Name: מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למד מדידת קינטי בזמן אמת של תכנות מחדש סומטיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר מעברי תאים וסמני פלוריפוטנטיות בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים צ&#39;אד מקארתור לדיונים מועילים.

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+monitoring+of+hiPSC+generation+and+differentiation+using+differential+expression+of+endogenous+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs.</a> PLoS One. 5, e11834(2010).</li>
<li>Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+strategies+in+fluorescent+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Combinatorial strategies in fluorescent probe development.</a> Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+is+a+negative+cell+surface+marker+for+pluripotent+stem+cell+identification+during+human+fibroblast+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming.</a> PLoS One. 9, e85419(2014).</li>
<li>Papp, B., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+to+pluripotency%3A+stepwise+resetting+of+the+epigenetic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape.</a> Cell Res. 21, 486-501 (2011).</li>
<li>Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+marker+mediated+purification+of+iPS+cell+intermediates+from+a+reprogrammable+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model.</a> J Vis Exp. , e51728(2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+fibroblast-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+support+undifferentiated+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth.</a> Stem Cells. 22, 972-980 (2004).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).</li>
<li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+live+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).</li>
<li>Naujok, O., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-evaluation+of+CD24-positivity+of+human+embryonic+stem+cells+differentiated+into+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).</li>
<li>Ramirez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+benchmarking+human+pluripotent+stem+cell+markers+during+differentiation+into+the+three+germ+layers+unveils+a+striking+heterogeneity%3A+all+markers+are+not+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal.</a> Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).</li>
<li>Huang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+complex+proteins+promote+transcription+factor-mediated+pluripotency+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming.</a> J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).</li>
<li>Kolle, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem Cells. 26, 119-126 (2008).</li>
</ol>

כל המחברים [RHQ, JSTA, KS, ו UL] הם עובדי תרמו פישר סיינטיפיק, אשר מייצרת חלק ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

מחקר זה מספק אסטרטגיות לניטור ומעקב אחר תהליך התכנות מחדש באמצעות ציטומטריית זרימה וניתוח מבוסס הדמיה בזמן אמת. השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם התחלת תכנות מחדש, מדידת התקדמות תכנות מחדש על סמך ביטוי סמן וניטור בזמן אמת של תכנות מחדש. ניתן להשתמש בכל שיטת תכנות מחדש לבחירה, אך כאן אנו מתמקדים בתכנות מחדש מבוסס סנדאי של פיברובלסטים אנושיים. היתרון בשיטה זו הוא קלות השימוש והיעילות הגבוהה העקבית של תכנות מחדש. 
כדי להעריך את התקדמות התכנות מחדש, תאים נקצרים בשלבים נפרדים של תכנות מחדש ונתונים לניתו...

החולה שמקורם בתאי גזע מושרים (iPSCs) הם כלים מבטיח טיפול בתא ההקרנה התרופה. הם מספקים מקור עצמי של תאים לטיפול. בנוסף, הם כוללים סט רחב מאוד של רקע גנטי, מה שמאפשר ניתוח במבחנה מפורט של מחלות גנטיות מעבר למה תאי גזע עובריים נוכחיים (ESC) קווים ייאפשרו. ההתקדמות שחלה באחרונה הוביל לפיתוח של מספר שיטות להפקת iPSCs, כולל תכנות מחדש בנגיף סנדאי, פלסמידים episomal או mRNAs 1,2. יש לציין, שיטות תכנות מחדש שונות קשורות עם רמות משתנות של יעילות ובטיחות, וכן צפויים שונים באופנים אחרים המשפיעים והתאמתו ליישומים שונים. עם הזמינות של מגוון רחב של טכנולוגיות תכנות מחדש, זה הפך להיות חשוב לפתח שיטות להערכת תהליך תכנות מחדש. רוב השיטות הקיימות להסתמך על בדיקה איכותית של מורפולוגיה או מכתיםעם צבעים ונוגדני תא ספציפי גזע. שיטה שפותחה לאחרונה אחת עושה שימוש לכתבי קרינת lentiviral רגישים miRNAs PSC ספציפי או mRNAs תא ספציפי בדיל 3. שיטות מעקב כזה להקל על הבחירה ואופטימיזציה של טכניקות תכנות מחדש למצבים שונים. לדוגמא, CDy1 שמש בדיקת ניאון עבור iPSCs מוקדם כדי למסך מאפנני תכנות מחדש 4. היכולת להתבונן ולהשוות ניסויים תכנות מחדש שונים הינה עניין מהותי, להבנה טובה יותר של התהליך עצמו. למשל, כיום ידוע כי סוגים מסוימים תא סומטי קלים יותר לתכנת מחדש מאחרים 5, וכי תאים לעבור מצבי ביניים במהלך תכנות מחדש 6-8. למרבה הצער, את המנגנונים העומדים בבסיס תהליך תכנות מחדש עדיין אינם מובנים לחלוטין וכתוצאה מכך, ההבדלים המדויקים בין שיטות תכנות מחדש להישאר גם כדי להיות Defined. לפיכך, שיטות לניטור, שמאות והשוואת אירועי תכנות מחדש להמשיך להיות קריטי עבור השדה התא גזע. השיטות שתוארו בפרוטוקול זה לאפשר הניטור והערכה של תהליך תכנות מחדש ותדגמנה טכניקות אלה יכולים לשמש כדי להשוות קבוצות שונות של ריאגנטים תכנות מחדש. נקודת המבט הראשון הוא cytometry זרימה מנתח באמצעות שילובים של נוגדנים נגד תאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים סמנים (PSC). הדמיה בזמן אמת זוגות הגישה השנייה ומדידת מפגש הכולל (שטח הפנים אחוזים מכוסה על ידי תאים) ואת המפגש של אותות סמן (שטח הפנים אחוזים מכוסה על ידי אותות ניאון).

<table><tbody><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, GlutaMAXSupplement, פירובט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך לתאי גזע עובריים, ממקור ארה"ב</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>עכבר (ICR) פיברובלסטים עובריים מומתים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>חלבון גורם התקשרות (1x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, תוסף GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10828010</tr><tr><td>2-מרקפטואתנול (55 מ"מ)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז, סוג IV, אבקה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x), ללא פנול אדום&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, מוסמך hESC, גורם גדילה מופחת מטריצת ממברנת מרתף</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) חלבון אנושי רקומביננטי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בקר שבר V (תמיסה של 7.5%)</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 מ')</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/מ"ל)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תכנות מחדש של CytoTune-iPS Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 ערכת תכנות מחדש של Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Countess II מונה תאים אוטומטי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess תא ספירת תאים שקופיות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC פיברובלסטים של עורלה אנושית, יילודים</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 פיברובלסטים עוריים אנושיים למבוגרים</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG תאים וריאנט hESC hOct4-GFP תאי דיווח</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 נוגדן, מצומד Alexa Fluor 647 (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן SSEA-4, מצומד Alexa Fluor 488 (eBioMC-813-70 (MC-813-70))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 נוגדן (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 נוגדן (cl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 חולדה אנטי-אדם/עכבר mAb (שיבוט IM7), PE-Cy5 מצומד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488 ערכה מצומדת להדמיית תאים חיים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-5700 (כבר לא זמין)</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר עיזים, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11029</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד חולדות IgG (H+L), Alexa Fluor 594 מצומד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11007</td><td></td></tr><tr><td>אלקליין פוספטאז כתם חי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 ערכת מצומד להדמיית תאים חיים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 עכבר אנטי-אנושי mAb (שיבוט SN3), FITC מצומד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מיקרוגלובולין בטא-2, מצומד FITC (B2M-01)</td> <td>Thermo Fisher נוגדן מדעי</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326, מצומד FITC (VU-1D9)</td><td>נוגדן Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR ערכת מצע פוספטאז אלקליין אדום (AP)</td><td>מעבדות וקטור</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Z1 מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נתונים FlowJo</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune Accoustic Focus Cytometer, לייזר כחול/אדום</td><td>Thermo Fisher שימוש מדעי</td><td>Attune NXT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e\ סדרן תאים (488/561 ננומטר)</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 12 x 75 מ"מ שפופרת עם מכסה מסננת תאים</td><td>352235</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלקון 15 מ"ל, מכסה בורג אטום כיפה בבהירות גבוהה</td><td>קורנינג</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>פלקון T-75 353136</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלקון T-175</td><td>353112</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלקון צלחת 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO2 חממה מתגלגלת</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>נון-סטיק, צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"ל</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer מיקסר</td><td></td> לדוגמא <td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת קינטי real time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

תכנות מחדש סומטי איפשר המרה של תאים בוגרים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) מרקעים גנטיים מגוונים ופנוטיפים של מחלות. ההתקדמות האחרונה זיהתה שיטות יעילות ובטוחות יותר להכנסת גורמי תכנות מחדש. עם זאת, ישנם מעט כלים לניטור ומעקב אחר התקדמות התכנות מחדש. השיטות הנוכחיות לניטור תכנות מחדש מסתמכות על בדיקה איכותית של מורפולוגיה או צביעה בצבעים ונוגדנים ספציפיים לתאי גזע. כלים לניתוח התקדמות יצירת iPSC יכולים לסייע בהבנה טובה יותר של התהליך בתנאים שונים ממקורות תאים מגוונים. 
מחקר זה מציג גישות מפתח למדידה קינטית של התקדמות תכנות מחדש באמצעות ציטומטריית זרימה וכן ניטור בזמן אמת באמצעות הדמיה. כדי למדוד את הקינטיקה של תכנות מחדש, בוצע ניתוח זרימה בנקודות זמן נפרדות באמצעות נוגדנים כנגד סמני תאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים. השילוב של ויזואליזציה בזמן אמת וניתוח זרימה מאפשר מחקר כמותי של תכנות מחדש בשלבים שונים ומספק השוואה מדויקת יותר בין מערכות ושיטות שונות. ניתוח מבוסס תמונה בזמן אמת שימש לניטור רציף של פיברובלסטים כשהם מתוכנתים מחדש במערכת מדיום נטולת מזין. הקינטיקה של היווצרות המושבה נמדדה על סמך מפגש בתעלות ניגוד פאזה או פלואורסצנטיות לאחר צביעה בצבע פוספטאז אלקליין חי או נוגדנים כנגד SSEA4 או TRA-1-60. התוצאות הצביעו על כך שמדידת המפגש מספקת מדדים כמותיים למחצה לניטור התקדמות התכנות מחדש.

ניטור קינטיקס Reprogramming שימוש cytometry זרימה CD44 הוא סמן פיברובלסטים בעוד SSEA4 הוא סמן PSC 6,10. כצפוי מדפוס הביטוי הזה, cytometry זרימה של ב&quot;ג פיברובלסטים מראה SSEA4 - CD44 + האוכלוסייה המאפשרת יצירת שערים ברבע בשילוב עם מדגם בלא כתם. במהלך תכנות מחדש של פיברובלסטים DF1 עם וירוסים סנדאי, CD44 ה...

הפרוטוקול המובא במחקר זה מתאר שיטות לניטור בזמן אמת של התקדמות מחדש באמצעות מדידת הקינטית של סמנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים באמצעות ניתוח תזרים cytometry. הפרוטוקול גם כולל את הערכה המבוססת על הדמיה של מורפולוגיה, סמן או ביטוי הכתב במהלך הדור iPSC.

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

המטרה הכללית של פרוצדורות אלו היא להדמינ ולהעקוב אחר התקדמות התכנות מחדש (reprogramming) של תאים סומטיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים, או iPSC. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום ה-iPSC, כגון כיצד קינטיקת התכנות מחדש ויעילות התכנות מחדש משתנות בהתאם לרקמות הסומטיות שנעשה בהן שימוש, לטכנולוגיות התכנות מחדש שיושמו, ולשילובי המטריצות והמדיומים ששימשו אותן. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שהיא משתמשת בסממנים על פני השטח של התא כדי לבחון את המעברים של תאים סומטיים ל-iPSCs, כך שניתן להשתמש בטכנולוגיה זו כדי לנטר בזמן אמת את אירועי התכנות מחדש.ביום השביעי לאחר הטרנסדוקציה, שטפו את הפיברובלסטים באמצעות 2 milliliters של DPBS לכל באר והוסיפו 0.5 milliliters של 0.5% EDTA בטמפרטורה של 37 degree celsius לכל באר, להדגרה של שלוש עד חמש דקות ב-37 degrees celsius. כאשר התאים יעגלו, עצרו את התגובה באמצעות 2 milliliters של מצע גידול לפיברובלסטים בטמפרטורה של 37 degree celsius לכל באר, ופירטרו בעדינות את המצע על פני תחתית כל באר כדי לשחרר את התאים. העבירו את הפיברובלסטים מכל באר לשפופרות קוניות נפרדות של 15 milliliter ואספו אותם באמצעות סנטריפוגציה.סספנדו מחדש את המשקעים בשני מיליליטרים של מצע פיברובלסטים טרי בטמפרטורה של 37 °C וספרו את התאים מכל תנאי תרבית. לאחר מכן, זרעו 1 × 10⁵ תאים לתוך בארות מותנות ללא תאי מאכיל (feeder-independent) שהוכנו מראש בפלטת תרבית רקמה בעלת שש בארות, והדגרירו את התאים שעברו טרנסדוקציה באינקובטור לתרבית תאים למשך הלילה. למחרת, החליפו את המצע בכל בארה במצע המתאים ליישום התאי.לאחר מכן, מקמו את הפלטה במכשיר ההדמיה והגדירו בתוכנה ללכידה רציפה של תמונות ניגודיות פאזה (phase contrast) ותמונות פלואורסצנציה של כל הבאר עבור כל בארה בכל שש עד שמונה שעות במשך 14 הימים הבאים. בסיום ניסוי התכנות מחדש, שטפו את הבארים פעם אחת עם 2 mL של מצע DMEM/F12 בטמפרטורה של 37 °C. השליכו את השטיפה וסמנו את התאים באמצעות 1 mL לבער של הנוגדנים הראשוניים המתאימים במצע DMEM/F12 טרי למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור.בסיום האינקובציה, שטפו את התאים פעמיים עם מצע DMEM/F12 בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, השליכו את תמיסת השטיפה וסמנו את התאים באמצעות 1 mL של הנוגדנים המשניים המתאימים במצע DMEM/F12 בטמפרטורה של 37 °C, למשך 30 דקות ב-37 °C. בסיום האינקובציה, שטפו את התאים פעמיים נוספות עם מצע DMEM/F12.לאחר מכן, החליפו את תמיסת השטיפה בכל באר בשני מיליליטר של מצע DMEM/F12 רענן בטמפרטורה של 37 degree celsius. הניחו את הצלחת במדמייר ופתחו את תוכנת ההדמיה. כדי להגדיר סריקות בתוכנת מערכת ההדמיה, בחרו תחילה את מיקום המגש שבו תעשה שימוש ובחרו את סוג הצלחת לסריקה.לאחר מכן, בחרו ב-Whole Well Imaging, בתבנית לסריקת הבארים הרצויות, ובערוצים הפלואורסצנטיים המתאימים לזיהוי בזמן אמת של סממני השטח הרלוונטיים. לאחר מכן, תייגו את הניסוי לסריקה והגדירו את נקודות הזמן ואת המרווחים עבור הדגימות שייסרקו בכל יום. כדי לנתח קבוצה של ניסויים שנסרקו, בחרו את הניסוי הרלוונטי ובחרו ב-Launch New Analysis Job.לאחר מכן, בחרו את הגדרת העיבוד המתאימה לסוג האנליזה בהתאם לערוצים ששימשו להדמיה, לדוגמה, PSC Phase Colony Count. תנו שם למשימת האנליזה. בחרו את טווח הזמנים לאנליזה ואת הבארות שיש לנתח.לאחר מכן, הפעל את תהליך הניתוח. כדי למדוד את נקודות הזמן הרצויות של התכנות מחדש מבארות בודדות, שטוף את הבאר הרלוונטית פעם אחת עם שני מיליליטר של DPBS. לאחר מכן, החלף את נוזל השטיפה במיליליטר אחד של תמיסת 05%trypsin-EDTA שחוממה מראש ל-37 degree celsius.לאחר חמש דקות ב-37 degree celsius, שטפו את ה-trypsin כנגד תחתית הבאר כדי להפריד את התאים לתליה של תאים בודדים והעבירו את התאים למבחנה קונית של 15 milliliter. בעזרת 3 milliliters של DPBS, שטפו את שארית התאים מהבאר והעבירו אותם למבחנה של 15 milliliter. הוסיפו 10 milliliters נוספים של DPBS לתאים והשקיעו אותם באמצעות סרכזפוגה.שחזר את המשקע ב-1 ml של מצע DMEM/F12 לצורך ספירה. לאחר מכן, דלל את תגלוש התאים לריכוז של עשירית מ-6x10⁶ תאים למילליטר, וחלוק ל-1 ml של תאים לכל מבחנה עבור מספר הדגימות המתאים. לאחר מכן, סמן את התאים עם הנוגדנים הראשוניים הרלוונטיים ב-1 ml של מצע DMEM/F12 למשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר תוך ערבוב.בסיום הדגירה, שטפו את התאים פעמיים במצע DMEM/F12 בטמפרטורה של 37 °C. השביו את המשקעים (pellets) ב-1 mL של DPBS והעבירו את הדגימות למבחנות FACS נפרדות. ביצעו רכישת פרופילים של ציטומטריית זרימה עבור הפלטות שעברו תכנות מחדש.לאחר מכן, העבירו את קבצי ה-FCS למחשב וייבאו את הקבצים לתוכנת הניתוח המתאימה. פתחו את קובץ הבקרה הראשון בתרשים פיזור של forward by side scatter והגדירו את ציר ה-y לסולם לוגריתמי. לאחר מכן, צרו שער פוליגוני (polygonal gate) סביב אוכלוסיית התאים החיים.בשלב הבא, צור תרשים פיזור של שטח פיזור צדי (side scatter area) מול גובה פיזור (scatter height) עבור התאים החיים והגדר שער מלבני (rectangular gate) כדי להסיר דבליטים (doublets). לאחר מכן, השתמש בשערים אלו כדי לנתח את קובצי דגימות הניסוי תחת הערוצים הפלואורסצנטיים המתאימים, במטרה לזהות את האוכלוסיות הרצויות ברביעים המתאימים להן. תכנות מחדש (Reprogramming) של פיברובלסטים מסוג BJ באמצעות וירוסי תכנות מחדש מסוג Sendai מייצר תאי SSEA4+CD44- בקצב שונה מאשר תכנות מחדש של פיברובלסטים מסוג DF1, מה שמוכיח כי השוואה מוקדמת של אחוז התאים דמויי תאי גזע פלוריפוטנטיים SSEA4+CD44- יכולה לשמש למעקב אחר התקדמות התכנות מחדש.במסלול זמן של ציטומטריה של זרימה (flow cytometry), פיברובלסטים CD24-CD44+ ושליליים ל-EpCAM CD44+ יוצרים אוכלוסיות כפולות-שליליות שמעבירות בהמשך מעבר לתאים דמויי תאי גזע פלוריפוטנטיים CD24+CD44- וחיוביים ל-EpCAM CD44- בהתאמה, מה שמתאר עוד יותר את התקדמות התכנות מחדש. הדמיה בזמן אמת של תרביות התכנות מחדש לאחר זריעה מחדש מראה היווצרות הדרגתית של מושבות התואמת לעלייה לוגריתמית בהיתוך (confluence) שלהן, ומדגימה את הביטוי הסופי של סממנים פלוריפוטנטיים חיוביים וסממנים של פיברובלסטים שליליים בסיום התכנות מחדש. יתרה מכך, שימוש בגן דותק (reporter gene) מאפשר למדוד את ההיתוך תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, כאשר נצפתה עלייה הדרגתית יותר בהיתוך של GFP בהשוואה להיתוך הכללי.ואכן, בניסוי מייצג זה, רמת ההיתוך (confluence) של ה-GFP ביום 19 הייתה פחות ממחצית מההיתוך הכולל המתאים לתכנות מחדש מלא. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן יהיה להשתמש בה כדי להבהיר מידע על אירועי תכנות מחדש ולעקוב אחר הקינטיקה של תכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי לבחון רקמות שונות של תאי סומה התחלתיים, טכנולוגיות תכנות מחדש שונות, ושילובים שונים של מצעים ומדיומים כדי להבהיר אירועי תכנות מחדש.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בניטור בזמן אמת ובביטוי של סממני שטח תאי, כדי להיות מסוגלים לעקוב אחר תהליך התכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים לתאי iPSCs.

kinetic-measurement-real-time-visualization-somatic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

FIM הוא מערכת חדשנית, הדמיה חסכונית שנועדה לעקוב אחר אובייקטים נעים קטנים כגון C. elegans, planaria או זחלים תסיסנית. תכנית FIMTrack הנלווית נועדה לספק ניתוח נתונים מהיר ויעיל. יחד, כלים אלה מאפשרים ניתוח תפוקה גבוהה של תכונות התנהגותיות.

FIM הדמיה וFIMtrack: שני כלים חדשים המאפשר תפוקה גבוהה וניתוח תנועה חסכוני

גירוי מגנטי טרנס-גולגולתי, אלקטרומיוגרפיה ולכידת תנועה תלת מימדית הן טכניקות לא פולשניות נפוצות לחקירת תפקוד עצבי-שרירי בבני אדם. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול הדוגם באופן סינכרוני נתונים שנוצרו על ידי כל שלושת הכלים הללו יחד עם התוספת הייחודית של הצגת גירוי מציאות מדומה ומשוב.

הגדרה רב-תכליתית ללימוד אדם בקרת מנוע באמצעות גירוי מגנטי Transcranial, Electromyography, לכידת תנועה, ומציאות וירטואלית

פרוטוקול חזקים כדי לפקח אוכלוסיות עצבית על ידי זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה ואחריו-מבוססות תוכנה שלאחר עיבוד מתואר. שיטה זו מייצגת כלי רב עוצמה לזיהוי אירועים הביולוגי בקרב אוכלוסיה הנבחר במהלך הניסויים הדמיה בשידור חי.

חיים הדמיה ואחריו תא בודד מעקב צג Cell Biology, ההתקדמות שושלת היוחסין של אוכלוסיות עצבית מרובים

אנו מציגים רומן בשילוב התנהגותית, דימות מוחי פרוטוקול המעסיקים הקרנת וידאו בזמן אמת לצורך אפיון את ה"מפה עצביים הקשורים במראה טיפול בתוך הסביבה סורק תהודה מגנטית ברגל קטועי איברים בנבדקים עם כאב האיבר פנטום.

הקרנת וידאו בזמן אמת ב- MRI פלואורסנציה ה"מפה עצביים הקשורים בטיפול מראה עבור כאב האיבר פנטום

הליך זה מוצג להמחיש החלבון קינאז פעילות בעכברים קבועים ומתנהגים. כתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז, tAKARα, מתבטאת בנוירונים בקליפת הגולגולת והפכה לנגישה להדמיה דרך חלון גולגולתי. מיקרוסקופ הדמיה של שני פוטון באורך החיים משמש כדי להמחיש פעילויות PKA ב vivo במהלך תנועה נאכף.

ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

אנו מציגים פרוטוקולים ושיטות של ניתוחים לבניית ממשקים אדפטיביים משותפים הזורמים, מתפרצים, מנתחים ומשנים אותות גוף ולב אנושיים בלולאה קרובה. התקנה זו ממשקים אותות נגזר ממערכות העצבים ההיקפיות והמרכזיות של האדם עם כניסות חושיות חיצוניות כדי לסייע במעקב אחר שינוי ביופיזי.

בקרת Proxy בזמן אמת של אותות היקפיים עם פרמטרים מחדש באמצעות ממשק לולאה קרובה

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור מערכים של מיקרוטיסות שרירי השלד האנושיים בתלת-ממד ופולשניות מינימלית במורד הזרם בתקיפות תפקודיות, כולל כוח התכווצות ניתוחי טיפול בסידן.

הערכת מדדים תפקודיים של בריאות שריר השלד במיקרוטיסוסות שריר השלד האנושי

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

כאן, מתוארת שיטה מבוססת לביצוע מדידות התכווצות וסידן בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם באמצעות פלטפורמה מבוססת אופטיקה. פלטפורמה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את השפעת המוטציות ואת התגובה לגירויים שונים באופן מהיר וניתן לשחזור.

מדידות בזמן אמת של פרמטרים של סידן והתכווצות בקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע המושרים על ידי בני אדם

כאן אנו מתארים הליך המבוסס על שימוש בחלקיקים לנטי-ויראלים לשינוי גנטי ארוך טווח של תאי גזע עצביים ו/או תאי אפנדימליים סמוכים להם בנישה הנוירוגנית הגחנית-תת-חדרית הבוגרת המאפשרת ניתוח נפרד של השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים, תלויות נישה על תאי גזע עצביים.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

למד מדידת קינטי בזמן אמת של תכנות מחדש סומטיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר מעברי תאים וסמני פלוריפוטנטיות בזמן אמת.

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

גלה סרטונים נוספים