טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent
13 ביולי 2016
זיהוי מדויק ומיקום של תאי אפיתל לאורך רירית רירית המעי חיוני להגדיר שושלות תאים שונות. הדמיה תקינה של רקמות מעי היא קריטית לזיהוי דפוסי ביטוי חלבון עם רזולוציה מקסימלית. מחקר זה נועד להתוות שיטות האופטימליות ותנאי רקמות מעי עכבר עיבוד.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לעבד ביעילות קטעים ארוכים של רקמת מעיים של עכבר לצביעה היסטולוגית אחידה לאורכה. כדי לקבל את חלקי המעי יכולות להיות וריאציות בכתמים לכל אורך המעי. ניסיתי להשתמש בטכניקת הגלגול השוויצרית הסטנדרטית אך גיליתי שהיא מניבה רקמת מעי נוקשה מאוד ולא קלה לפתיחה.
עם קצת ניסויים, הגעתי לשיטת קיבוע מהירה שמשתמשת בכימיקלים פחות רעילים ומאפשרת גלגול שוויצרי הרבה יותר טוב של רקמת המעי. ניתן להשתמש בקיבוע השונה כדי לתקן במהירות רקמות עבות אחרות. כהכנה, המתת חסד של חיית הניסוי על פי פרוטוקול הטקסט והכינו את ההגדרה הניתוחית.
כדי להתחיל, השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לבצע חתך רוחבי באמצע הבטן כסנטימטר עד שני סנטימטרים מתחת לכלוב הצלעות, תלוי בגודל העכבר. לאחר מכן מפרקים בעדינות וחותכים את העור כדי לחשוף את שרירי הבטן. לאחר מכן, אחזו ומשכו את השרירים מבלי להחזיק או למשוך את המעיים.
לאחר מכן, בצע בזהירות חתך ראשוני בשרירי הבטן וחתוך אותם בזהירות כדי לחשוף את המעיים. כעת זהה את המעי הגס ועקוב אחריו עד לקצהו הדיסטלי שבו הוא מצטרף לפי הטבעת. לאחר מכן, בעזרת מספריים, חתכו את המעי הגס קרוב ככל האפשר לפתח פי הטבעת.
לאחר מכן מצא היכן הקיבה מצטרפת למעי הדק ובעזרת מספריים חותך את המעיים כסנטימטר אחד מהקיבה. כעת העבירו את כל אורך המעי הדק והמעי הגס החופשי לצלחת פטרי נקייה המכילה PBS. לאחר מכן, אבטח את הקצה הדיסטלי של המעי הגס ופרום בעדינות את כל אורך המעי הגס, תוך הסרת כל הרקמות המזנטריות המחוברות.
לאחר מכן זהה את הצקום, וחצה את המעי במקום שבו הצקום מצטרף למעי הגס, ובכך לבודד את המעי הגס. באופן דומה פרמו את שאר המעי הדק מרקמות החיבור והשומן המזנטריות המחוברות. ואז לחצות את המעי הדק במקום שבו הוא מצטרף לצקום.
לאחר מכן ניתן להסיר את הצקום ולזרוק אותו. כעת מלאו מזרק של 10 מיליליטר עם הקיבוע של בואן שונה והצמידו מחט גבאז'. הכנס את המחט כחצי סנטימטר לתוך הפתח הקדמי של קטע מעיים.
תוך כדי אבטחת מחט הגוואג 'בתוך הקטע, יש לשטוף לאט את תוכן הרקמה בעזרת קיבוע. היזהר, מכיוון שלחץ רב מדי יפרוץ את הקטע. אם המעי הדק נראה ארוך מדי לטיפול, ייתכן שתרצה לחתוך אותו תחילה לשלושה מקטעים שווים ולשטוף כל קטע בנפרד.
הקיבוע יגרום לצבע מקטע המעי להיות אטום. לאחר מכן, בעזרת מספריים, חותכים את הקטע לאורך הקו המזנטרי ואז שוטפים לזמן קצר את הקטע בצלחת PBS תוך החזקתו פתוח בעזרת מלקחיים. כעת חותכים את המעי הדק לשלושה מקטעים שווים, פרוקסימלי, אמצעי ודיסטלי, התואמים בערך לתריסריון, הג'ג'ונום והאילאום.
מבחינה מקרוסקופית, אין מאפיינים מובחנים לכל חלק. הקפד לסמן כדי לזהות את הפרוקסימלי מהקצה הדיסטלי בכל קטע. לאחר מכן הניחו קטע כשהצד הלומנלי פונה כלפי מעלה על מכסה צלחת פטרי.
בקטע המעי הגס, זהה את הצד הלומנלי על ידי הרכסים העוברים לרוחבו בקצה הפרוקסימלי. לאזורים האמצעיים והדיסטליים יש כמה וריאציות הפועלות לאורך. במעי הדק, זהה את הצד הלומנלי על ידי המשטח המחוספס יותר המסמן את הווילי.
בדיקה מיקרוסקופית מראה כי הווילי הם הארוכים ביותר באזורים הפרוקסימליים של כל מקטע, ואילו הקריפטות של המעי הגס הן הקצרות ביותר באזורים הפרוקסימליים והן הגבוהות ביותר בחלק האמצעי. המשך בגלגול שוויצרי של הנקודתיים. כשהמעי הגס שטוח פתוח והצד הלומנלי כלפי מעלה, משוך אותו בעזרת מלקחיים מהקצה הפרוקסימלי שלו לכיוון קצה צלחת הפטרי.
תוך שמירה על הצד הלומנלי כלפי מעלה, החזק את הקצה הפרוקסימלי בעזרת המלקחיים ועטוף את קצה הקצה הפרוקסימלי סביב קיסם וצבט בחוזקה את הקצה העטוף כנגד הקיסם. לאחר מכן מגלגלים בעדינות ולאט את המעי הגס סביב הקיסם ליצירת גליל שוויצרי. לאחר שכל אורך המעי הגס גולגל, השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי להחליק בזהירות את הגליל לתוך קלטת לעיבוד רקמות.
לאחר מכן העבירו את הקסטה לפורמלין של 10 אחוז חוצץ והניחו לה לדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר. כדי לגלגל קטע של מעי דק, פתחו אותו עם הצד הלומנלי כלפי מעלה ומשכו אותו בעזרת מלקחיים מהקצה הפרוקסימלי שלו לכיוון קצה הצלחת. לאחר מכן השתמש באותה טכניקה כפי שמוצג עם המעי הגס כדי להכין את הגליל השוויצרי ולתקן אותו בפורמלין.
באמצעות השיטות המתוארות, צביעת HND למעי הגס של עכבר C57 שחור 6 חשפה את כל חלקי המעי הגס להערכה היסטולוגית מקיפה. לאחר מכן, התכשיר שימש לעכברים המבטאים EGFP המונעים על ידי מקדם LGR5 הפעיל רק בקריפטות מעיים היקפיות. לטרנסגן EGFP זה יש רק כ-5 עד 10 אחוזי חדירה, אך ניתן למצוא בקלות אזורי עניין.
באמצעות אותם עכברים עם ביטוי EGFP LGR5, KLF5 ו-KI67 היו מוכתמים. תחילה נחקרו עכברי ביקורת עם ביטוי LGR5 תקין. תאים חיוביים של EGFP מסומנים בחצים כחולים ותאים שליליים של EGFP מסומנים בחצים לבנים.
ואז אותם טרנסגנים באו לידי ביטוי בעכבר נוקאאוט KLF5. צביעה משותפת של KLF5 ו-KI67 חסרה בתאי גזע חיוביים ל-EGFP, אך נשארת קיימת בקריפטות שליליות של EGFP. ברור שאיכות ההכנה לצביעה בכוח רב פלואורו טובה מאוד.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-15 דקות לכל עכבר אם אתה אוסף גם את המעי הדק וגם את המעי הגס. אל תשכח שעבודה עם הקיבוע של בואן עלולה להיות מסוכנת מאוד לעיניים. תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הגנה נכונה על העיניים בעת ביצוע הליך זה.
תודה שצפיתם והסתכלתם היטב על הניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בעיבוד יעיל של רקמה מעי של עכבר להשגת צביעה היסטולוגית אחידה. הוא מדגיש את החשיבות של שיטות קיבוע נכונות לשיפור איכות דגימות הרקמה לצורך דימות ואנליזה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- היסטולוגיה
- עיבוד רקמות
רקע
- זיהוי מדויק של תאים אפיתליאליים הוא חיוני להגדרת שורות תאים.
- דימות של רקמות מעי דורש שיטות עיבוד אופטימליות.
- שינויים בצביעה עשויים להתרחש לאורך המעי.
- טכניקות סטנדרטיות עלולות להוביל לרקמה קשיחה המקשה על הניתוח.
מטרת המחקר
- להגדיר שיטות אופטימליות לעיבוד רקמות מעי של עכברים.
- לשפר את אחידות הצביעה ההיסטולוגית.
- לפתח שיטת קיבוע המשתמשת בחומרים כימיים פחות רעילים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בטכניקת גלגול שוויצרית (Swiss rolling) משופרת.
- ניסוי עם שיטת קיבוע מהירה.
- הכנת תנאי ניתוח לאיסוף רקמות.
- יישום של חומר הקיבוע המשופר על רקמות עבות.
תוצאות עיקריות
- שיטת הקיבוע המשופרת מאפשרת גלילה טובה יותר (Swiss rolling) של רקמת המעי.
- שימוש בכימיקלים בעלי רעילות נמוכה יותר משפר את בטיחות תהליך הקיבוע.
- ניתן להשיג צביעה היסטולוגית אחידה באמצעות השיטה החדשה.
- ניתן להתאים את הטכניקה לרקמות עבות אחרות.
מסקנות
- טכניקות קיבוע משופרות משפרות את עיבוד הרקמה עבור היסטולוגיה.
- שיטות יעילות הן חיוניות לדימות ולניתוח מדויקים.
- מחקר נוסף יכול להרחיב את היישום של טכניקות אלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
עיבוד יעיל של רקמה מעי מאפשר הערכה היסטולוגית עקבית לאורך כל האיבר, ובכך תומך בניתוח כמותי של דלקת ותהליכי קרצינוגנזה. טכניקת ה-Swiss-rolling המשופרת משפרת את שימור המורפולוגיה של הרקמה, ומקלה על זיהוי אימונוהיסטוכימי ואימונופלואורסצנטי מהימן. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי הפחתת השונות בהכנת הדגימות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ההומאוסטזיס של אפיתל המעי והתגובה לפגיעה ולהתחדשות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות שיפור ההערכה ההיסטולוגית של חתכים מלאים של המעי.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לתהליכי עבודה המשכיים על ידי הבטחת תכונות מבניות שלמעי נשארו שלמות לאחר החיתוך.
- ערך תפעולי: פותר בעיות של סטנדרטיזציה ושחזור של בדיקות באמצעות צביעה היסטולוגית אחידה לאורך רקמת המעי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במערכות הרלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות להבחנה בין מאפיינים מבניים של המעי החיוניים למדידות כמותיות.
- ערך תפעולי: משפר את ההלימה של סממנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות עיבוד חסון המשתמש בשיטות זיהוי אימונוהיסטוכימיות ואימונופלוורסצנטיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הטכניקה משתלבת בתהליכי עבודה של ביולוגיה של גילוי על ידי שיפור עיבוד הרקמות לצורך ניתוח היסטולוגי, ובכך תומכת בזיהוי מובילים (leads) באמצעות הערכה מהימנה של תרכובות במודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים על ידי מתן אפשרות להערכת המורפולוגיה של אפיתל המעי.
- סריקה: מתארת את מוכנות הבדיקה באמצעות פלטים כמותיים מניתוחים אימונוהיסטוכימיים ואימונופלואורסצנטיים.
- אנליטיקה: מדגישה מדידות של דלקת במעי ותהליכי קרצינוגנזה לאורך כל אורך הרקמה.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני באמצעות מערכות רלוונטיות למחלה והתאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציגה את השיטה כיכולת ניתנת לשימוש חוזר לעיבוד רקמות עבות מעבר לדגימות מעי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי באמצעות הפחתת עמימות מכניסטית בניתוח רקמות מעיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של תהליכי עיבוד רקמות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך פיתוח (go/no-go) באמצעות תיקוף יעדים משופר והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים באמצעות הגברת מהימנות המודלים הפרה-קליניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בהיסטולוגיה ובטכניקות לעיבוד רקמות.
- דרישות לתשתיות אנליטיות ומכשור עבור קיבוע, הטבעה וחיתוך.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת ביצוע עקבי של טכניקת ה-Swiss-rolling.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים שונות המשתמשות במקבע Bouin's המ modified.
- מגבלות מעשיות כוללות טיפול בחומרים מסוכנים הדורשים הגנה מתאימה על העיניים.
