Name: Assay חינם-נייד באמצעות Laevis Xenopus עוברי מחלץ לחקור מנגנונים של תקנת גודל גרעינית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: חקור מנגנוני ויסות גודל גרעיני באמצעות שיטת מיצוי חינם-תאי מעוברי Xenopus laevis. השיטה מאפשרת לחקור כיצד גרעינים גדולים מתכווצים לגודל קטן יותר בביולוגיה התאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

חברי מעבדות לוי וגטלין וכן עמיתים במחלקה לביולוגיה מולקולרית הציעו עצות ודיונים מועילים. רבקה הילד סיפקה תמיכה בשלבים המוקדמים של פיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי ה-NIH/NIGMS (R15GM106318) והאגודה האמריקאית לסרטן (RSG-15-035-01-DDC).

<ol><li>Conklin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+and+nuclear+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Cell size and nuclear size.</a> J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).</li>
<li>Wilson, E. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+EB+%22The+Cell+in+Development+and+Heredity%22">The Cell in Development and Heredity</a>. , The Macmillan Company. 727-733 (1925).</li>
<li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+size+is+regulated+by+importin+alpha+and+Ntf2+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus.</a> Cell. 143 (2), 288-298 (2010).</li>
<li>Chan, Y. H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+properties+of+cell+and+organelle+size%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Scaling properties of cell and organelle size.</a> Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).</li>
<li>Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+nucleus%3A+Factors+and+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Shaping the nucleus: Factors and forces.</a> J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).</li>
<li>Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+the+nucleus%3A+nuclear+shape%2C+size+and+nuclear-envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly.</a> J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).</li>
<li>Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+size+regulation%3A+from+single+cells+to+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear size regulation: from single cells to development and disease.</a> Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).</li>
<li>Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+shaping+the+nucleus%3A+mechanisms+and+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance.</a> Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).</li>
<li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular scaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).</li>
<li>Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+mechanisms+and+functions+of+nuclear+size+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).</li>
<li>Jevtic, P., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+size+scaling+during+Xenopus+early+development+contributes+to+midblastula+transition+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing.</a> Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).</li>
<li>Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+DNA+density+affects+chromosome+condensation+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans.</a> Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Jevtic, P., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nuclear+size+regulation+in+model+systems+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).</li>
<li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometrically+estimated+variation+in+nuclear+size.+A+useful+tool+in+grading+prostatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Res%22%5BJournal%5D)">Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer.</a> Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).</li>
<li>Dey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nucleus%3A+morphology+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Cancer nucleus: morphology and beyond.</a> Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+about+cancer+from+frogs%3A+analysis+of+mitotic+spindles+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts.</a> Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).</li>
<li>Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Edens, L. J., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEdens%2C+LJ+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).</li>
<li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Scaling+Problems+and+Solutions+in+Amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166(2016).</li>
<li>Edens, L. J., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cPKC+regulates+interphase+nuclear+size+during+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development.</a> J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+II.+Control+of+the+onset+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription.</a> Cell. 30 (3), 687-696 (1982).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30 (3), 675-686 (1982).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Khan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+alterations+in+nuclear+structure+predict+prostate+carcinoma+distant+metastasis+and+death+in+men+with+biochemical+recurrence+after+radical+prostatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy.</a> Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).</li>
<li>Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+nuclear+morphometry+with+pathologic+parameters+in+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast.</a> Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).</li>
<li>Zeimet, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+ploidy%2C+nuclear+size%2C+proliferation+index+and+DNA-hypomethylation+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).</li>
<li>Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup188+controls+passage+of+membrane+proteins+across+the+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex.</a> J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).</li>
<li>Wuhr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+upper+limit+to+mitotic+spindle+length%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for an upper limit to mitotic spindle length.</a> Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).</li>
<li>Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Katanin+contributes+to+interspecies+spindle+length+scaling+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus.</a> Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).</li>
<li>Wilbur, J. D., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+scaling+during+Xenopus+development+by+kif2a+and+importin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin.</a> eLife. 2, e00290(2013).</li>
<li>Kieserman, E. K., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+size+scaling+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome size scaling in Xenopus.</a> Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).</li>
<li>Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+is+essential+for+mitotic+chromosome+architecture+and+segregation+in+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts.</a> J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).</li>
<li>MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISWI+remodeling+complexes+in+Xenopus+egg+extracts%3A+identification+as+major+chromosomal+components+that+are+regulated+by+INCENP-aurora+B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).</li>
<li>Goehring, N. W., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+growth+control+through+limiting+pools+of+cytoplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components.</a> Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).</li>
<li>Du Toit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%3A+Honey%2C+I+shrunk+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development: Honey, I shrunk the nucleus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633(2014).</li>
<li>Buchner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+kinase+C+in+the+regulation+of+cell+growth+and+in+signalling+to+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).</li>
<li>Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C%2C+an+elusive+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C, an elusive therapeutic target.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן מוצגת שיטה חדשה לחקר מנגנוני ויסות גודל גרעיני במהלך התפתחות X. laevis . התקדמות התפתחותית קשורה לשינויים דרמטיים בפיזיולוגיה של התא, בחילוף החומרים, בשיעורי החלוקה ובנדידה, כמו גם לשינויים בגודל התאים ובמבנים התוך-תאיים. תהליכים מגוונים אלה הם מורכבים וחיוניים, ולכן קשה לחקור רק אחד מההיבטים הללו של התפתחות בסביבה in vivo . תמצית העובר X. laevis ובדיקת ההתכווצות הגרעינית המתוארת כאן מאפשרות לחקור מנגנוני ויסות גודל בהקשר חוץ גופני , תוך עקיפת האותות המורכבים והאילוצים הפיזיקליים ש...

הגדלים של אברונים הסלולר בדרך כלל בקנה מידה עם הגודל של התא, ואת זה כבר אולי מתועד ביותר עבור קנה המידה של גודל גרעין עם תא בגודל 1-10. זה נכון במיוחד במהלך embryogenesis ו התמיינות תאים, כאשר ירידות דרמטיות בשני תא וגודל גרעיני לעתים קרובות הם נצפו 11,12. יתר על כן, גודל גרעין שינה הוא פרמטר מרכזי באבחון הסרטן ופרוגנוזה 13-17. מנגנונים שתורמים רגולצית גודל גרעין אינם ידועים בעיקר, בין שאר בשל מורכבות מהותה של מבנה גרעין ותפקוד. השיטה המתוארת כאן פותחה בתור assay במבחנה עבור קנה מידת גודל גרעיני אך למניפולציה ביוכימיות מבהירה מנגנוני ויסות גודל גרעין. תמצית laevis ביצה Xenopus היא מערכת מבוססת היטב לשחזר וללמוד תהליכים תאיים מורכבים במבחנה </em&gt; הקשר. תמציות אלה חשפו מידע בסיסי חדש על תהליכים תאיים מספר כולל הרכבה ותפקוד של ציר mitotic, reticulum endoplasmic, והגרעין 18-22. אחד מיתרונות המפתח למערכת לחלץ הוא X. תמציות ביצה laevis מייצגים הציטופלסמה חי כמעט שהרכבו ניתן לשנות בקלות, למשל באמצעות תוספת של חלבונים רקומביננטיים או immunodepletion. יתר על כן, אחד הוא מסוגל לתפעל תהליכים חיוניים ידי העסקת טיפולים שעלולים להיות קטלניים בהקשר vivo. שינוי של התהליכים לחלץ ביצה לאפשר בידוד של תמציות מן X. עוברים laevis ולא ביצים, ותמציות העובר אלה ניתנים באופן שווה על מניפולציה ביוכימית 23. במהלך X. laevis פיתוח, העובר המופרה התא הבודד (~ 1 מ&quot;מ קוטר) עובר סדרה של שנתי עשר חלוקות תא מהירות (שלבים 1 - 8) כדי לייצר כמה אלף 50 μמ &#39;קוטר ותאים קטנים, להגיע לשלב ההתפתחותי כינה המעבר midblastula (MBT) או שלב 8 24-26. MBT מאופיין תחילת שעתוק zygotic, נדידת תאים, חלוקות תא אסינכרוני, רכישת שלבי פער, והקמה בגדלים יציבים גרעיניים ולא הרחבה גרעינית מתמשכת כמו לעובר שטרם MBT. משלב 4 עד gastrulation (טיולי 10.5 - 12), היקף גרעינים בודדים פוחת ביותר מ פי 10 11. כאן, המטרה היא לזהות מנגנונים אחראים ההפחתות אלה בגודל גרעיני במהלך התקדמות התפתחותית. הגישה היא להרכיב גרעינים ראשונים X. laevis הביצה ואת תמצית לבודד אותם גרעינים מן הציטופלסמה ביצה / תמצית. גרעינים אלו מכן resuspended בציטופלסמה מעוברים בשלב gastrula מאוחר. לאחר תקופת דגירה, הגרעינים מתמצית ביצה נעשים קטנים יותר בתמצית העובר בשלב מאוחר. סברנו כי woul זהד להיות assay שימושי לזיהוי רכיבים ציטופלסמית הנוכחי בעוברים מאוחר שתורמים לכיול גודל הגרעין התפתחותית. שימוש assay זה, בשילוב עם אימות in vivo, הראינו כי חלבון קינאז C (PKC) תורמת להפחתה התפתחותית בגודל גרעיני X. laevis 23.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 חמור אנטי עכבר</td><td>IgG בדיקות מולקולריות</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>ATP מלח דיסודיום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>בנזוקאין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>רוטור צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>JS 13.1</td><td></td></tr><tr><td>כימוסטטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין פוספט דיסודיום</td><td>קלביוכם</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>ציקלוהקסימיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>ציטוכלזין D</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>חד פעמי מגבונים (kimwipes)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>צלחת התגבשות זכוכית (150 x 75 מ"מ)</td> <td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>מקרון</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - ביסבנזמיד H 33342 טריהידרוכלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - גונדוטרופין כוריוני אנושי&nbsp;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 מדיה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>סיגמא אולדריץ</td><td>' L2884</td><td></td></tr><tr><td>ליזולציטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין + סטרפטומיצין</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>פפסטאטין</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>סרט פרפין מפלסטיק (פרפילם)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - סרום סוסה בהריון Gonadotropin</td><td>Prospec</td><td>hor-272-a</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>צינורות זכוכית תחתונים עגולים, 15 מ"ל</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG)ThermoFisher</td><td></td> <td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>ציקלר תרמי</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (מדיום הרכבה נגד דהייה)</td> <td>וקטור</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

assay חינם-נייד באמצעות<em&gt; laevis xenopus</em&gt; עוברי מחלץ לחקור מנגנונים של תקנת גודל גרעינית

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

שאלת יסוד בביולוגיה של התא הוא כיצד גדלים התא אברון מוסדרים. זה כבר זמן רב מוכר שגודל הגרעין מאזניים בדרך כלל עם הגודל של התא, בעיקר במהלך embryogenesis כאשר ירידות דרמטיות בשני התאים וגדלים גרעיניים להתרחש. מנגנוני ויסות גודל גרעין הם ידועים ברובם עשויים להיות רלוונטיים לסרטן שבו גודל גרעין שינה הוא פרמטר דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים מפתח. בשנת vivo גישות לזיהוי רגולטורי גודל גרעין מסובכות על ידי המהות והמורכבת של פונקציה גרעינית. הגישה חוץ הגופייה המתוארת כאן כדי ללמוד שליטת גודל גרעין מנצלת את הירידות הרגילות בגודל גרעיני המתרחשות במהלך התפתחות laevis Xenopus. ראשית, גרעינים הם התאספו X. laevis לחלץ ביצה. לאחר מכן, גרעינים אלה מבודדים resuspended בציטופלסמה מעובר בשלב מאוחר. אחרי 30 - תקופת דגירה 90 דקות, שטח פנים גרעינייםפוחת ב -20 - 60%, מתן assay שימושי לזהות רכיבים ציטופלסמית נוכחיים בעוברים מאוחר שתורמים לכיול גודל גרעין התפתחותית. יתרון עיקרי של גישה זו הוא המתקן היחסי שבה תמציות ביצת עובר ניתן להשפיע מבחינה ביוכימית, המאפשרות זיהוי של חלבונים ופעילויות רומן מווסתים גודל גרעין. כמו בכל בגישה חוץ גופית, אימות של תוצאות מערכת in vivo זה דבר חשוב, microinjection של X. עוברת laevis מתאים במיוחד ללימודים אלה.

העצרת של גרעינים ב Egg חלץ הצעדים הראשונים של פרוטוקול זה יערכו את X. laevis לחלץ ביצה (פרוטוקול 1) גרעיני זרע demembranated (פרוטוקול 2). ריאגנטים אלה משמשים לאחר מכן כדי להרכיב גרעיני דה נובו (פרוטוקול 3). איור 1 מציג כמה נתונים נציג. תוספת של סידן שמניע את תמצית ביצה נעצר meiotically לתוך שלבי ...

מנגנונים של קנה מידה תאי ותוך-תאי נותרו חמקמקים. השימוש בתמציות עוברי קסנופוס הפך נפוץ יותר ויותר כדי להבהיר מנגנונים של ויסות גודל האברונים. שיטה זו מתארת הכנת תמצית עובר ובדיקת קנה מידה גרעינית חדשה שבאמצעותה ניתן לזהות מנגנונים של ויסות גודל גרעיני.

Assay חינם-נייד באמצעות<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברי מחלץ לחקור מנגנונים של תקנת גודל גרעינית

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשתמש בתמציות של ביצי ועוברי Xenopus כדי ליצור מערך בדיקה שבו גרעינים גדולים מתכווצים לגודל קטן יותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של הגרעין התאי, כגון מהם המנגנונים המווסתים את גודל הגרעין? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לתמרן בקלות את ההרכב והפעילות של תמצית Xenopus נטולת תאים כדי להעריך את הגורמים המשפיעים על גודל הגרעין.לאחר הכנת תמציות ביצי Xenopus, תאי זרע ללא ממברנה וגרעינים מורכבים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, אספו ביצים שהונחו acabado על ידי החזקת הצפרדעים מעל צלחת פטרי מזכוכית בעלת אפשרות לשימוש חוזר. עודדו את הנחת הביצים על ידי הפעלת לחץ עדין על הגב התחתון ליד הקלואקה. הטו את הצלחת בזווית של כ-45 מעלות כדי לאפשר לביצים להצטבר לאורך דופן הצלחת.לאחר מכן, הסר את עודפי התמימות (buffer) והוסף כמות מספקת של MMR בריכוז 1/3X כך שתכסה בקושי את הביצים. באמצעות עלי פסטל (pestle) המותאם היטב, מעך והומוגניז 1/4 מאשך בתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של Modified Barth's Saline עתיר מלחים, או MBS. לאחר מכן, הוסף את האשך המעוך אל הביצים ואפשר להפריה להתרחש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.לאחר הדגירה, הצפו את הביצים ב-one-third X MMR. לאחר מכן, בחלוף חמש עד 10 דקות, ודאו את ההפריה על ידי בדיקת התכווצותו של הקוטב החייתי בעל הפי

a-cell-free-assay-using-xenopus-laevis-embryo-extracts-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הרכבה קרום הגרעין היא צעד חיוני במחזור חלוקת התא, תהליך זה יכול להיות משוכפל במבחנה על ידי שילוב של הכרומטין Xenopus זרע, cytosol, וכן שברים קרום אור. גרעינים השלם נוצרים, כולל ממברנות הגרעין עם מתחמי הנקבובית, ואלה גרעינים מחדש מסוגלים תהליכים גרעיניים רגילים.

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

פרוטוקול להכנת חזקים, בקנה מידה קטן תמציות הלה גרעיני מתואר. פרוטוקול זה הוא בעל ערך עבור מבחני הדורשים שימוש של אוכלוסיות קטנות של תאים, כגון תאים שטופלו בתרופות או RNAi. השיטה צריכה להיות ישים למגוון רחב של ביטוי גנים מבחני סוגי תאים אחרים, כולל תאים חולים.

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

אנו מתארים את האוסף של...

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

המנגנונים המולקולריים של דה-קונדנסטציה של כרומטין מיטוטי דחוס מאוד אינם מוגדרים כהלכה. אנו מציגים בדיקה נטולת תאים המבוססת על אשכולות כרומטין מיטוטיים שבודדו מתאי HeLa ותמצית ביצי Xenopus laevis המשחזרת נאמנה את תהליך העיבוי במבחנה.

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

אנו מתארים צעדים המאפשרים דיגום מהיר בתוך באתרו של חלק קטן של תא יחיד עם דיוק גבוהה, הפלישה מינימלי באמצעות נימי מיקרו-דגימה, כדי להקל על אפיון כימי של תמונת מצב של פעילות מטבולית חיים העוברים באמצעות אלקטרופורזה נימי תא בודד לפי הזמנה ספקטרומטר מסה פלטפורמה.

Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

אנו מציגים שיטה לדור של במבחנה עצמית מתמשכת mitotic תנודות ברמת תא בודד על-ידי לבצע תמציות ביצה של צפרדע רפואית זריזה microemulsions מים בתוך שמן.

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

אנו מתארים שיטה להכנה והדמיה חיה של תמציות ציטופלסמיות לא מדוללות מביצי Xenopus laevis .

קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

אנו מתארים שיטת היצרה פיזית ליצירת עוברים מיניאטוריים מעוברים חד-תאיים של Xenopus laevis .

מניפולציה פיזית ליצירת עוברים מיניאטוריים של Xenopus

אנו מתארים שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברים מוקדמים של Xenopus laevis ולמיין אותם לפי גודל התא.

בידוד תאים בודדים מעוברים מוקדמים של Xenopus ומיונם לפי גודל

חקור מנגנוני ויסות גודל גרעיני באמצעות שיטת מיצוי חינם-תאי מעוברי Xenopus laevis. השיטה מאפשרת לחקור כיצד גרעינים גדולים מתכווצים לגודל קטן יותר בביולוגיה התאית.

Assay חינם-נייד באמצעות

גלה סרטונים נוספים