שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

היי, אני ססיל. אני עובדת בארגון הלהט"ב במרסיי. הפרוטוקול שאנו הולכים לתאר בסרטון זה הוא שיטה פשוטה לבידוד פוליזומים ומונוזומים מרקמות צמחיות שונות על מנת לזהות mRNA המתורגמים באופן פעיל ולחקור את ויסות התרגום.

כדוגמה, אנו הולכים להראות לכם את בידוד הפוליזומים משתילי Arabidopsis thaliana בני שישה ימים, בידוד לאחר מכן של RNA וניתוח התוצאות. זורעים את הזרעים בצלחת ומשאירים אותם יומיים בארבע מעלות. לאחר מכן גדלו את הצמחים במשך שישה ימים.

קצרו את השתיל וטוחנים אותם בחנקן נוזלי. משקל 300 מיליגרם אבקת צמחים והוסף 2.4 מיליליטר של מאגר פוליזום. צנטריפוגה לאיסוף שברי צמחים והעמסת הסופרנטנט על גבי שיפוע סוכרוז.

שיפוע אולטרה-צנטריפוגה לאחר מכן אסוף אותו מלמטה למעלה עם קריאה רציפה של ה-OD. משוך את השבר לפוליזום, מונוזום ושבר סופרנטנט וזרז RNA בן לילה. אולטרה צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה וחלצו RNA לניתוח שלאחר מכן. כמה ימים לפני ביצוע פרופיל פוליזום, הכינו את שיפוע הסוכרוז.

הכינו תמיסת סוכרוז של 50, 35 ו -20% ושמרו אותם על ארבע מעלות. יוצקים את שכבת הסוכרוז של 50%. מקפיאים אותו במקפיא מינוס 40.

לאחר שש שעות מוסיפים את שכבת ה-35% ומקפיאים במקפיא מינוס 40 למשך הלילה. יוצקים את 20% השכבה הראשונה ומקפיאים אותה. ביום הניסוי, הוציאו את המספר הדרוש של שיפועים מהמקפיא.

מוסיפים את שכבת הסוכרוז האחרונה של 20% ונותנים לשיפועים להפשיר בחדר קר. הכן את הדגימה שאספנו טרי צמח. כאן, אנו משתמשים בשתילים בני שישה ימים של Arabidopsis thaliana.

קצרו את הצמחים הקפואים בחנקן נוזלי וטחנו אותם היטב. משקל 300 מיליגרם אבקת צמחים. הוסף במהירות 2.4 מיליליטר של מאגר פוליזום טרי והומוגניזציה.

הכניסו את התמיסה לשני צינורות של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה התמצית הציטוזולית. פיפטה הסופרנטנט.

היזהר להימנע משבר צמח. הם יקלקלו את הפרופיל בשלב הבא. טען את הסופרנטנט על שיפוע הסוכרוז מבלי לשבש את השיפוע.

הכניסו את השיפוע לדלי רוטור SW 41. צנטריפוגה. כדי לדמיין את פרופיל הפוליזום ולאסוף את השבר, אנו משתמשים במערכת פשוטה העשויה מצינור נימי שצולל לתוך השיפוע. זה מקושר לקובט UV.

הוא מחובר לעצמו למשאבה פריסטלטית. ספקטרופוטומטר UV רושם ברציפות את ה-OD כאשר השיפוע מתקדם דרך הקובטה. אספן השברים מאפשר איסוף של שני שברים של מיליליטר.

נקו את הקובט והניחו אותו בספקטרופוטומטר. הסר את השיפוע מהדלי מבלי להפריע לו. כלורופיל צריך להיות מרוכז בחלק העליון של השיפוע.

צלול את צינורות הנימים לתחתית השיפוע. הפעל את המשאבה הפריסטלטית. השיפוע נאסף מלמטה למעלה ו-OD נקרא ברציפות.

נאספים שני שברים של מיליליטר. הנה הצורה של פרופיל קלאסי. משקעי ה-RNA מבוצעים באמצעות גואנידיניום הידרוכלוריד ואיזופרופנול.

ראשית, שפכו נפח אחד של גואנידיניום הידרוכלוריד בצינור של 50 מיליליטר ולאחר מכן הוסיפו את השבר. לאחר מכן הוסף 1.5 נפח איזופרופנול ו-50 מיקרוגרם שליח שווה. זרז את ה-RNA במהלך הלילה במינוס 20 מעלות.

העבירו את השברים לצינורות אולטרה-צנטריפוגה של 40 מיליליטר ואזנו את הצינור עם איזופרופנול. צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט וייבש את הגלולה באוויר. השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר TE חם.

מיצוי נוסף של ה-RNA על ידי ביצוע מיצוי פנול כלורופורם קלאסי. פרופיל מייצג של פוליזומים המופקים משתיל בן שישה ימים מוצג כאן. השיא העיקרי תואם את המונוזום, ה-mRNA הקשורים לריבוזום יחיד.

החלק הראשון של הפרופיל תואם את השברים הפוליזומליים, כלומר ה-mRNA הקשור לריבוזומים רבים. כל שיא תואם את הקשר של הריבוזום החדש ל-mRNA. החלק האחרון של הפרופיל מתאים למה שנקרא שבר סופרנטנט המכיל את תת-היחידות הריבוזומליות החופשיות ואת ה-RNA.

כמות גדולה של תת-יחידה 60S יוצרת כתף ליד הפסגה המונוזומית. כדי להעריך את שלמותם, ניתן להריץ את ה-RNA המופקים מהשברים על ג'ל ארגוז קלאסי לפני השימוש בהם לניסויים נוספים. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבודד פוליזומים משתילי Arabidopsis thaliana, אך גם משושנות צעירות ומבוגרות כמו גם מעלי Nicotiana benthamiana, עגבניות ואורז, כך שהוא אמור לעבוד עם מגוון רחב של צמחים ורקמות.

ה-RNA המטוהר תואם לניתוח מיקרו-מערך וכן לזיהוי RNA קטנים הקשורים לשברים פוליזומליים.