להשאיר על הכף במשך 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מגש הליהוק אלקטרופורזה (10 x 15 ס&quot;מ) על ידי הדבקת שולי עם קלטת והצבת גם מסרק בעמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים פתרון agarose לאט tהוא הליהוק מגש כדי למנוע היווצרות של בועות. הסר בועות באמצעות קצה פיפטה. חכו ג&#39;ל לקירור לחזק לחלוטין. לאחר הקרושה, להסיר את המסרק לאט, כדי למנוע התמוטטות הבארות על ידי יניקה והסר את הסרט מקצות המגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ג&#39;ל agarose לתוך תיבת ג&#39;ל ולמלא את יחידת אלקטרופורזה עם חיץ 1x טה-0.1% SDS עד הג&#39;ל מכוסות במלואן. </li></ol> 3. טוענים לדוגמא והפרדת אלקטרופורזה הערה: במעבדה שלנו, אנו משתמשים בדרך כלל דגימות משני עכבר ובני אדם, כולל נוזל השטיפה ברונכואלוואולרית (BALF; שני מינים), כביסות תא מתאי אפיתל סימפונות אדם (HBE), דגימות רוק כיח אדם. דוגמאות ניתן מפוגלות ב 6 M אוריאה על בסיס גבייה או מאוחסנות במשך פרקי זמן קצרים (6 שעות) על ידי הוספת מעכבי קוקטייל proteinase. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו דגימות לטעינה באמצעות הוספת 10% של צבע טעינת מדגם זה (כלומר., 30 μl של מדגם ו -3μl של צבע). Homogenize דגימות ידי pipetting למעלה ולמטה. בקצרה ספין למטה צינורות ב 5000 סל&quot;ד כדי לאסוף טיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לטעון נפח שווה של דגימות לתוך הבארות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפים טרום רטובים ו / או להשתמש טפטפות תזוזה חיוביות כדי להקל העמסת דגימות צמיגות מאוד. לאט לשאוב 80 - 90% של פתרון המדגם-צבע (כלומר, 27 - 30 μl) כדי למנוע בועות pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לטעון בתחתית בארות בהדרגה להזיז את קצה pipet כלפי מעלה. לקבלת דוגמיות כי נשארים מחוברים קצה פיפטה, לוותר בזווית של 45 מעלות ו להאריך ישר מעל הבאר או בעדינות להשתמש בצד של הבאר לשבור את הליחה הצמיגה. אין להעמיס על הבארות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את האלקטרודות מתיבת ג&#39;ל אל הגנרטור כוח אלקטרופורזה. ודא אלקטרודות מחוברות כראוי (כלומר., עופרת אדומה הפקוקה אל התוצר החיובי של הגנרטור) כדי לאפשר מטען שלילי מוקיוס לרוץ לעבר חיובי<html> אֶלֶקטרוֹדָה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 80 וולט למשך 90 דקות עבור ג&#39;ל מסרק יחיד, או 60 - 75 דקות עבור ג&#39;ל מסרק כפול כדי למנוע חפיפה בין שתי השורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה כוח גנרטור ולנתק את האלקטרודות ממקור החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את הג&#39;ל מתיבת ג&#39;ל ביד אחת משני צדי המגש הליהוק כדי להבטיח את הג&#39;ל נשאר במקום. </li></ol> 4. להפחית ג&#39;ל Agarose עבור העברת mucin יעילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום בדירה ג&#39;ל במיכל זכוכית. שוטפים את הג&#39;ל עם DH 2 O כדי להסיר עקבות של חיץ טה-SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של חיץ 4x SSC על ידי הוספת 200 מ&quot;ל של 20x SSC לתוך 800 מ&quot;ל של DH 2 O. להרוויח 200 מ&quot;ל של 10 מ&quot;מ dithiothreitol (DTT) פתרון 4x SSC על ידי הוספת 309 מ&quot;ג של DTT טרי לתוך 200 מ&quot;ל של חיץ 4x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הג&#39;ל עם DTT-4x SSC חיץ ומכסים. נער בעדינות במשך 20 דקות (10 סיבובים לדקה). לשטוף ג&#39;ל עם חיץ 4x SSC DTT-חינם. </li></ol>&quot;&gt; 5. שאב סופג הרכבת העברת מדגם קרום nitrocellulose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין נייר סופג ואקום להעברה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך קרום nitrocellulose ממדי מעט רחב יותר מאשר הג&#39;ל (כלומר., 10 x 15 ס&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחצלת נקבובית רטובה עם DH 2 O ולמקם אותו החלקה בצד למעלה ב הסופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום nitrocellulose רטוב עם חיץ SSC 4x DTT ללא ולמקם אותו במרכז המזרן נקבובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את המחצלת הנקבובית עם אטם הגומי, כשעזב את הפתיחה של האטם מיושר במדויק עם קרום nitrocellulose. אם המחצלת נקבובית עדיין גלויה, בזהירות להתאים את הממברנה כדי להבטיח שאין פער נשאר בין אטם קרום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום הג&#39;ל agarose על גבי הממברנה. ודא צורות ג&#39;ל חותם חזק עם אטם ואת הבארות של ג&#39;ל מוצבים על הממברנה עבור ההעברה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנוע היווצרות של בועות בין הממברנה ואת ג&#39;ל. כדי למזער אתהיווצרותן של בועות, להשפריץ כמה טיפות של 4x SSC חיץ על הממברנה וחלק הג&#39;ל מלמעלה למטה כדי לשטוף כל בועות נוצרות. הימנע מלהזיז את הג&#39;ל על הממברנה חלבונים יתחילו למחוק מיד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לכסות את הג&#39;ל עם חיץ 4x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין העברת mucin ידי יניקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל סופג ואקום ON ולחץ שקיעה ב- 40 - 50 mbar. הוסף כמה טיפות של חיץ 4x SSC על הג&#39;ל כל 5 - 10 דקות כדי למנוע את הג&#39;ל מהתייבשות. הפעל העברה של 90 דקות. אופציונלי: בסיום, לסמן את הבארות עם עיפרון להתמצאות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את הג&#39;ל ולאחזר קרום nitrocellulose באמצעות פינצטה פלסטיק על שפת הממברנה. </li></ol> 6. חסימת ממברנה וזיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום מיד עם בופר פוספט 1x (PBS). אל תתנו הממברנה להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הממברנה לתוך 50 מיליליטר של חלב 3%-PBS חיץ חסימה ומניח על rocker בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לאחר דגירה, לבטל את חיץ החסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול קרום 1% פתרון ראשוני נוגדנים בחלב-PBS. דגירה הממברנה בפתרון הנוגדן הראשוני לילה על כיסא נדנדה ב 4 ° C.. לאחר דגירה, להשליך את פתרון הנוגדן הראשוני. לדלל את הנוגדנים הראשוניים כדי יחס של 1: 2,000 של פתרון נוגדנים כדי חסימת חיץ. הערה: לקבלת דוגמיות שמקורם עכברים, אנו משתמשים UNC 222 ארנב חלבון אנטי Muc5b ו עז נגד גרין פלורסנט (GFP). לקבלת דוגמיות שמקורם בבני אדם, אנו משתמשים נוגדנים נגד MUC5B ו 45M1 אנטי MUC5AC העיקרי H300. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הממברנה לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 10 דקות על כיסא נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול קרום 1% פתרון משני נוגדן חלב-PBS. לדלל את הנוגדנים המשניים ביחס של 1: 7,500 של פתרון נוגדנים כדי חסימת חיץ דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 על כיסא נדנדה (למשל, 700 ארנבת אנטי ו 680 אנטי-עז.). להגן מפני אור על ידי דוגרי שותף שאינו שקוףntainer. מחק את פתרון נוגדנים משני לאחר 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הממברנה לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות. לשטוף הממברנה עם DH 2 O להסיר מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הקרום על מערכת קרינה האינפרא-אדומה על פי הוראות היצרן. </li></ol>

<ol><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyperconcentration+and+increased+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure.</a> J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li>
<li>Preciado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+Is+the+predominant+mucin+glycoprotein+in+chronic+otitis+media+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid.</a> Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+in+cervicovaginal+mucus+traps+HSV+and+prevents+vaginal+herpes+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).</li>
<li>Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+the+mucosal+barrier+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucins in the mucosal barrier to infection.</a> Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).</li>
<li>Thornton, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucus+glycoproteins+from+%27normal%27+human+tracheobronchial+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion.</a> Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).</li>
<li>Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpacking+a+gel-forming+mucin%3A+a+view+of+MUC5B+organization+after+granular+release%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).</li>
<li>Kesimer, M., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+analysis+of+mucin+core+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric analysis of mucin core proteins.</a> Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).</li>
<li>van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+enzyme+approach+for+the+characterization+of+glycan+modifications+on+the+C-terminus+of+the+intestinal+MUC2mucin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).</li>
<li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).</li>
<li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).</li>
<li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characterization+of+the+MUC5AC+mucin%3A+a+highly+oligomeric+glycoprotein+whether+isolated+from+cell+culture+or+in+vivo+from+respiratory+mucous+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions.</a> Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).</li>
<li>Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+glycoforms+of+the+MUC5B+mucin+in+human+respiratory+mucus.+Evidence+for+a+cysteine-rich+sequence+repeated+within+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule.</a> J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).</li>
<li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+molecular+intermediates+in+the+assembly+pathway+of+the+MUC5AC+mucin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin.</a> J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).</li>
<li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+mouse+model+demonstrates+the+protective+role+of+Muc5ac+in+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).</li>
<li>Livraghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+and+lung+pathology+due+to+mucosal+surface+dehydration+in+%7Bbeta%7D-epithelial+Na%2B+channel-overexpressing+mice%3A+role+of+TNF-%7Balpha%7D+and+IL-4R%7Balpha%7D+signaling%2C+influence+of+neonatal+development%2C+and+limited+efficacy+of+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment.</a> J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).</li>
<li>Martino, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER+stress+transducer+IRE1beta+is+required+for+airway+epithelial+mucin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).</li>
<li>Nguyen, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+beta-blockers+attenuates+inflammation+and+mucin+content+in+a+murine+asthma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).</li>
<li>Papakonstantinou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations+are+associated+with+pro-inflammatory+degradation+of+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid.</a> Chest. , (2015).</li>
<li>Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+mucin+secretion+from+human+bronchial+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).</li>
</ol>

אין מחברי סכסוך לחשוף.

הפרוטוקול של mucin מערבי סופג מתוארת וידאו זה משלב טכניקות קונבנציונליות המשמשות ביולוגיה מולקולרית להפריד ולהעביר מקרומולקולות גדולות, כגון דנ&quot;א, עם טכניקות קבועות לגילוי חלבון, כלומר., Immunoblotting. באותה הטכניקה יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הביולוגיה של glycosaminoglycans המורכבת, כגון הפירוט של חומצה היאלורונית גבוה מולקולרי משקל 18. למרות טכניקה זו יכולה לשמש במגוון רחב של מבחנים, מערבי סופג agarose מוצלח מסתמך על מספר רב של צעדים הדורשים פעולות ...

מוקיוס מיוצר בדרך כלל על ידי משטחים ריריים המרפדים חללים חשופים לסביבה החיצונית (למשל., נשימה, עיכול, קטעי רבייה, משטח עין), כמו גם איברים פנימיים (למשל, לבלב, כיס מרה, בלוטות חלב). הנוכחות של גליקופרוטאינים אלה שומר הידרציה שטח מהווה מכשול פיזי מפני פתוגנים. למרות הייצור mucin חיוני הרירית בריאות, mucin hyperconcentration ו / או נכסים ריר סוטה יכול להוביל הפרעות בצינור, קולוניזציה חיידקית ודלקת כרונית, אשר יכול לגרום נזק לרקמות בלתי הפיך. מפל דומה של אירועים הם נצפו במחלות כמה, למשל., סיסטיק פיברוזיס 1, דלקת אוזן תיכונה כרונית 2 ו הצרויקו זיהום 3. לכן, חשוב להבין את התפקיד של מוקיוס בבריאות ובחולי ולהקים פרוטוקולים שיגרתי לזיהוי חלבונים. עד כה19 גני מוקיוס, זוהו לקודד עבור רשתות פוליפפטיד גדולות החל מ- 1,200 (למשל., MUC1) 22,000 (למשל, MUC16) חומצות אמינו. משפחת גנים mucin ניתן לחלק לשתי תת: את מוקיוס קרום הקשורים, מעורב מיגון איתות פני התא, ואת מוקיוס יוצרי ג&#39;ל, אחראי המאפיינים viscoelastic של ג&#39;לים ריר. מוקיוס קרום הקשורים ברובם monomeric ולצרף אל משטחי תא באמצעות תחום קרום פורש הידרופובי. לעומת זאת, מוקיוס יוצרי ג&#39;ל להחזיק מספר גורם פון Willebrand (vWF)-כמו ציסטאין עשיר תחומים חיוניים להיווצרות רשתות פולימריות דינמית. גליקנים גדולים המחוברים סרין ושאריות תראונין מופצים ברחבי apomucin. אוליגוסכרידים O צמודים הצפופים אלה יכולים לתרום עד 80% של המשקל המולקולרי 4. תוך אג&quot;ח דיסולפיד הבין-מולקולרי חיבור מונומרים mucin להבטיח את תקינותו של רשתות ג&#39;ל mucink. כתוצאה glycosylation ו multimerization כבד, מוקיוס הם בין המולקולות הגדולות בעולם החי ולא יכול להיות מנותח על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה רגיל באמצעות ג&#39;ל polyacrylamide SDS-PAGE קונבנציונאלי וסולמות חלבון סטנדרטי. שיטות אלה נפתרות / חלבונים נפרדים עם משקל מולקולרי נמוך מ -250 kDa בעוד מונומרים mucin יכולים להגיע עד 2 מד&quot;א במקרה של MUC16. עם זאת, סולמות חלבון גבוה משקל מולקולרי יכולים לשמש כדי לחקור מונומרים mucin קטנים (כלומר., MUC1). מגוון של טכניקות ניתן ליישם ללמוד גודל mucin, קונפורמציה ואינטראקציה. באופן מסורתי, אפיון ביוכימי של מוקיוס מושגת על ידי mucin בידוד באמצעות צנטריפוגה צפיפות שיפוע isopycnic חיץ denaturing, ואחריו כרומטוגרפיה בגודל הדרה ו immunodetection (למשל., סופג חריץ) 5. דינמי ו / או פיזור אור רב-זווית לספק מידע על מצב oligomeric של דגימות mucin עשירי &lt;sup&gt; 1. בנוסף, צנטריפוגה אזורי-שיעור בשילוב עם immunodetection מיקרוסקופית אלקטרונים חודרת משמשים בדרך כלל כדי לקבוע את הקונפורמציה macromolecular של מוקיוס 6. ספקטרומטריית מסה משמשת גם לכמת מוקיוס, לזהות מחשוף פרוטאוליטים ולנתח 1,7,8 רכב oligosaccharide. שיטות אלו הן יקרות, זמן רב ולעתים קרובות דורשים כמויות גדולות ו / או ריכוזים גבוהים של מדגם. המתודולוגיה המתוארת במסמך זה, כלומר., Mucin הפרדה על ידי אלקטרופורזה, ניתנת לשחזור, בעלות נמוכה והוא יכול לשמש במחקרי תפוקה גבוהה כדי לספק quantitation mucin ביחס ולחקור הרכבת פולימרים. עם זאת, assay זה דורש נוגדנים גבוהה זיקה גבוהה סגולי mucin כי לא יהיו זמין עבור מוקיוס נדיר (למשל., MUC19) או מינים מסוימים (לדוגמא., חזיר, חמוס). המערבי סופג Agarose מתאים לפתרון מגוון רחב של דוגמאות עשיר mucin עם Concentraהמשא הנעים בין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל (למשל., שטיפות התא) עד 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל (למשל., ליחה). Assay זה הוצג בשנת 1990 בוצע רק כמה מעבדות מיוחדות 9,10. בתחילה, טכניקה זו סייעה לזהות תת-אוכלוסיות של מונומרים mucin בהפרשות אדם הנשימה 11,12 ואישר את תהליך oligomerization בתאים הגביע, אשר מורכב של היווצרות dimer ב reticulum endoplasmic ואחריו דימר multimerization במנגנון Golgi 13. לאחרונה, הדור של נוגדנים polyclonal נגד מוקיוס murine הקל מחקרים על במודלים של בעלי חיים קטנים (למשל., Mucin לקוי, βENaC, במודלים של עכברים OVA מאותגרי) ופתח תחום חדש של מחקר מחקרים פרה תרכובות תרופתי בדיקות שמטרתן הסרת ריר מ הריאות 14-17. כתוצאה עניין גובר mucin ביולוגיה הדור של הרומן, נוגדנים mucin ספציפי יותר, אנו מתארים herein המתודולוגיה להפריד מוקיוס ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose, ואקום העברת nitrocellulose וזיהוי פלורסנט אינפרא אדום בשני צבעים.

<table><tbody><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T6060-1 ק"ג</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>סיגמא</td><td>ARK2183-1 ליטר</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-100</td><td>גרם 100 גרם</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר</td><td>BP229-1</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא</td><td>114391-5 גרם</td><td>5 גרם</td></tr><tr><td>SDS (נתרן דודציל סולפט)</td><td>Sigma</td><td>L6026-50 גרם</td><td>50 גרם</td></tr><tr><td>20x SSC (נתרן מלח ציטראט) חוצץ</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>טריסודיום ציטראט (Na3C6H5O7)</td><td>Sigma</td><td>W302600-1kg</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>10 מ"מ DTT (דיתיותרייטול)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>אבקת חלב</td><td>סאקו</td><td></td><td>חלב יבש מיידי ללא שומן</td></tr><tr><td>Dulbecco פוספט מי מלח חוצץ (D-PBS)</td> <td>Gibco lifetechnologies</td><td>14200-025</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני עיזים נגד GFP (דגימות עכברים)</td> <td>נוגדנים ובדיקות רוקלנד</td><td>600-101-215</td><td>1 מ"ג</td></tr><tr><td>UNC 222 נוגדן ראשוני נגד muc5b ארנב (דגימות עכבר)</td> <td>UNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים ראשוניים H300 Anti-MUC5B (דגימות אנושיות)</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-20119</td><td>200 & #956; g</td></tr><tr><td>45M1 נוגדנים ראשוניים נגד MUC5AC (דגימות אנושיות)</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td>100 &#956; g</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב 800CW IR צבע</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32213</td><td>0.5 מ"ג</td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר 680LT IR צבע</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68022</td><td>0.5 מ"ג</td></tr><tr><td>אלקטרופורזה קופסת ג'ל ומגש יציקה</td><td>מערכות</td><td></td><td></td>הפרדת ינשוף</tr><tr><td>תיבת אספקת חשמל</td><td>Biorad</td><td>דגם 200/20</td><td></td></tr><tr><td>נייר ספיגת ממברנה</td><td>אמרשם&nbsp;</td><td>10600016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>נייר ווטמן וממברנת ניטרוצלולוזה&nbsp;</td><td>GE&nbsp;</td><td>10 439 196</td><td></td></tr><tr><td>Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v</td><td>Expotech USA</td><td>230600-2</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey מערכת פלואורסצנטית אינפרא אדום</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mucin agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

מוקיוס, החלבונים הריריים משטחים ריריים-glycosylated בכבדות, התפתחו כמרכיב מרכזי של הגנה מולדת ידי גינה האפיתל נגד פתוגנים פולשים. תפקידה המרכזי של מולקולות אלו הוא להקל השמנת חלקיקים ופינוי תוך קידום שימון של הרירית. במהלך סינתזת החלבון, מוקיוס לעבור O-glycosylation ו multimerization אינטנסיבי, אשר להגדיל באופן משמעותי את מסת וגודל המולקולות האלה. שלאחר translational שינויים אלה הם קריטיים עבור מאפייני viscoelastic של ריר. כתוצאת האופי ביוכימיות biophysical המורכבת של מולקולות אלה, עובדים עם מוקיוס מספק אתגרים רבים כי לא ניתן להתגבר על ידי שיטות ניתוח חלבון קונבנציונליות. למשל, גבוה בעל המשקל המולקולרי שלהם מונע גירת electrophoretic באמצעות ג&#39;ל polyacrylamide הקבוע והטבע הדביק שלהם גורם הידבקות צינורות הניסיונות. עם זאת, חוקרים את התפקיד של מוקיוס בבריאות(למשל., שמירה על שלמות רירית) ומחלות (למשל., Hyperconcentration, mucostasis, הסרטן) צבר לאחרונה עניין מוקיוס נחקרים כיעד טיפולי. הבנה טובה יותר של הייצור והתפקוד של מקרומולקולות mucin עלולה להוביל לגישות פרמקולוגיות רומן, למשל, מעכבי exocytosis גרגיר mucin ו / או סוכני mucolytic. לכן, פרוטוקולים עקבי ואמין לחקור ביולוגיה mucin הן קריטיות בהתקדמות המדע. כאן אנו מתארים שיטות קונבנציונליות להפריד מקרומולקולות mucin ידי אלקטרופורזה באמצעות ג&#39;ל agarose, להעביר החלבון לתוך קרום nitrocellulose, וכדי לזהות אותות עם נוגדנים ספציפיים mucin וכן הקורא ג&#39;ל ניאון אינפרא אדום. טכניקות אלה חלות נרחבים כדי לקבוע quantitation mucin, multimerization וכדי לבדוק את ההשפעות של תרכובות תרופתיות על מוקיוס.

אנו מציגים תוצאות נציגי ביטוי mucin הבאים ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose ב BALF מהריאות של עכברים (איור 1). בדוגמא זו, השתמשנו ג&#39;ל agarose להראות גברת ביטוי של mucin ייצור הבא IL-13 לטיפול במודל עכבר TG-Muc5ac. הכתם המערבי מראה ייצוג חזותי של ביטוי mucin, אשר ניתן להשתמש בהם עבור ניתוח כמותי של multimer או עוצמת האות הלהקה מונומר (איור 2). שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להראות ביטוי מוקיוס ב אפיתל סימפונות אדם (HBE) כב...

מוצינים הם גליקוקונוגטים בעלי משקל מולקולרי גבוה, עם גודל שנע בין 0.2 ל-200 מגה-דלטון (MDa). כתוצאה מגודלם, מוצינים אינם חודרים לג'לים פוליאקרילאמידים קונבנציונליים ודורשים נקבוביות גדולות יותר להפרדה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאלקטרופורזה של ג'ל מוצין אגרוז כדי להעריך כימות יחסי ולחקור את הרכבת הפולימרים.

Mucin Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

המטרה הכללית של טכניקת ה-western blotting זו עבור גליקופרוטאינים בעלי משקל מולקולרי גבוה היא הפרדה אלקטרופורטית של מוצינים (mucins) המצויים בדגימות עשירות בריר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום הביולוגיה של המוצינים, כגון חקירת המצב הפולימרי בריכוזים יחסיים של מוצינים ספציפיים שהופקו ממשטחים ריריים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה להקמה, בעלת עלות נמוכה יחסית ודורשת מינימום של ציוד מעבדה.סופיה סמיר, מומחית מחקר מהמעבדה שלי, תדגים את הפרוצדורה הזו. התחילו את הניסוי בהכנת הג'ל. שפכו 150 milliliters של בופר 1x TAE 0.1%SDS לתוך בקבוק ארלנמאייר המתאים למיקרוגל כדי להכין ג'ל בעובי של שישה מילימטרים, והוסיפו 1.2 grams של אבקת אגרוז.חממו את הבקבוק במיקרוגל במרווחי זמן של 30 שניות, תוך כדי ערבוב סיבובי לסירוגין, עד להמסה מלאה של האגרוז. המתינו עד שהתמיסה של האגרוז תתקרר למשך עד 10 דקות. לאחר מכן, הניחו תבנית יציקה לאלקטרופורזה בגודל 10 על 15 סנטימטר בתוך יצק ג'ל.שפכו באיטיות את תמיסת האגרוז ומקמו את המסרקים במיקומם. הסירו בועות אוויר שייתכן שנוצרו באמצעות קצה של פיפטה, ולאחר מכן המתינו לקירור והתמצקות הג'ל. לאחר שהג'ל התמצק לחלוטין, הסירו את המסרק באיטיות כדי למנוע קריסה של הבארות, והוציאו את התבנית מיציקת הג'ל.הניחו את הג'ל בתוך קופסת הג'ל ומלאו את יחידת האלקטרופורזה עד שהג'ל מכוסה לחלוטין. הוסיפו 10% של צבע טעינה (loading dye) לכל דגימה. הומוגניזו את הדגימות על ידי פיפוט מעלה ומטה.לאחר מכן, סובבו את המבחנות קצרה ב-5000 RPM כדי לאסוף את הטיפות. לאחר מכן, השתמשו בפיפטות דחיקה חיובית (positive displacement pipettes) כדי להקל על טעינת הדגימות בעלות הצמיגות הגבוהה. שאבו לאט 80 עד 90 אחוזים מהדגימה כדי למנוע היווצרות בועות בפיפטה.טענו את הדגימה באיטיות מהחלק התחתון של הבאר והזיזו את קצה הפ pipette בהדרגה כלפי מעלה. עבור דגימות שנותרות דבוקות לקצה הפ pipette, פלטו אותן בזווית של 45 מעלות ומתוחו אותן בקו ישר מעל הבאר, או השתמשו בעדינות בדופן הבאר כדי לנתק את הריר הצמיגי. טעינה מדויקת של דגימות viscoelastic עלולה להיות מאתגרת, כיוון שריר נצמד מטבעו לקצות הטעינה.כמו כן, כוח העילוי שמעניק התמיכה לריר עלול להוביל לדחיקה של כל הנפח שהועמס או חלקו אל מחוץ לבארות. יש להריץ את הג'ל במתח של 80 volts למשך 60 עד 75 דקות עבור ג'ל עם מסרק כפול, כדי למנוע חפיפה בין שתי השורות. לאחר שהג'ל רץ למרחק מספיק, יש לכבות את הגנרטור ולנתק את האלקטרודות ממקור המתח.הוצאו בזהירות את הג'ל מקופסת הג'ל, כאשר יד אחת מונחת בכל צד של תבנית היציקה כדי להבטיח שהג'ל יישאר במקומו. הניחו את הג'ל בזהירות ובצורה שטוחה בתוך כלי זכוכית. לאחר מכן, שטפו את הג'ל במים מזוקקים כדי להסיר שאריות של באפר TAE SDS.השרו את הג'ל בבופר DTT 4x SSC שהוכן מראש וכסו את הג'ל. לאחר מכן, נערערו את הג'ל בעדינות בקצב של 10 סיבובים לדקה. לאחר נעירוע של 20 דקות, שטפו את הג'ל בבופר 4x SSC נטול DTT.הכינו את מכשיר הבלוטינג בוואקום (vacuum blotter) להעברה על ידי גזירה זהירה של ממברנת הניטרוצלולוז כך שתהיה רחבה מעט מהג'ל. הרטיבו משטח נקבובי במים מזוקקים והניחו אותו בבלוטר כאשר הצד החלק פונה כלפי מעלה. הרטיבו והניחו שתי שכבות של נייר Whatman במרכז המשטח הנקבובי.הרטיב ממברנת ניטרוסלולוז בבופר 4x SSC ללא DTT והנח אותה מעל נייר Whatman. כסה את המצע נקבובי באמצעות אטם גומי, כך שפתח האטם יהיה מיושר בדיוק עם ממברנת הניטרוסלולוז. אם המצע נקבובי עדיין נראה, כוונן בזהירות את הממברנה כדי להבטיח שלא נותר מרווח בין האטם לממברנה.הרטיבו את ממברנת הניטרוסלולוז במצע SSC ללא DTT. הניחו בזהירות את ג'ל האגרוז מעל לממברנה. ודאו כי הג'ל יוצר אטום הדוק עם האטם וכי בארות הג'ל ממוקמות על הממברנה לצורך ההעברה.לאורך כל תהליך העברת החלבון, ודאו שאתם שומרים על איטום הדוק בין ג'ל האגרוז לממברנת הניטרוצלולוז. לאחר הנחת הג'ל על הממברנה, אין להזיז או לכוונן את הג'ל, ויש לשמור עליו הידרטי. כדי למזער היווצרות בועות, טפטפו מספר טיפות של 4x SSC buffer על הממברנה והחליקו את הג'ל מלמעלה למטה כדי להוציא בועות שהיווצרו.כסו בזהירות את הג'ל בבפר 4x SSC. התחילו את העברת המוצין על ידי הפעלת מכשיר ה-vacuum blotter למשך 90 דקות. הוסיפו מספר טיפות של בפר 4x SSC על הג'ל בכל חמש עד 10 דקות כדי למנוע את התייבשות הג'ל.עם הסיום, סמנו את הבארות בעזרת עיפרון לצורך התמצאות. השליכו את הג'ל והוציאו את ממברא הניטרוצלולוז באמצעות פינצטה מפלסטיק מקצה הממברנה. שטפו את הממברנה מיד ב-1x phosphate buffered saline או PBS.טבול את הממברנה ב-15 milliliters של תמיסת חסימה (blocking buffer) של 3% milk PBS והנח אותה על רוקר (rocker) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, השלף את הממברנה ושפוך את תמיסת החסימה. לאחר מכן, טבול את הממברנה בתמיסת נוגדן ראשוני של 1% milk PBS והדגר את הממברנה למשך לילה על רוקר בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.לאחר הדגירה, יש להסיר את תמיסת הנוגדן הראשוני. לאחר מכן, יש לשטוף את הממברנה ב-PBS תוך כדי נדנוד. העבירו את הממברנה למכל לא שקוף, טבלו אותה בתמיסת נוגדן שני ב-PBS עם 1% חלב והדגירו את הממברנה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת על מכשיר נדנוד (rocker).לאחר הדגירה, יש להסיר את תמיסת הנוגדן המשני. יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם. לבסוף, יש לשטוף את הממברנה במים מזוקקים להסרת המלחים.סמיך זה (western blot) מציג את העלייה בביטוי של חלבוני Muc5ac ו-Muc5b בנוזלי שטיפה ברונכואלוולארית של עכברים שנחשפו ל-IL-13 בהשוואה לעכברי ביקורת. ניתוח כמותי מראה כי העלייה בביטוי הייתה פי 5.1 לעומת עכברים שטופלו ב-PBS. electrophoresis של מיוצין בגל אגרוז שימשה להדגמת הפירוק של פולימרי מיוצין למונומרים בעקבות טיפול בריכוזים עולים של DTT.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לאשש את הספציפיות של הנוגדן לפני חקר מיוצין מסוים. עבור בדיקות פרמקולוגיות, חשוב לבחון את ההשפעה שעלולה להיות לריאגנטים כימיים על זיהוי האפיטופ. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לתמרן דגימות ויסקו-אלסטיות, לקבוע את המצב הפולימרי של מיוצינים ולבצע כימות יחסי שלהם.

mucin-agarose-gel-electrophoresis-western-blotting-for-high-molecular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג'ל המערכת Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג'ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

סרטון זה מדגים את הליך ההפרדה של סולפטים הפרניים שבודדו מרקמת הריאה של עכבר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד.

אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד: טכניקה אנליטית לזיהוי הפראן סולפטים באורכי שרשרת משתנים שבודדו מרקמת הריאה של עכבר

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

התקדמות הכתם המערבי באמצעות פלואורסצנטיות אפשרה זיהוי של שינויים עדינים בביטוי החלבון המאפשר ניתוחים כמותיים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה חזקה לזיהוי מגוון חלבונים על פני מגוון מינים וסוגי רקמות. ניתנת גם אסטרטגיה להתגברות על בעיות טכניות נפוצות.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט ומהיר להערכת המצב האוליגומרי של חלבון GTPase MxA דמוי דינמין מליזאטים של תאים אנושיים באמצעות שילוב של PAGE שאינו דנטורציה עם ניתוח כתמים מערביים.

אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה

כאן נשתמש agarose למחצה denaturing דו-ממדית בג'ל כדי לאשר הנוכחות של סיבי עמילואיד כמו גודל הטרוגניות או לא לכלול את האפשרות הטרוגניות גודל נובע דיסוציאציה של סיבי עמילואיד במהלך הג'ל התהליך פועל.

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

דפוס הגליקוזילציה של הנוגדן קובע את ביצועיו הקליניים, ולכן נמשכים המאמצים התעשייתיים והאקדמיים לשלוט בגליקוזילציה. מאחר שקמפיינים טיפוסיים של גליקו-הנדסה הם עתירי זמן ועבודה, יצירת פרוטוקול מהיר לאפיון ההשפעה של גנים של גליקוסילציה באמצעות השתקה חולפת תתברר כיעילה.

גליקו-הנדסה מהירה של נוגדנים בתאי שחלת אוגר סיניים

פרוטוקול זה מתאר שיטות שונות שיכולות לסייע בחקר הביולוגיה של ATG9A, כולל אימונופלואורסנציה ואחריה ניתוח תמונה, שיקולי ביטוי יתר חולפים, וחקירת מצב הגליקוזילציה ATG9A באמצעות כתם מערבי.

הדמיה ATG9A, חלבון ממברנה רב-מורחב

למד הפרדה אלקטרופורטית של מוקינים בעלי משקל מולקולרי גבוה באמצעות ג'ל אגרוז ומערב סופג. שיטה זו מאפשרת ניתוח מצב פולימרי וכימות יחסי של גליקופרוטאינים בדגימות עשירות בריר.

Mucin Agarose ג'ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי

גלה סרטונים נוספים