Name: קביעת Biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: למדו שיטה לבחינת הידבקות פתוגנים חיידקיים ופטרייתיים לתאי HeLa נגועים ב-HSV. טכניקה זו מאפשרת כימות אינטראקציות בין Staphylococcus aureus ו-Candida albicans בזיהומים כרוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי אוניברסיטת מידווסטרן, משרד המחקר והתוכניות הממומנות של אילינוי (ORSP) והמכללה לרפואת שיניים של אוניברסיטת מידווסטרן - אילינוי (CDMI).

1. זני HSV וטיפול הערה: רקומביננטי הלא מתפשטת HSV-1 (קוס) gL86 ו HSV-2 (קוס) 333gJ - עם פעילות הכתב בטא galactosidase בשימוש נמסרו על ידי V. Twiari 36,37. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש וירוס מרב וחנות אחת ב -80 מעלות צלזיוס ב יחס של 1: 1 של המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם 20% בסרום שור עוברי (FBS) ו חלב רזה עד שימוש. לפני האחסון הרבה ויראלי, לקבוע ריכוז הנגיף על ידי o -nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) ו 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל) assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כדאי וירוס ריבוי של זיהום (משרד פנים) על ידי מכתים X-גל עבור כל מחזור assay הניסיון באמצעות assay כניסת כתב וירוס, כפי שתואר לעיל (איור 1) 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל וירוס (Opt-MEM) כדי הרצוי משרד הפנים. תקן monolayers (paraformaldehyde; 0.5 מ&quot;ל / טוב) לפני מכתים. מניחים שולטים כדאיות וירוס בתוך microti נפרדצלחת ter במקביל צלחות assay polymicrobial. </li></ol> 2. טיפול Cell הלה 299 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ב DMEM עם 4.5 g / L גלוקוז, 10% בסרום שור העובר חום מומת (FBS), גנטמיצין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו L- גלוטמין. תאי המעבר בנקודת המפגש 80% עם פתרון טריפסין (חומצה ethylenediaminetetraacetic, 0.53 M EDTA; 0.05% טריפסין; 5 מ&quot;ל / בקבוק). </li></ol> 3. ג טיפול אלביקנס הערה: ג אלביקנס להשיג ממקור קליני מעבדתי מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס Remmel חלב רזה 2x בינוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות קפואה מנייה על Sabouraud דקסטרוז הבינוני (37 מעלות צלזיוס). לאחר 24 תת hr ב- C. אלביקנס על מדיום Fungisel (37 מעלות צלזיוס; 48 שעות) לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור צינור נבט (GT) צורות (איסוף מושבות נציג; FBS 3 מ&quot;ל; 3 שעות, 37 ° C; Abs 600, 0.3). לאחר דגירה, לשטוף GT (HBSS; 2x; 4,000 XG). להוסיף GT כדי לרחוץ חימם HBSS (37 &amp;# 176; C; 0.32 Abs 600). צורות GT צריכות להיות 99% של תאים נצפו כפי שנקבע על ידי ספירת hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך אמצעי שמרים (YF) השעיות המניות על ידי הרמת מושבות Fungisel נציג (HBSS, 3 מ&quot;ל; 0.32 Abs 600). ספירת צורות YF / ml מיקרוסקופית באמצעות hemocytometer. צורות YF צריכות להיות 99% של תאים נצפו כפי שנקבע על ידי ספירת hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את עבודת מניות פטרייתי (250 μl של GT או מניות YF ב 25 מיליליטר HBSS; 37 מעלות צלזיוס; 10 5 CFU / ml) </li></ol> 4. ס טיפול aureus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות S. aureus ATCC 25,923 (-80 ° C; Remmel לרחף 2x חלב). תרבות על אגר כבשים דם (5%; 37 מעלות צלזיוס; 24 שעות). פיק מושבות נציג ולהעביר מניטול מלחים בינוני בתוך 2 ימים עבור מניות (37 מעלות צלזיוס; 18 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ס aureus ההשעיה המניות (3 מ&quot;ל HBSS; 1.32 Abs 600; 10 8 CFU / ml) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את עבודת S. מניית aureus (100 μlשל המניה ב 25 מ&quot;ל HBSS; 10 5 CFU / ml). </li></ol></li></ol> 5. קנדידה וס השעיות aureus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מעורב ג אלביקנס וס ההשעיה aureus (250 YF μl או מלאי GT ו 100 μl S. aureus המניה ב -25 מ&quot;ל HBSS). </li></ol> 6. polymicrobial Assay Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 96 צלחות גם עם 200 μl של 2 x 10 5 תאים הלה / מ&quot;ל (רמת מפגש 85%). רוק צלחות (30 - 45 דקות, 37 ° C) לפני הדגירה (37 ° C; 5% CO 2 באינקובטור; 18 שעות). Monolayers Wash (1x; Opt-MEM) אז הזרע עם HSV (HSV-1 (קוס) gL86 או HSV-2 (קוס) 33 GJ - ב 100 μl Opt-MEM; משרד הפנים 50 ו -10). דגירה צלחות (3 שעות, 37 ° C; 5% CO 2). השתמש רק זן ויראלי אחד ליום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף monolayers נגוע (1x; בופר פוספט (PBS) עם Mg +2 ו Ca +2; 100 μl). החלף PBS עם HBSS חם עוזב 25 &amp; #181; l בכל טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף YF, GT ו / או ס aureus השעיות עובדים (100 μl; יעד יחס התא = 5: 1; n = 16). כפי שניתן לראות בטבלה 1 דגירה צלחות (סטטי; 30 דקות; 37 מעלות צלזיוס; 5% CO 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשאוב עמודה אחת בכל פעם מילוי מיד עם 300 μl PBS עם Mg +2 ו Ca +2. חזור על פעולה זו פעמים ואז להוסיף למאגר תמוגה assay הרדיו-immunoprecipitation (ריפה; מסנן מעקר: 200 μl של דילול 1:50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות triturate את lysate תא הלה מכן למקם 50 μl על מלחי מניטול (MS) ו / או Fungisel (F) מדיה (איור 2). מורחים את lysate באמצעות מכופף מוט הזכוכית בזווית של 90 מעלות. דגירת הצלחות (18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס). באופן ידני לספור את מספר מושבות בכל צלחת. בקרה מורכבת ס aureus ו / או C. דבקות אלביקנס לתאים הלה-נגוע HSV. </li></ol> 7. בדיקות הדמיה &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל coverslip זכוכית עגול (12 מ&quot;מ; 50 מיליליטר אצטון בכוס 100 מיליליטר). יבש לעקר coverslips (Kimwipes; בצלחות פטרי זכוכית). מניח coverslips סטרילי היבש לתוך הבארות של צלחות גם 24 סטרילי עם מלקחיים מעוקרים להבת אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תאי הלה (1 מיליליטר; נפח 5x המשמש 96 צלחות גם) על הבארות של 24 צלחות היטב המכילות את coverslips הזכוכית העגול סטרילי השטף. מוסיפים את וירוס, חיידקים ופטריות בהתאם לתבנית (טבלה 2) בשעה 5x נפח המשמש 96 צלחות היטב, ואז דגירה תהליך כמתואר בשלבים 6.2.1 ל -6.4 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה של דבר, לתקן את התאים במיקרוסקופ על ידי הצפת שקופיות עם מתנול, ולתת לו להתאדות. אחסן את הצלחות ב RT עד מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיקרוסקופ שדה הבהיר (1,000x הגדלה מקורית סופית) למלא את הבארות המכילות coverslips קבוע מתנול עם מים ללא יונים. מיד לשאוב מים. כיסוי כל coverslip עם סגול קריסטל גרם. לשטוף coverslips ללא כתם שאינו כבול (מים ללא יונים). Coverslips יבש באתרם ואז לדבוק בהם עם סט קשה הרכבה בינונית לשקופית שכותרתו (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אובייקטיבי 100x; 1,000x מקורי הגדלה סופית) לשטוף coverslips ללא מתנול בעצם כמתואר בשלב 7.4. יבש coverslips בבארות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש, להסיר את מכסה מחליק ומניחים אותם בשקופיות שכותרתו. לאחר מכן להוסיף כמות מספקת של 1:20 דילול של isothiocyanate והעמסת (FITC) מצומדות וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 + 2 נוגדן GD כדי לכסות את coverslip (1 - 5 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת השקופיות בתא לחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את coverslips ב 4 שינויים של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה של דבר, להחזיר את coverslip לשקופית שכותרתו. הכתם עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; קאמרית לחות; 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות). לאחר דגירה לשטוף את coverslips ב 4 צ&#39;אןGES של PBS, ואז להדביק לשקופית שכותרתו עם הרכבה בינונית סט קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הרכבה בינונית לרפא למשך 24 שעות ב RT בחושך. בדוק את coverslips תחת המטרה שמן משני מיקרוסקופ שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנני הפסקת FITC ו DAPI. בדוק תמונות של 50 שדות לפחות (100 תאים לכל מינימום אורגניזם) עבור שיתוף לוקליזציה (איור 4). </li></ol></li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כרגע אין מידע נגיש יחסי הגומלין המורכבים שבין קבע לחברי חצי קבוע של Microbiome מארח החוצות תחומים טקסונומיות מרובות, כלומר, פרוקריוטים, האיקריוטים ויראלי. לכן פיתחנו רומן במערכת מודל במבחנה ללמוד ייזום ביופילם על ידי ש aureus ו- C. אלביקנס על HSV-1 או HSV-2 נגוע הלה 229 (הלה) תאים 38. מערכת מודל תא הלה מציגה יתרון ייחודי. זאת בשל חוסר ביטוי פיברונקטין שטח, המשמש קולטן עבור שני ס aureus ו- C. אלביקנס...

<html> Microbiome האדם כולל אורגניזמים מגוונים מממלכות טקסונומיות מרובות החולקות אזורים גיאוגרפיים בגוף. דבקות משטחי תא היא צעד חיוני ראשון היווצרות ביופילם, המהווה חלק של תהליך הקולוניזציה Microbiome. כלול Microbiome יכול להיות וירוסים שגורמים זיהומים כרוניים ומתמשכים. זיהום התא הכרוני על ידי וירוסים אלה יכול לגרום שינוי זמין קולטן משוער. 1,2 בנוסף, ערך בתא ידי פתוגנים התאיים גם יכול להשפיע נזילות הממברנה מארחת / הידרופוביות אשר בתורו עשוי לשנות מצורפת של חברי Microbiome אחרים, כוללים חיידקים ופטריות . על מנת להבין את האינטראקציה שהוא יכול להתרחש בין פתוגנים רבים אלה ושהשיתוף למקם באותה האזורים הגיאוגרפיים של המארח האנושי, עלינו להיות מסוגל ללמוד את האינטראקציה של פתוגנים המייצגים את הספקטרום של ממלכות טקסונומיות נוכחות פני השטח הריריים. t &quot;&gt; The Herpesviridae הם משפחה של חיידקים הנמצאים 100% של בני אדם כמו החברות הקבועות Microbiome 3,4. בנוסף הם יכולים גם להיות לשפוך הן בהתמדה בנוכחות והיעדר תסמינים. באופן ספציפי, הרפס סימפלקס וירוס-1 ו הרפס סימפלקס וירוס-2 (HSV-1 ו- HSV-2, בהתאמה) הן חברות קבועות Microbiome ב oronasopharynx ו בדרך המין. אצל אנשי חיסון מוסמך, הן HSV-1 ו- HSV-2 הגורם gingivostomatitis, כמו גם הרפס גניטלי 5-8. באתרים אלה, HSV גורמת זיהום לטנטי המאופיין 9 ויראלי אסימפטומטית מתמשך שפיכה. כניסה של HSV לתוצאות תאי שינויים בביטוי פני nectins, סולפט heparan, רפסודות שומנים ומגשר כניסה ההרפס / נימק גידול הקולטן לגורם (HVEM / TNFr) 10-25. אלה קולטנים מייצגים משותף פוטנציאלי עבור כמה חיידקים ופטריות, למשל S. aureus ו ג אלביקנס, אשר תוך פתוגנים אופורטוניסטיים,גם יכול להיות מאוחסן כחברי Microbiome הרירית של oronasopharynx 26,27. בתוך oronasopharynx ס aureus ו- C. אלביקנס לכבוש שני לאתרים ייחודיים של קולוניזציה. בשנת מארחים עם שיניים טבעיות, רירית הפה משותפת HSV-1 ו- C. אלביקנס, בעוד nares האף הקדמי תפוס על ידי S. aureus 28. עם זאת, למרות במבחנה הממצאים ס aureus דבקה תאי אפיתל פה, 29,30 ס aureus מבודד לעתים רחוקות מן הדגימות אוראליות כאשר רקמות בריאות קיימת 29,30. מעט מאוד ידוע לגבי נישות שיתוף-קולוניזציה בדרכי מין מעבר הממצאים הקליניים שס aureus קשורה דלקת נרתיק אירובי, מאופיין בדלקת איברי מין, פרשות ו dyspareunia, בעוד ג אלביקנס מייצרת רירית נגעים דומים לזה שנצפה בחלל פי 31-35. לכן, למרות אותם חברי microbi האוראלי באברי המיןשת ממלכות טקסונומיות צלבו מעט מאוד ידוע לגבי האינטראקציה שלהם כפי שהוא משפיע יכל ליזום היווצרות ביופילם דרך דבקות אל פני שטח התא המארח 5. פרוטוקול זה יושם באופן יעיל כדי לקבוע את ההשלכות התפקודיות של שיתוף-קולוניזציה / זיהום.

<table><tbody><tr><td>C.albicans</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>S.aureus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol מלח אגר</td><td>טרוי ביולוגי</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>אגר דם כבשים</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td><תאי הלה חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (מדיום הנשר המותאם של Dubelcco, עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ו-L-גלוטמין, ללא נתרן פירובט</td><td>קורנינג</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין 50 מ"ג/מ"ל</td><td>סיגמא</td><td>1397</td><td>50 ומיקרו; ריכוז סופי של גרם/מ"ל בתמיסה השלמה DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.05% טריפסין, 0.53 M EDTA) 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% ריכוז סופי במדיום המלא DMEM</td></tr><tr><td>Other וריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס)</td><td>קורנינג</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1& 2, ספציפי עבור gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>גרם קריסטל סגול</td><td>טרויה ביולוגי</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 x 15</td><td>נקודות מדעי</td><td>229693&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>עיגולי החלקה לכיסוי, 12 מ"מ</td><td>דקלייזר</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

המחקר של אינטראקציות polymicrobial ברחבי הממלכות טקסונומיות הכוללים פטריות, חיידקים ווירוסים לא נבדקו בעבר ביחס כיצד חברי ויראלי של Microbiome להשפיע אינטראקציות חיידק לאחר מכן עם תאים המארח הנגועים בנגיף אלה. השיתוף למגורים של וירוס עם חיידקים ופטריות קיימים בעיקר על המשטחים הריריים של חלל הפה בדרכי מין. תאים ריריים, במיוחד אלה עם זיהומים נגיפיים סמויים כרוניים או מתמשכים מתמשכים, עשויים להיות השפעה משמעותית על חברי Microbiome בעקבות שינויים במבנה נגיף מספר וסוג קולטנים לידי ביטוי. שינוי בארכיטקטורת קרום תא מארח יביא יכולת שינתה החברים הבאים של הפלורה הנורמלי פתוגנים אופורטוניסטים ליזום את הצעד הראשון ההיווצרות ביופילם, כלומר, הדבקות. מחקר זה מתאר שיטה כדי לכמת ובדיקה ויזואלית של האפקט של HSV על הייזום של biofilהיווצרות מ (דבק) של ס aureus ו- C. אלביקנס.

רמת החוסן של נתוני השגה מהמערכת המתוארות בדוח זה מוצגת af איור 2 38. באמצעות השימוש במערכת זו האפנון של אינטראקצית staphylococcal ופטריות עם תאים נגועים בנגיף והשפיע על כל הדבקות של אחרים יכול להיות תחום. סוגים של מחקרים אלה דורשים בדיקה מיקרוסקופית של האינטראקציה כפי שמוצגים איורים 3 ו -4 38 על מנת לקבוע אם אינטראקצית polymicrobial מתרחשת על אותם תאים. במחקר זה אינטראקציה תא ...

שיטה מתוארת כאן לקביעת אסוציאציה ותחרות בין-ממלכה (חיידקים ופטריות) על היצמדות לחד-שכבות של תאי HeLa נגועים בנגיף. ניתן להרחיב פרוטוקול זה למספר שילובים של פרוקריוטים, איקריוטים ווירוסים.

קביעת Biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא למדוד את ההשפעות של תאים שהודבקו מראש ב-HSV על ההצמדה העוקבת של פתוגנים אופורטוניסטיים חיידקיים ופטריות, לדוגמה, Staphylococcus aureus ו-Candida albicans. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לתפקידה של זיהום ויראלי כרוני בבקרת החברים השונים של המיקרוביום של המארח. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבחון ולכמת את האינטראקציה בין מספר אורגניזמים בשלב הפתיחה של היווצרות הביופילם, דהיינו, ההיצמדות.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הבקרה של פתוגנים אופורטוניסטיים המתנחלים, מכיוון שהתנאי המקדים של זיהום HSV עם השלה א-סימפטומטית קיים ברוב אוכלוסיית בני האדם. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הבקרה של HSV על היצמדות מיקרוביאלית עוקבת, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות כגון זיהום CMV וזיהום באדנווירוס. לתחילתו של התהליך, קבע את חיות הנגיף של HSV1 או HSV2 ואת ריבוי הזיהום, או MOI, באמצעות צביעת x-gal עבור כל הרצה של בדיקה ניסיונית, תוך שימוש בבדיקת כניסת נגיף דגלי (reporter virus).דללו את הנגיף ל-MOI הרצוי והניחו את בקרות חיוניות הנגיף בפלטת מיקרוטיטר נפרדת במקביל לפלטות הבדיקה הפולי-מיקרוביאליות. לאחר מכן, השתמשו ב-100 µL של בופר פאראפורמאלדהיד גלוטראלדהיד כדי לקבע שכבות חד-שכבתיות לפני הצביעה. כדי לתחזק תאי HeLa, גדלו אותם ב-DMEM עם 4.5 g/L של גלוקוז, 10% FBS שעבר נטרול בחום, 50 µg/L של gentamisin ו-L-glutamine.השתמשו בתמיסת Trypsin להעברה של התאים כאשר הם מגיעים ל-80 אחוזי התמזגות (confluence). לטיפול ב-C.albicans, תרבתו מאגר קפוא על מצע sub around dexterous בטמפרטורה של 37 degrees celsius. לאחר 24 שעות, העבירו תת-תרבית של C.albicans למצע fungicell דגרו אותם למשך 48 שעות לפני השימוש.ייצרו נבטיים (germ tubes או GT) של C.albicans על ידי בחירת מושבות מייצגות של פטריות ותרבית שלהן בשלושה מיליליטר של FPS בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות. לאחר הדגירה, סובבו את התרבית במהירות של 4,000 ×g למשך עשר דקות. לאחר מכן, השתמשו ב-HBSS כדי לשטוף את התאים פעמיים.לאחר שימוש בhemocytometer לספירת התאים, הוסיפו את ה-GT השטוף ל-HBSS בטמפרטורה של 37 degrees celsius עד להגעה ל-OD 600 של 0.32. להכנת תרחיפי מלאי של שמרים, או YF, בחרו מושבות מייצגות של fungicell והשתמשו בהן כדי להחדיר (inoculate) ל-3 milliliters של HBSS. גדלו את התרביות עד ל-OD 600 של 0.32; בעזרת hemocytometer, ספרו את מספר צורות ה-YF למיליליטר, אשר צריכות להוות 99% מהתאים הנצפים תחת המיקרוסקופ.הכינו תרשמי פטרייה פעיל על ידי העברה של 250 µL ממאגר GT או YF לתוך 25 mL של HBSS בטמפרטורה של 37 °C. פעולה זו תביא לריכוז של 10⁵ CFUs למילליטר. כדי להכין SRES ATCC 25923, בצעו מריחה של מאגר קפוא על מצע אגר דם כבשים בריכוז של 5% והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות.בתוך יומיים, בחרו מושבות מייצגות, העבירו אותן למצע Mannitol salts וגדלו בטמפרטורה של 37 degrees celsius למשך 18 שעות. כדי להכין מלאי SRES, תלו מושבות מייצגות ב-3 milliliters של HBSS בטמפרטורה של 37 degrees celsius עד לערך OD 600 של 0.132 או 10⁸ CFU per milliliter. להכנת מלאי עבודה, העבירו 100 microliters מתליון המלאי ל-25 milliliters של HBSS.תוצאה זו מובילה ל-10⁵ CFU למטר של מיליליטר. השלב הקריטי הראשוני בעת יישום שיטה זו על אורגניזמים או זנים אחרים של מיקרובים הוא קביעת המספר הנכון של חיידקים ופטריות שיש להוסיף, כך שיהיה מספר מספיק של מושבות לספירה. לביצוע בדיקת ביופילם פולי-מיקרוביאלית, זרעו פלטות של 96 בארות עם 200 µL של 2×10¹⁵ תאי HeLa למליליטר.טלטלו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 עד 45 דקות לפני דגירה ב-5% CO2 בטמפרטורה של 37 °C למשך 18 שעות. השתמשו ב-One X optimum לשטיפת השכבות המונידריות, ולאחר מכן זרעו זן בודד של HSV. בדקו זן אחד בלבד בכל פעם.דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% CO2 למשך שלוש שעות. שטפו את השכבות המוניים המודבקות באמצעות 100 µL של PBS בטמפרטורה של 37 °C עם מגנזיום וסידן. לאחר מכן, השתמשו ב-HBSS בטמפרטורה של 37 °C כדי להחליף את ה-PBS.השאירו 25 µL של HBSS בכל באר. לאחר מכן, הוסיפו תמיחת עבודה של YF, GT ו/או SRES והדגירו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C ב-5% CO2 למשך 30 דקות. לאחר ההדגרה, שאבו את הנוזלים מעמודה אחת בפלטה בכל פעם.מלאו מיד את הבארות ב-300 µL של PBS עם מגנזיום וסידן. לאחר חזרה על שלב שטיפה זה פעמיים, הוסיפו לבכל בארה 200 µL של תמיסת RIPA lysis buffer מסוננת סטרילית בדילול של 1:50. בעבודה עם זני בקטריות או פטריות אחרים, וודאו כי ריכוז ה-RIPA שבו השתמשתם מספיק לליזיס של התאים, אך עדיין מאפשר ביצוע בדיקת חיוניות מיקרוביאלית.בצעו טריטורציה מהירה של הליזט של תאי HeLa וטפטפו 50 µL על מצע מלחים של mannitol או על מצע fungicell. לאחר מכן, בעזרת מוט זכוכית מכופף בזווית של 90 מעלות, פזרו את הליזט על פני השטח של הצלחת. לאחר דגירה של הצלחות למשך 18 שעות, ספרו ידנית את מספר המושבות בכל צלחת.הביקרות מורכבות מ-SRES או מ-C.albicans הנצמדים לתאי HeLa שאינם מזוהמים ב-HSV. לצורך ביצוע מחקרי דימוי, שטפו כל כיסוי זכוכית עגול באצטון לפני הסטריליזציה. לאחר מכן, באמצעות פינצטה שעברה סטריליזציה באלכוהול ובעזרת להבה, הניחו את כיסויי הזכוכית הסטריליים והיבשים לתוך בארות של פלטות סטריליות בעלות 24 בארות.הוסיפו תאי HeLa לבארי הפלטות המכילות את כיסויי הזכוכית (cover slips). לאחר מכן, הדביקו את התאים בנגיף. לאחר ההדבקה, הוסיפו חיידקים ופטריות בהתאם לתבנית, דגרו ועבדו את התאים כפי שהודגם קודם לכן עבור פלטת 96 בארי.לאחר השטיפה האחרונה, קבעו את התאים לצורך מיקרוסקופיה על ידי הצפת לביבות הזכוכית (cover slips) במתנול ולאחר מכן המתינו להתאיידותו. עבור מיקרוסקופיה בשדה בהיר, מלאו את הבארות המכילות את לביבות הזכוכית המקובעות במים דה-יוניים. שאבו מיד את המים והוסיפו כמות מספקת של crystal violet כדי לכסות כל לביבת זכוכית.לאחר שטיפת כיסויות הזכוכית הצבועות בקריסטל ויולהת (crystal violet) במים דה-יונזיים, ייבשו אותן ב-C2 לפני הצמדתן לשקופית מסומנת באמצעות תמיסת קיבוע קשיחה (hard set mounting medium). עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, לאחר שטיפת כיסויות הזכוכית מהמתנול, ייבשו אותן בבארות לפני קיבוען על שקופיות מסומנות בעזרת תמיסת קיבוע קשיחה. הוסיפו כמות מספקת של מהילת 1:20 של נוגדן FITC conjugated HSV1 plus 2GD כך שתכסה את כיסיית הזכוכית.דגרו את השקופיות בתא לחות בטמפרטורה של 37 degrees celsius למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את כיסויי הזכוכית ארבע פעמים באמצעות PBS. לאחר השטיפה האחרונה, החזירו את השקופיות לתא הלחות.הוסף dab B והדגר למשך 30 דקות ב-37 degrees celsius. לאחר ההדגרה, שטוף את השקופיות ארבע פעמים ב-PBS. הנח לתווך ההשחאה להתייבש למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.לאחר מכן, תחת עדשת שמן, במיקרוסקופ שדה בהיר או פלואורסצנציה, בחנו לפחות 50 שדות כדי לבדוק קולוקליזציה. תוצאות מייצגות של השפעת HSV על היצמדות של Staphylococcus ו/או Candida albicans מוצגות כאן. נוכחות של HSV1 עיכבה את היצמדות ה-Staphylococcal לתאי HeLa.נוכחותם של צורות צינור נבט (germ tube) של Candida, אך לא של צורות שמרים, החזירה את רמות ההיצמדות של Staphylococci. תוצאות דומות נמדדו עבור תאי HeLa שהודבקו ב-HSV2. כפי שניתן לראות בדמות זו, רמת ההיצמדות של צורות צינור נבט של Candida גבוהה באופן משמעותי עבור תאים שהודבקו ב-HSV2 מאשר עבור תאים שהודבקו ב-HSV1.השפעת ההיפוך נמדדה עבור HSV1 לעומת HSV2 על צורות שמרים של Candida. דפוסי ההיצמדות נקבעו באמצעות צביעת קריסטל ויולט של שכבות מונו-שכבה כדי להמחיש את האינטראקציה בין החיידקים לפטרייה. לאחר מכן נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לקבוע את נוכחות ה-HSV ביחס למיקרובים האחרים.בהיעדר HSV, סטפילוקוקים (Staphylococci) וכן צורות השמרים וצינורות הנבט (germ tube) של Candida נמצאו במיקום משותף על תאי HeLa. עם זאת, רק Candida נצפתה בתאים שהודבקו ב-HSV. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שמונה עד תשע שעות אם היא מבוצעת כראוי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון צביעה דיפרנציאלית של נוגדנים פלואורסצנטיים, כדי לענות על שאלות נוספות כמו ביטוי דיפרנציאלי של רצפטורים על פני השטח שנמצאים לאחר כניסת הנגיף לתא. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום המיקרוביום האנושי לחקור אינטראקציות לאחר חדירת מיקרובים בתרביות רקמה ובמערכות של תרבית איברים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לפתח מודל של אינטראקציה פולימיקרוביאלית המקיף ממלכות טקסונומיות שונות.יש לזכור כי עבודה עם פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש צורך בנקיטת אמצעי זהירות, כגון שימוש בזני נגיפים שאינם מתפשטים ובטכניקות מחסום.

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Assay מתאר אמצעי מהיר למדוד היווצרות biofilm מוקדם חיידקים ופטריות. שיטה זו משתמשת צלחת microtiter כמו לתשתית להיווצרות חיידקים biofilm ו biofilm היא דמיינו באמצעות סגול זן קריסטל. Assay מספק גם assay איכותי או כמותי ליצירת biofilm מוקדם.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

מקור: טיי, ס. ב. ואחרים. הפרעה אנטי-וירולנטית של ביופילמים פתוגניים באמצעות לקטונאזות מהונדסות לכיבוי קוורום.  J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים שיטה לכימות ביומסה ביופילמית בחיידק פתוגני, תוך השוואת מערכות ביקורת לא מטופלות לדגימות שטופלו באנזים שמדביר קווארום. האנזים משבש את איתות החיידקים במהלך הדגירה המוקדמת, ומפחית את ההיצמדות של התא. לאחר שטיפה והמשך דגירות, בארות הבקרה יוצרות ביופילמים צפופים, בעוד שבארות מטופלות מראות היווצרות מופחתת. צבע קטיוני משמש לצביעת הביופילם, ונמדד ספיגה להערכת...

כימות דיכוי ביופילם המושר על ידי אנזימים בחיידקים פתוגניים

מקור: Schlafer, S, ו-Frost Kristensen, M. ניטור pH חוץ-תאי בביופילמים חוצי-ממלכה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את גידול הביופילמים החוצי-ממלכותיים של Streptococcus mutans ו-Candida albicans בתנאים דמויי פה כדי למודל אינטראקציות חיידקיות–פטריות, ומאפשר חקר סינרגיה מיקרוביאלית, הידבקות מתווכת גלוקן ואלימות חומצית בפתוגנזה הפה.

הקמת ביופילמים חיידקיים-פטרייתיים חוצי ממלכה לחקר פתוגנזה אורלית

מקור: מיקל גואנוק, ס., ואחרים. שיטה חדשה לניתוח איכותי רב-קנה מידה של ביופילמים חיידקיים על מושבות פטריות סיביות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ואלקטרונית. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את הכנת תרבית פטרייה על ממברנות צלופן מטופלות לתמיכה ביצירת מושבות וצמיחה רדיאלית. לאחר מכן הוא מציג את גידול והכנת תאי חיידק בקרקע לצורך בדיקות אינטראקציה. לבסוף, הוא ממחיש כיצד תאי חיידק נדבקים למושבה הפטרייתית ויוצרים ביופילם, מה שמאפשר חקר אינטראקציות בין חיידקים לפטרייה.

הקמת קו-קולטורה פטרייתיית-חיידקית ליצירת ביופילם

סרטון זה ממחיש את התחלת היווצרות ביופילם רב-מיקרוביאלי על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות. זיהום וירוס הרפס סימפלקס מעכב את ההתקשרות החיידקית לתאים, ומונע לוקליזציה משותפת חיידקית-פטרייתית. לעומת זאת, תאים לא נגועים מציגים קו-לוקליזציה חיידקית-פטרייתית וייזום של היווצרות ביופילם.

בדיקה לקביעת התחלת ביופילם רב-מיקרוביאלי על תאים נגועים בנגיף

סרטון זה מתאר שיטה לגידול וניתוח איכותי של ביופילמים חיידקיים על קורים פטרייתיים באמצעות מיקרוסקופיה. ביופילמים חיידקיים נוצרים לעתים קרובות על משטחים פטרייתיים וכוללים תהליכי אינטראקציה חיידקיים-פטרייתיים רבים, כגון שיתוף פעולה מטבולי, תחרות או טריפה.

שיטה להכנת דגימות כדי לדמיין חיידקים יוצרי ביופילם על קורים פטרייתיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

פרוטוקול זה מאפשר לקורא לנתח מלח מרה-induced ביופילמים בתוך פתוגנים המעית באמצעות גישה רב פנים כדי ללכוד באופי הדינמי של biofilms חיידקי על-ידי הערכת הדבקות, היווצרות מטריצה חוץ-תאית חומר הפולימרים, פיזור.

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

פרוטוקול זה מתאר את הכנת החיסון, כימות הביופילם על לוחות מיקרוטיטר באמצעות צבע סגול גבישי, הספירה בת קיימא בביופילמים והדמיה של ביופילמים של אסינטובקטר.

אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של Acinetobacter

למדו שיטה לבחינת הידבקות פתוגנים חיידקיים ופטרייתיים לתאי HeLa נגועים ב-HSV. טכניקה זו מאפשרת כימות אינטראקציות בין Staphylococcus aureus ו-Candida albicans בזיהומים כרוניים.

קביעת Biofilm ייזום על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות

גלה סרטונים נוספים