Assay חינם-נייד באמצעות

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשתמש בתמציות של ביצי ועוברי Xenopus כדי ליצור מערך בדיקה שבו גרעינים גדולים מתכווצים לגודל קטן יותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של הגרעין התאי, כגון מהם המנגנונים המווסתים את גודל הגרעין? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לתמרן בקלות את ההרכב והפעילות של תמצית Xenopus נטולת תאים כדי להעריך את הגורמים המשפיעים על גודל הגרעין.

לאחר הכנת תמציות ביצי Xenopus, תאי זרע ללא ממברנה וגרעינים מורכבים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, אספו ביצים שהונחו acabado על ידי החזקת הצפרדעים מעל צלחת פטרי מזכוכית בעלת אפשרות לשימוש חוזר. עודדו את הנחת הביצים על ידי הפעלת לחץ עדין על הגב התחתון ליד הקלואקה. הטו את הצלחת בזווית של כ-45 מעלות כדי לאפשר לביצים להצטבר לאורך דופן הצלחת.

לאחר מכן, הסר את עודפי התמימות (buffer) והוסף כמות מספקת של MMR בריכוז 1/3X כך שתכסה בקושי את הביצים. באמצעות עלי פסטל (pestle) המותאם היטב, מעך והומוגניז 1/4 מאשך בתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של Modified Barth's Saline עתיר מלחים, או MBS. לאחר מכן, הוסף את האשך המעוך אל הביצים ואפשר להפריה להתרחש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר הדגירה, הצפו את הביצים ב-one-third X MMR. לאחר מכן, בחלוף חמש עד 10 דקות, ודאו את ההפריה על ידי בדיקת התכווצותו של הקוטב החייתי בעל הפיגמנט הכהה וסיבובם של העוברים כך שקוטביהם החייתיים פונים כלפי מעלה. באמצעות פיפטת פלסטיק בעלת פיה רחבה, הסירו בקפידה ביצים מתות, מולטות או כאלו שלא הופרו ולא עברו פילוח, שכן הן יגרמו במהירות למותם של עוברים סמוכים.

בטווח של שעה עד 2.5 שעות לאחר ההפריה, יש לבצע הסרת ג'ל (dejelly) לעוברים בציסטין בריכוז של שני עד שלושה אחוזים המומס ב-1/3 X MMR, אשר הותאם ל-pH 7.9. לפני הסרת הג'ל, העוברים תופסים נפח גדול יחסית. בצע שתי החלפות של התמיhôte למשך שלוש עד ארבע דקות בכל פעם.

לאחר מכן, שטפו ביסודיות את העוברים באמצעות שישה עד 10 החלפות קצרות של one-third X MMR כדי להסיר את כל שאריות ה-cysteine. לאחר הסרת הג'לי (dejellying), העוברים נדחסים זה לזה ותופסים נפח קטן יחסית. כעת, באמצעות פיפטת זכוכית רחבה, העבירו עוברים מופתים ובריאים לצקת פטרי המכילה one-third X MMR טרי.

בטמפרטורת החדר, אפשרו להם להתפתח לשלב הרצוי. המשיכו להסיר עוברים מתים או שעברו ליזיס, כפי שניתן לזהות על פי היעדר של חלוקה ראשונה או מראה לבן ונפוח. כאשר העוברים הגיעו לשלבים 11.5 עד 12, העבירו אותם לתוכנית טרייה של one-third X MMR מועשר ב-0.5 millimolar cycloheximide, והדגירו את העוברים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לעצור אותם בשלב האינטרפאזה המאוחרת.

באמצעות פיפטה מזכוכית או פלסטיק בעלת פתח רחב, העבירו מינימום של 15 עוברים שנעצרו בשלב האינטרפאזה למבחנת מיקרוצנטריפוגה. הוסיפו לעוברים מיליליטר אחד של בופר לליזת ביצים (egg lysis buffer, או ELB), המועשר במיקרוליטר אחד של תמיסת מקור LPC. הפכו את המבחנה בעדינות כדי לשטוף את העוברים.

לאחר מכן, אפשרו לעוברים לשקוע לתחתית המבחנה. לפני הסרת הבופר, חזרו על השטיפה פעמיים נוספות. השביו את העוברים ב-500 µL של ELB, בתוספת 0.5 µL של תמיסת מקור LPC, 5 µL של 19.7 mM cycloheximide, ו-5 µL של 35.5 mM cytochalasin D כדי לעכב את פולימריזציית האקטין.

סבב את הדגימות בצנטריפוגת שולחנית ב-200 times G למשך דקה אחת, לאחר מכן הסר את עודפי הבופר והשתמש בעלי פסטל כדי למעוך את העובריים ביסודיות. הנח את הדגימות המעוכות ברוטור עם סלים נדנדים (swinging bucket rotor) וסבב ב-10,000 times G ובטמפרטורה של 16 degrees Celsius למשך 10 דקות. באמצעות טיפ של פיפט בנפח 200 microliter, נקב את שכבת הליפידים מהחלק העליון, ובעזרת טיפ פיפט נקי, העבר את השכבה הציטופלזמית האמצעית שצבעה ענברי למבחנה בגודל מתאים.

הוסיפו לתמצית העוברים את الريאגנטים הבאים. לאחר מכן, הפכו בעדינות את המבחנה כדי לערבב. לאחר ויזואליזציה של גרעיני עוברים אנדוגניים בתמצית על ידי הכנת דגימת squash בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הסירו את הגרעינים מהתמצית על ידי הוספת נפח שווה של ELB המכיל את הריאגנטים המפורטים כאן.

הפוך את המבחנה בעדינות כדי לערבב. סבב את הדגימה בצנטריפוגה עם רטור של סלים נדנדים (swinging bucket rotor) ב-17,000 ×g בטמפרטורה של 16 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, אסוף את הנוזל העליון (supernatant), תוך הקפדה להימנע משומנים שנותרו בחלק העליון, והשאר את הגרעינים שנשקעו בתחתית ללא הפרעה.

הכינו squash כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב כדי להבטיח שמרבית הגרעינים הוסרו. לאחר מכן, השתמשו בתמצית הטריה, או חלקו את הדגימה לאליקוטים ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. בודדו גרעינים שהורכבו בתמצית ביצה על ידי דילול של 25 עד 150 microliters של גרעינים שהורכבו מראש בתוך one millileter של ELB בשפופרת של 1.5 milliliter.

סבב בצנטריפוגה ב-1600 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן הסר את הבאפר, תוך הקפדה לא להפריע למשקע. הוסף למשקע נפח של תמצית עוברים השווה לנפח המקורי של תמצית הביצית, והקש בעדינות על המבחנה כדי לפרק את המשקע ולהשהות מחדש את הגרעינים.

דגרו בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות, תוך써 נקישה עדינה על המבחנה לערבוב מדי 15 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, נקישו על המבחנה כדי להשעות מחדש את הגרעינים רגע לפני הוספת 500 microliters של ELB עם 15% glycerol ו-2.6% Paraformaldehyde. הפכו את המבחנה מיד, והניחו אותה על רוטטור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

הכינו מבחנות לסרכזגגיה (spin-down tubes) על ידי הצבת התאמות פלסטיק בעלות תחתית עגולה בתוך מבחנות זכוכית בעלות תחתית עגולה בנפח 15 מיליליטר. הוסיפו 5 מיליליטר של בופר כרית גרעינית (nuclear cushion buffer), ולאחר מכן הכניסו למבחנה כיסוי זכוכית (coverslip) עגול בקוטר 12 מילימטר, תוך וידוא שהוא מונח בצורה שטוחה על גבי ההתאמה הפלסטית. באמצעות טיפ פיפטה בעל פיה רחבה, הניחו בעדינות את תמיסת הגרעינים המקובעים בשכבה מעל כרית הגרעינים.

סובב את הדגימה בצנטריפוגה עם רטור של סלים נתלהים (swinging bucket rotor) במהירות של 1,000 ×g ובטמפרטורה של 16 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, השתמש בשואב (aspirator) כדי להסיר את כל הבאפר והחזק את התושבת הפלסטית בחלק העליון של המבחנה. לאחר מכן, בעזרת פינצטה עדינה, הסר את לבידה (coverslip), תוך הקפדה לציין על איזה צד של הלבידה נסובבו הגרעינים.

קבעו את הזכוכית המכסה במיתנול קר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הזכוכית המכסה, כאשר צד הגרעינים פונה כלפי מעלה, על גבי יריעת סרט פלסטיק של פראפין המצפה צלחת פטרי פלסטית גדולה. לאחר מכן, הניחו מגבונים רטובים חד-פעמיים לאורך דפנות הצלחת כדי למנוע התייבשות.

בעזרת 500 µL של PBS NP40, בצעו רהידרטציה לגרעינים על לביש 유리 (coverslip) למשך חמש עד 10 שניות ושאבו את הנוזל. לאחר מכן, העבירו בזהירות שכבה של 75 µL של PBS 3%BSA על לביש הזכוכית, והניחו לו לחסום בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, או ב-4 °C למשך הלילה. הסירו את חוצץ החסימה (blocking buffer) והדגירו עם נוגדן ראשוני המדולל ב-PBS 3%BSA.

לאחר מכן, שטפו את הדגימות בחמישה סבבים רצופים של PBS NP40. חזרו על שלבי האינקובציה והשטיפה הללו עם נוגדנים משניים. דגרו עם 10 micrograms per milliliter של Hoechst המדלל ב-PBS 3%BSA למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו חמש פעמים עם PBS NP40 והסירו את כל עודפי התמימות. לבסוף, הצמידו את מכסי הזכוכית (coverslip) לעלית זכוכית באמצעות 5 µL של תמיסות קיבוע למניעת דהייה (anti-fade mounting medium). השתמשו בסבב לק שקוף כדי לאטום את מכסי הזכוכית ודמיינו מיד באמצעות מיקרוסקופ אפי-פלוורסצנציה, או שמרו בטמפרטורה של 40 °C לצילום מאוחר יותר.

איור זה מראה את הרכבת הגרעינים בתמצית ביضים. כ-30-45 דקות לאחר תחילת התגובה, גרעיני הזרע הדקים, בעלי הצורה ה-S, אמורים להתחיל להתעבות למסות כרומטין בצורת נחליא. לאחר השלמת הרכבת הגרעין, צורת הגרעין אמורה להפוך לעגולה יותר, ונפח הגרעין אמור לגדול ככל שמעטפת הגרעין מתרחבת וחלבונים גרעיניים מיובאים פנימה.

כפי שמוצג כאן, דריכה (squash) של מנה קטנה מתוך תמצית העוברית שצבעה Hoechst מראה גרעינים צבועים רבים, המעידים על כך שהכנת התמצית הצליחה. לאחר הסרת הגרעינים על ידי סרצ'יפוגציה, בהשוואה לדריכה הראשונה, אמורים להישאר בתמצית גרעינים מעטים בלבד, כפי שניתן לראות בפאנל זה, דבר המבטיח שגרעינים אנדוגניים לא יפריעו לאנליזות המשך. אם גרעינים עדיין נוכחים, נדרש סבב שני של סרצ'יפוגציה.

בבדיקת התכווצות הגרעין זו, גרעינים ממיצוי ביضים שהושעו מחדש במיצוי עוברים בשלב מאוחר הופכים לקטנים יותר עם הזמן. עם זאת, גרעינים שדוגרו עם מיצוי עוברים שעבר דה-אקטיבציה תרמית אינם מתכווצים. חזרות רבות על הניסוי הן חשובות כדי להתמודד עם השונות המובנית של הבדיקה.

ברגע שהפרוטוקול נלמד היטב, ניתן לבצעו במלואו ביומיים, כאשר בדיקת ההתכווצות הגרעינית עצמה אורכת כארבע שעות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע בקרת איכות לביציים ולעובריים לאורך כל התהליך, ולהיזהר מאוד להימנע מהמשקע ומשכבות הליפידים בעת איסוף התמצית הציטופלזמית לאחר הסתירציה.

לדוגמה, הזרקה מיקרוסקופית לעוברים, או טרנספקציה של תרביות תאים. יתרה מכך, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את ויסות הגודל של אברונים אחרים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של הגרעין התאי לחקור את מנגנוני הבקרה של גודל הגרעין ואת התפקיד התפקודי של גודל הגרעין בהתפתחות ובקרצינוגנזה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ההרכבה והבידוד של גרעיני תאי מיצוי ביצי Xenopus, יצירת עוברים של Xenopus ומיצוי עוברים, ביצוע בדיקת התכווצות הגרעין (nuclear shrinking assay) והדמיון של התוצאות.