מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא לדמיין ולעקוב אחר ההתקדמות של תכנות מחדש של תאים סומטיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים או iPSC. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום ה-iPSC, כגון כיצד קינטיקה של תכנות מחדש ויעילות תכנות מחדש משתנות על ידי הרקמות הסומטיות המשמשות, טכנולוגיות התכנות מחדש המיושמות ושילובי המטריצה והמדיה המשמשים איתה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא משתמשת בסמני פני התא כדי להסתכל על המעברים של תאים סומטיים ל-iPSCs, כך שתוכלו להשתמש בטכנולוגיה הזו כדי להיות מסוגלים לנטר בזמן אמת את אירועי התכנות מחדש.

ביום השביעי לאחר ההעברה, שטפו את הפיברובלסטים עם שני מיליליטר DPBS לבאר והוסיפו 0.5 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס 05% EDTA לכל באר למשך שלוש עד חמש דקות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים התעגלו, עצרו את התגובה עם שני מיליליטר של מדיום פיברובלסטים של 37 מעלות צלזיוס לכל באר והעבירו בעדינות את המדיום על פני תחתית כל באר כדי לעקור את התאים. העבירו את הפיברובלסטים מכל באר לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר ואספו אותם באמצעות צנטריפוגה.

השעו מחדש את הכדורים בשני מיליליטר של מדיום פיברובלסטים טרי של 37 מעלות צלזיוס וספרו את התאים מכל מצב תרבית. לאחר מכן, זרעו פעם אחת 10 עד חמישית תאים לבארות מותנות שאינן תלויות במזין שהוכנו מראש בצלחת תרבית רקמה בת שש בארות ודגרו על התאים המומרים בחממת תרבית התאים למשך הלילה. למחרת, החלף את המדיום בכל באר במדיום המתאים ליישום התא.

לאחר מכן הנח את הצלחת בהדמיה והגדר את התוכנה לצלם תמונות רציפות של ניגודיות פאזה שלמה ותמונות פלואורסצנטיות עבור כל באר כל שש עד שמונה שעות במשך 14 הימים הבאים. בתום ניסוי התכנות מחדש, שטפו את הבארות פעם אחת עם שני מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מדיום DMEM/F12. השליכו את הכביסה וסמנו את התאים במיליליטר אחד לבאר של הנוגדנים הראשוניים המתאימים במדיום DMEM/F12 טרי למשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים פעמיים במדיום DMEM/F12 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השליכו את הכביסה וסמנו את התאים במיליליטר אחד של הנוגדנים המשניים המתאימים במדיום DMEM/F12 של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים פעמיים נוספות במדיום DMEM/F12.

לאחר מכן החלף את הכביסה בכל באר בשני מיליליטר של מדיום DMEM/F12 טרי של 37 מעלות צלזיוס. הכנס את הכלי לתוך ההדמיה ופתח את תוכנת ההדמיה. כדי להגדיר סריקות בתוכנת מערכת ההדמיה, בחר תחילה את מיקום המגש שבו יש להשתמש ובחר את סוג המנה לסריקה.

לאחר מכן, בחר הדמיית באר שלמה, התבנית לסריקת הבארות הרצויות, ותעלות הפלואורסצנט המתאימות לזיהוי בזמן אמת של סמני פני השטח המעניינים. לאחר מכן סמן את הניסוי לסריקה והגדר את נקודות הזמן והמרווחים לדגימות שיש לסרוק בכל יום. כדי לנתח קבוצה של ניסויים סרוקים, בחר את הניסוי המעניין ובחר הפעל משימת ניתוח חדשה.

לאחר מכן בחר את הגדרת העיבוד המתאימה לסוג הניתוח בהתאם לערוצים המשמשים להדמיה, למשל, PSC Phase Colony Count. תן שם למשימת הניתוח. ובחר את טווח הזמן לניתוח ולבארות שיש לנתח.

לאחר מכן הפעל את משימת הניתוח. כדי למדוד את נקודות הזמן הרצויות לתכנות מחדש מבארות בודדות, יש לשטוף את באר העניין פעם אחת עם שני מיליליטר DPBS. לאחר מכן החלף את הכביסה במיליליטר אחד של תמיסת 37 מעלות צלזיוס מחוממת מראש 05% טריפסין-EDTA.

לאחר חמש דקות של 37 מעלות צלזיוס, שטפו את הטריפסין על קרקעית הבאר כדי לפרק את התאים לתרחיף חד-תאי ולהעביר את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. בעזרת שלושה מיליליטר DPBS, שטפו את כל התאים שנותרו מהבאר ומשכו אותם בצינור של 15 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר נוספים של DPBS לתאים וסובב אותם כלפי מטה על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום DMEM/F12 לספירה. לאחר מכן יש לדלל את תרחיף התאים לעשירית מששת התאים לריכוז מיליליטר ולצמצם מיליליטר אחד של תאים לכל שפופרת למספר הדגימות המתאים. לאחר מכן, סמן את התאים עם הנוגדנים העיקריים המעניינים במיליליטר אחד של מדיום DMEM/F12 למשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים פעמיים במדיום DMEM/F12 של 37 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של DPBS והעבירו את הדגימות לצינורות FACS בודדים. רכוש את פרופילי ציטומטריית הזרימה של הלוחות המתוכנתים מחדש.

לאחר מכן העבר את קבצי ה-FCS למחשב וייבא את הקבצים לתוכנת הניתוח המתאימה. פתח את קובץ הבקרה הראשון בתרשים פיזור קדימה לצד זה והגדר את ציר ה-y לסולם לוגריתמי. לאחר מכן צור שער מצולע סביב האוכלוסייה החיה.

לאחר מכן, צור אזור פיזור צדדי על ידי עלילת גובה פיזור עם התאים החיים והגדר שער מלבני כדי לא לכלול את הכפילים. לאחר מכן השתמש בשערים אלה כדי לנתח את קבצי הדגימה הניסיוניים תחת הערוצים הפלואורסצנטיים המתאימים כדי לזהות את האוכלוסיות המעניינות ברבעים שלהם. תכנות מחדש של פיברובלסטים BJ עם וירוסי תכנות מחדש של סנדאי מייצר תאי SSEA4+CD44 בקצב שונה מאשר תכנות מחדש של פיברובלסטים DF1, מה שמדגים כי ניתן להשתמש בהשוואה מוקדמת של אחוז תאי הגזע הפלוריפוטנטיים דמויי תאי גזע SSEA4+CD44 כדי לעקוב אחר התקדמות התכנות מחדש.

במהלך זמן זרימה ציטומטרית, CD24-CD44+ ו-CD44+ פיברובלסטים שליליים של EpCAM יוצרים אוכלוסיות שליליות כפולות שעוברות מאוחר יותר לתאים דמויי תאי גזע CD24+CD44-ו-EpCAM חיוביים CD44-פלוריפוטנטיים בהתאמה, מה שמדגים עוד יותר את התקדמות התכנות מחדש. הדמיה בזמן אמת של תרביות התכנות מחדש לאחר הזריעה מחדש מדגימה היווצרות מושבה הדרגתית המתאימה לעלייה לוגריתמית במפגש שלהן ומדגימה את ביטוי הסמן החיובי הפלוריפוטנטי הסופי והשלילי הפיברובלסטים בסיום התכנות מחדש. יתר על כן, שימוש בגן מדווח מאפשר למדוד את המפגש תחת ניגודיות פאזה עם עלייה הדרגתית יותר של מפגש ה-GFP שנצפה בהשוואה למפגש הכולל.

ואכן, בניסוי מייצג זה, מפגש ה-GFP ביום ה-19 היה פחות ממחצית המפגש הכולל המתאים לתכנות מחדש המלא. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להבהיר מידע על אירועי תכנות מחדש ולעקוב אחר הקינטיקה של תכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי להסתכל על רקמות תאים סומטיות התחלתיות שונות, טכנולוגיות התכנות מחדש המשמשות, ושילובי מטריצות בינוניות כדי להבהיר אירועי תכנות מחדש.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש בניטור בזמן אמת ובביטוי סמני פני התא, כדי להיות מסוגלים לעקוב אחר התכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים ל-iPSCs.