Name: שיטה קלה הצמח Polysome Profiling (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: למדו שיטה פשוטה לבידוד פוליסומים ומונוסומים מרקמות צמחים באמצעות Arabidopsis thaliana. שיטה זו מאפשרת לזהות mRNA בתרגום פעיל ולחקור רגולציה תרגומית בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למחקר הלאומית הצרפתית (ANR-14-CE02-0010). אנו מודים ד&quot;ר בנימין שדה וד&quot;ר אלודי Lanet לקריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים למר מישל תרז על עזרתו עם עריכת וידאו.

1. הכנה של 20 עד 50% (w / v) מעברי צבע סוכרוז הערה: הדרגתיים עשויים 4 שכבות של סוכרוז (50%, 35% ו -2 שכבות של 20%) בצינור ultracentrifuge 13.2 מ&quot;ל. מניסיוננו, מזיגת סוכרוז 20% בשתי שכבות נפרדות משפרת באופן משמעותי את איכות הכנות polysome. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות המניות. ודא כי כל הפתרונות הם RNAse ו DNAse בחינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח 10X: 400 mM Tris-HCl pH 8.4, 200 מ&quot;מ KCl ו -100 מ&quot;מ MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 פתרון M סוכרוז: עבור 200 מ&quot;ל, לפזר 137 גרם של סוכרוז פתרון 1X מלח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון סוכרוז בסולט פתרון, כמתואר בטבלה 1, להכין הדרגתיים. הכרכים הנתונים הם שש הדרגתיים. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריכוז סוכרוז סופי </td><td> סוכרוז 2M (מ&quot;ל) </td><td> פתרון מלח 1X (מ&quot;ל) </td><td> כרך סופי. (מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> 50% </td><td> 8.8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 35% </td><td> 12.9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 7.4 </td><td> 17.6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. דילולים של תמיסת סוכרוז להכין שש הדרגתיים. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים שכבות לפי טבלה 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שכבת סוכרוז </td><td> 50% </td><td> 35% </td><td> 20% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> Vol. (מ&quot;ל) </td><td> 1.85 </td><td> 3.65 </td><td> 3.65 </td><td> 1.35 </td></tr></tbody></table> נפח טבלה 2. של תמיסת סוכרוז לכל שכבה. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שמזג כל שכבה, לשמור על הצינורות בתוך C -40 ° או מקפיאה -80 מעלות צלזיוס עד הקפאה מוחלטת לפני הוספת ההשכבה סוכרוז הבאה. מקפיא מושגת בדרך כלל לאחר 2 שעות ב -40 מעלות צלזיוס, אבל מחכה כ -6 שעות לפני לשפוך את השכבה הבאה מומלץ. שכבת 20% האחרונה אפשר להקפיא או הוסיפה טרי ביום הניסוי. הערה: הקפאת כל שכבה לפני הוספת הבאה מונעת מכל ערבוב או הפרעה של השכבות. הדרגתיים יכולים להישמר C -40 ° או -80 ° C במקפיא במשך שישה חודשים לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זה כבר לא נעשה, להוסיף את שכבת 20% האחרונים ההדרגתיים ביום הניסוי. לאחר מכן, תן ההדרגתי להפשיר בחדר קר או מקרר. </li></ol> 2. הכנת תמציות Cytosolic הערה: אנו recommבסופו של שימוש בשני מילויים לדגימה ביולוגית. 300 מ&quot;ג הוא הכמות האופטימלית של חומר צמחי להכין שני מילויים כשעובדים עם 6 ימים שתילי thaliana ארבידופסיס ישנים. כשעובד עם פחות רקמות translationally פעילות, כמות חומר צמחי ניתן להגדיל עד 600 מ&quot;ג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתילים ישנים קציר ששת ימים גדלו על ½ Murashige ו Skoog 8 בינוניים בתוספת 1% סוכרוז או מדיה מקבילה ידי מהיר הקפאה בחנקן נוזלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומר צמחי טוחנים במכתש ועלי precooled עם חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 300 מ&quot;ג של חומר אבקת בצלחת במשקל precooled. בצע פעולה זו במהירות כדי למנוע הפשרת המדגם. הערה: שמור על דגימות קפואות לתקופה שלא תעלה על שבוע אחד במקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.4 מ&quot;ל של חיץ polysome precooled (4X תמיסת מלח, 5.26 מ&quot;מ EGTA, 0.5% (v / v) פולי Octylphenoxy (ethyleneoxy אתנול), מסועף, 50 μg.ml -1 cycloheximide, 50 μg.ml 1chloramphenicol) ו homogenize ידי ערבוב עם קצה פיפטה. העבר לשתי צינורות 1.5 מ&quot;ל. לעבוד במהירות כדי למנוע את הדגימות מן ההתחממות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C ב microcentrifuge כדי גלולה פסולת. הערה: כדי למנוע השפלה RNA, תמיד לשמור על דגימות ב 4 ° C, השתמש פתרונות חינם RNase / DNase ולעבוד בתנאים חינם RNase / DNase. הפרין ניתן להוסיף למאגר polysome, לריכוז סופי של 300 μg.ml -1, כדי לשפר את ההגנה RNA. עם זאת, מאז הפרין יכול להפריע ניתוח במורד זרם, זה יהיה חייב להיות מוסר במהלך שלב משקעי RNA על ידי ביצוע משקע ליתיום כלוריד במקום משקעי אתנול (הערה השווה 4.7). </li></ol> 3. פרופיל Polysome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות פיפטה את supernatant מבלי להפריע גלולה. אם שברי צמח כבר pipetted, חזור על שלב 2.5. טען את supernatant על גבי שיפוע ידי בעדינות pipetting על דפנות הצינור בזרם קבוע. השתמש שיפוע אחד לכל צינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים precooled דליים צנטריפוגות ב 175,000 XG במשך שעה 2. 45 דקות ב 4 ° C, בתוך ultracentrifuge (למשל 32,000 סל&quot;ד כשמשתמשים הרוטור SW41). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מערכת איסוף שיפוע כמתואר באיור 1. קובט UV יש pathlength 1 מ&quot;מ. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> איור 1. מערכת איסוף Gradient. קובט UV מחובר על ידי צינורות פוליוויניל כלוריד צינור נימי זכוכית יורד לתחתית השיפוע. שיפוע התקדמות דרך בזכות מערכת משאבה peristaltic. OD 260 קורא ברציפות ו -2 מ&quot;ל שברים נאספים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של</a>נתון זה. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את אספן חלק כדי RT, ולהגדיר את הקרוסלה במהירות שתאפשר גביית 2 מ&quot;ל שברים. השתמש צינורות אוסף מראש מקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את השברים מלמטה למעלה באמצעות צינור נימי זכוכית המחוברים באמצעות צינורות פוליוויניל כלוריד למערכת אוסף השיפוע. השתמש סרט פרפין פלסטיק כדי לאבטח את החיבור בין צינורות פוליוויניל כלוריד ואת צינור נימי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הספיגה ב 260 ננומטר מלמטה העליון של השיפוע. כאשר השיפוע כולו נאסף, ומקום הצינורות האוספים על קרח לפני מיצוי RNA. </li></ol> 4. RNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פינת השברים שנאספו משני הדרגתיים, ב 50 מ&quot;ל כתרי צינורות צנטריפוגה, כדלקמן: Polysomes: שברים 1 עד 3 (12 מ&quot;ל) Monosomes: חלק 4 (4 מ&quot;ל) Supernatant: שברים 5 ו -6 (8 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל חלק, להוסיף 1 כרך. hydrochloride guanidine 8M,50 מיקרוגרם מובילים אקריליק ו -1.5 vol. isopropanol. הערה: מנשא אקריליק הוא acrylamide ליניארי, משמש coprecipitant כדי לשפר את ההתאוששות של חומצות גרעין במהלך משקעי אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי היפוך הצינורות המשקע O / N ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 175,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C, בתוך ultracentrifuge (32,000 סל&quot;ד ב הרוטור SW32). אם השלב משקעים מתבצע בתוך שפופרת אשר אינה עולה בקנה אחד עם ultracentrifugation, והעברת צינור מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו לפזר את גלולה ב 200 חיץ TE μl RNAse ללא (10 mM Tris-HCl pH 7.5 - 1 מ&quot;מ EDTA). מעביר צינור 1.5 מיליליטר טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ RNA על ידי הוספת 1 כרך. מים פנול רווי (pH 6.6) ו 1 כרך. כלורופורם: אלכוהול isoamyl (24: 1). מערבבים נמרצות. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 20 דקות ב 4 °. מעביר את השלב המימי לצינור 1.5 מיליליטר חדש. הערה: פנול חומצה (pH 4.5) ניתן להשתמש כדי למזער זיהום הדנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">המשקע RNA על ידי הוספת 1/10 vol. 3 נתרן אצטט M ו- 3 vol. 100% אתנול. אפשר משקעים ב -80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות או O / N ב -20 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. הערה: אם אתה משתמש הפרין למאגר polysome (הערה השוו 2.5), לבצע ליתיום כלוריד (LiCl) ממטרים במקום משקעים אתנול כדי להסיר כל שמץ של הפרין כראוי שעלולה להפריע ניתוח במורד הזרם 9. לאחר החילוץ, להוסיף LiCl לריכוז סופי של 2.5 מ &#39;אפשר משקעים במשך 30 דקות ב -20 ° C או O / N ב 4 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם אתנול 500 μl 75%. האוויר היבש גלולה ו להתמוסס 30 μl חיץ TE. הערכת איכות RNA על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל agarose 1.2% חינם RNAse (100V, 15 דקות) או על ידי שיטות אלקטרופורזה נימי. </li></ol> ניתוח 5. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים גולמיים ייצא תוכנת ניתוח גרפית ונתונים. הערה: כפי שניתן לראות בתרשים 2A ו- B, את הפרופילים גלם לתת מידע איכותי: מספר פסגות polysome כי ניתן לראות, את גובה שיא monosome, ואת הנוכחות של הכתף המתאים יחידות משנה הריבוזום בחינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיזוג פרופילים על מנת לאפשר השוואה של פרופילים בין דגימות. השתמש בכלי קורא מסך כדי לקבוע את ערך X של שיא monosome עבור כל דגימה וליישר את פסגות monosome ידי הסרת נקודות נתונים נוספות בתחילת העקומות. זהה את הנקודה הנמוכה ביותר של העקומה ולקבוע ערך Y שלה (שימוש באפשרות קורא המסך). הגדר את הערך Y הנקודה הנמוכה ביותר ל -0 באמצעות הפונקציה &quot;סט עמודות ערך&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את יחס polysomes / monosomes ידי שילוב השטח מתחת לעקומה מפרופילי גלם (איור 3 ג). השתמש בכלי בורר נתונים להגדרת הגבול של האזור כדי להיות משולב. ואז להשתמש בפונקציה לשלב (ניתוח-מתמטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמלהעקומות אל פסגת monosome ידי חלוקת כל נקודות הנתונים של עקומה ידי ערך Y של הפסגה של פסגת monosome (נקבעו באמצעות כלי קורא המסך). בחר את העמודה, ולאחר מכן תחת-מתמטיקה ניתוח, בחר לנרמל ולבחור את &quot;מחולק לסכום מסוים&quot; שיטות. שלב זה מאפשר השוואה של הרמה היחסית של polysomes (איור 3D). </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> איור 2. פרופילים polysome נציג. ארבידופסיס thaliana wild-type (wt, אקוטיפ Col-0) ושתילים מוטציה גדלו במשך שישה ימים על ½ Murashige ובינוניים Skoog תחת photoperiods יום ארוך (16 שעות אור, 8 שעות חושך). ת: פרופילי polysome גלם מן השתילים WT. B: פרופילי polysome גלם מן שתילי מוטציה. C: קביעת אחוז polysomes ו monosomes ידי שילוב של השטח מתחת לעקומה D: Profi Polysomeles מנורמל שיא monosome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol><li>Nelson, C. J., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+in+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Protein turnover in plant biology.</a> Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).</li>
<li>Warner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economics+of+ribosome+biosynthesis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The economics of ribosome biosynthesis in yeast.</a> Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).</li>
<li>Amthor, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+McCree-de+Wit-Penning+de+Vries-Thornley+Respiration+Paradigms%3A+30+Years+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later.</a> Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).</li>
<li>Preiss, T., W Hentze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starting+the+protein+synthesis+machine%3A+eukaryotic+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).</li>
<li>Baerenfaller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteomics+reveals+Arabidopsis+thaliana+gene+models+and+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics.</a> Science. 320 (5878), 938-941 (2008).</li>
<li>Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopurification+of+Polyribosomal+Complexes+of+Arabidopsis+for+Global+Analysis+of+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiol%22%5BJournal%5D)">Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression.</a> Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Arabidopsis+protocols%22">Arabidopsis protocols</a>. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).</li>
<li>Piques, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+and+transcript+copy+numbers%2C+polysome+occupancy+and+enzyme+dynamics+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+syst+biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis.</a> Mol syst biol. 5 (314), 314(2009).</li>
<li>Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+Profiling+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome Profiling Analysis.</a> bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).</li>
<li>Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Sormani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+cadmium+intoxication+in+Arabidopsis+thaliana+impacts+translation+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels.</a> Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).</li>
<li>Lanet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+translational+repression+by+Arabidopsis+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs.</a> Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).</li>
<li>Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rice+cis-Natural+Antisense+RNA+Acts+as+a+Translational+Enhancer+for+Its+Cognate+mRNA+and+Contributes+to+Phosphate+Homeostasis+and+Plant+Fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness.</a> Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIngolia%2C+NT+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).</li>
<li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

הפרוטוקול שאנו מציגים כאן הוא שיטה קלה וזולה ליצירת פרופילי פוליזומים ובידוד mRNAs הקשורים לפוליזומים, ריבוזומים בודדים או ללא ריבוזומים. מגוון רחב של שיטות שונות לפיצול פוליזומים מתואר בספרות. השיטה שתיארנו כאן עברה אופטימיזציה כדי לשמור רק על התרכובות הדרושות והותאמה לחומר צמחי. בפרט, הפחתנו את כמות חומר הניקוי11 והוספנו כלורמפניקול למאגר כדי לקבע את הריבוזומים הכלורופלסטיים ל-mRNA (כפי שעושה ציקלוהקסימיד עבור הריבוזומים הציטוזוליים)12 . צמצמנו גם את זמן האולטרה-צנטריפוגה הכולל7.
<p...

סינתזת חלבון היא תהליך חיוני ויקר במרץ בכל התאים 1. קודם כל, התאים חייבים להשקיע אנרגיה בייצור של מכונות תרגום, הריבוזומים. לדוגמא תא שמרים שעדיין מתחלק מייצר ככל 2,000 ריבוזומים לדקה. כזה הייצור דורש עד 60% של פעילות תעתיק הכולל עד 90% מהפעילות שחבור הכולל של התא 2. בנוסף, אנרגיה נדרשת לסינתזה של חומצות אמינו, aminoacyl-tRNA ו קשרים פפטידיים. בצמחים, הוספת חומצה אמינית אחת על עלויות שרשרת הפפטיד מן 4.5 ל 5.9 מולקולות של ATP 3. לכן, אין זה מפתיע כי התרגום של mRNA לחלבון הוא אתר עיקרי של רגולציה, במיוחד כאשר מדובר בהתמודדות עם תנאי סביבה משתנה. צעד החניכה של תרגום, כלומר את שיוכה של mRNA עם הריבוזום, הוא המטרה העיקרית של ההסדרהתרגום 4. כתוצאה מכך של הסדרת התרגום וכן צעדים רגולטוריים שלאחר תעתיק אחרים, רק 40% של וריאציות בריכוז החלבון יכול להיות מוסבר על ידי mRNA שפע 5,6. לכן, המחקר של mRNA הכולל נותן מידע עני יחסית על שפע חלבון. מצד שני, העמותה של mRNA עם ריבוזומים נותן תובנות טובות יותר שפע החלבון על ידי מתן גישה mRNAs המעורבים התרגום. mRNAs המתורגם באופן פעיל משויך כמה ריבוזומים במבנים שנקראו polysomes. לעומת זאת, mRNAs מתורגם גרוע ישויך רק אחד הריבוזום (monosome). כתוצאה מכך, מעמדם translational של mRNA יכול להיות מוערך על ידי מעקב אחר הקשר שלה עם ריבוזומים 7. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של polysomes מן שתילי thaliana ארבידופסיס בת שישה ימים, הבידוד הבא של RNA, ואת ניתוח התוצאות. Polysomes ו monosomes מופרדים באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז. הדרגתיים נאספים לשישה שברים. חלק מן השברים הם אספו להשיג שלושה שברים מופרדים היטב: polysomes, monosomes ואת שבריר אור (הנקרא להלן supernatant), אשר מכיל את יחידות משנה ריבוזומלי 60S ו 40S בחינם mRNAs שאינם משויכים עם ריבוזומים. ניתן לאמוד פעילות תרגום עולמית על ידי יצירת יחס polysome / monosome, אשר נקבע על ידי שילוב של השטח מתחת לעקומה, ועל ידי השוואת פרופילי polysomes. mRNAs וחלבונים אז המחולצים שברים שונים ומשמש לניתוח על ידי RT-PCR, qRT-PCR, כתם הצפון, microarray, כתם או פרוטאומיקה המערבי. פרוטוקול זה יאומת לצמחים ורקמות אחרים. הציוד נדרש לבצע פרוטוקול זה מצוי לרוב ברוב המעבדות: אין צורך לעושה שיפוע. הקפאת כל שכבה לפני הוספת הבאה למנועs מכל תערובת או הפרעה של השכבות. לא דוקר צינור משמש לאיסוף שיפוע אשר יכול להיות מושגת על ידי טבילה של צינור נימי זכוכית של ההדרגה. לכן, צינורות ultracentrifuge יקר להישאר ניזוק וניתן להשתמש בהן שוב ושוב פעמים רבות. ביחד, זה הופך את הפרוטוקול הנוכחי שיטה קלה וזולה עבור פרופיל polysome.

<table><tbody><tr><td>צינור אולטרה-צנטריפוגה, דופן דקה, פוליאלומר - 13.2 מ"ל</td> צינור <td></td> אולטרה-צנטריפוגה <td>בקמן קולטר</td> 331372<td></td></tr><tr><td>, דופן דקה, פוליאלומר - 38.5 מ"ל</td> צינור נימי זכוכית <td>של בקמן קולטר</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>דראמונד סיינטיפיק</td><td>1-000-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה&nbsp;</td>סדרת <td>Beckman Coulter</td><td>Optima</td><td></td></tr><tr><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליוויניל כלוריד Tygon R3607&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>070534-22</td><td>צינורות פוליוויניל כלוריד, 2.29 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>אספן שברים דגם 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>קובטה UV</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>קוורץ קובטה זרימה דרך</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר UV</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>קרא כל 0.0125 שניות</td></tr><tr><td>כל הכימיקלים</td><td>כל</td><td></td><td>שימוש רק ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>Murashige ו-Skoog תערובת מלח בסיסי (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא Rnase</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנות פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10083251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אוקטילפנוקסי פולי (אתילנוקסי) אתנול, מסועף (Nonidet P40)</td> <td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד ליניארי (נשא אקריל)</td> <td>ThermoFischer מדעי</td><td>AM9520</td><td>נושא משקעים RNA</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח</td> <td>OriginPro 8</td><td>OriginLab</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה קלה הצמח polysome profiling

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

תרגום mRNA לחלבון הוא תהליך ביולוגי בסיסי ומווסת מאוד. פרופיל פוליזום נחשב לתקן זהב לניתוח רגולציה תרגומית. השיטה המתוארת כאן היא דרך קלה וחסכונית להפרדת פוליזומים מרקמות צמחים שונות. שיפוע סוכרוז מיוצר ללא צורך ביצרנית שיפוע על ידי הקפאה רציפה של כל שכבה. לאחר מכן מכינים תמציות ציטוזוליות במאגר המכיל ציקלוהקסימיד וכלורמפניקול כדי לשתק את הריבוזומים הציטוזוליים והכלורופלסטיים ל-mRNA ונטענים על שיפוע הסוכרוז. לאחר הצנטריפוגה, שישה שברים נאספים ישירות מלמטה לראש השיפוע, מבלי לנקב את צינור האולטרה-צנטריפוגה. במהלך האיסוף, הספיגה ב-260 ננומטר נקראת באופן רציף כדי ליצור פרופיל פוליזום הנותן תמונת מצב של פעילות התרגום העולמית. לאחר מכן נאספים שברים להכנת שלוש אוכלוסיות mRNA שונות: הפוליזומים, mRNA הקשורים למספר ריבוזומים; המונוזומים, mRNAs הקשורים לריבוזום אחד; ו-mRNAs שאינם קשורים לריבוזומים. לאחר מכן מופקים mRNAs. פרוטוקול זה אומת עבור צמחים ורקמות שונות, כולל שתילי Arabidopsis thaliana וצמחים בוגרים, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum ועלי Oryza sativa.

בספרות, פרופילי polysome לעתים קרובות מוצגים מתוך שבריר האור לשבר כבד כתוצאת הדרך ההדרגתית נאספת, כלומר מלמעלה עד למטה. מאז בפרוטוקול המתואר כאן ההדרגתיים נאספים מלמטה למעלה, את הפרופילים אנו מראים להתחיל עם השבר העבה (polysomes) וללכת שבר האור (יחידות מהשנה הריבוזום בחינם RNAs) (איור 2 א). לאחר מכן, אנו אוספים כל שיפוע בשישה 2 מ&quot;ל שברים, אבל שברים קטנים ניתן לאסוף אם ניתוח מפורט יותר של תוכן polysome צריך להתבצע. <p class...

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לחילוץ ופיצול תעתיקים מרקמות צמחים על בסיס מספר הריבוזומים הקשורים. הוא מאפשר הערכה גלובלית של פעילות התרגום וקביעת סטטוס התרגום של mRNAs ספציפיים.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

שלום, אני ססיל. אני עובדת ב-LGBP במרסיי. הפרוטוקול שנתאר בווידאו זה הוא שיטה פשוטה לבידוד פוליסומים ומונוסומים מרקמות צמחים שונות, במטרה לזהות mRNA שמתורגם באופן פעיל ולחקור את ויסות התרגום.כדוגמה, נראה לכם את בידוד הפוליסומים מנבטי Arabidopsis thaliana בני שישה ימים, בידוד RNA עוקב ואת ניתוח התוצאות. זרעו את הזרעים על צלחת והשאירו אותם למשך יומיים בטמפרטורה של ארבע מעלות. לאחר מכן, גדלו את הצמחים במשך שישה ימים.קצרו את הנבטים וגרסו אותם בחנקן נוזלי. שקלו 300 milligrams של אבקת הצמח והוסיפו 2.4 milliliter של polysome buffer. הצנטריפוגו כדי לאסוף את שברי הצמח והעמיסו את העלייה (supernatant) על חלקו העליון של מדרג סוכרוז (sucrose gradient).בצעו סבב ב-Ultra-centrifuge gradient ולאחר מכן אספו אותו מהתחתית למעלה תוך כדי קריאה רציפה של ה-OD. חלקו את הדגימות לפרקציית polysome, פרקציית monosome ופרקציית supernatant, והשקיעו את ה-RNA למשך לילה. בצעו Ultra-centrifuge, השעיו את המשקע וחלצו RNA לצורך ניתוח המשך. מספר ימים לפני ביצוע ה-polysome profiling, הכינו את ה-sucrose gradient.הכינו תמיסות סוכרוז בריכוזים של 50%, 35% ו-20% ושמרו אותן בטמפרטורה של ארבע מעלות. מזגו את שכבת הסוכרוז 50%. הקפיאו אותה במקפיא של מינוס 40 מעלות.לאחר שש שעות, הוסיפו את השכבה של 35% והקפיאו אותה במקפיא של 40- מעלות למשך לילה. שפכו את השכבה הראשונה של 20% והקפיאו אותה. ביום הניסוי, הוציאו מהמקפיא את מספר הגרדיאנטים הדרוש.הוסיפו את שכבת ה-20% sucrose האחרונה והניחו למדרגי הריכוז להפשיר בחדר קר. הכינו את הדגימה מהצמח שנאסף בזה הרגע. במקרה זה, אנו משתמשים בנבטים בני שישה ימים של Arabidopsis thaliana.קצור את הצמחים שהוקפאו בחנקן נוזלי וגרס אותם היטב. שקול 300 milligrams של אבקת צמחים. הוסף במהירות 2.4 milliliter של באפר פוליסומים טרי והומוגנז.העבירו את התמיסה בעזרת פיפט לשתי מבחנות של 1.5 milliliter. סבבו בצנטריפוגה את התמצית הציטוזולית. שאבו את העילוי באמצעות פיפט.הקפידו להימנע משברים של הצמח. אלו יפגעו בפרופיל בשלב הבא. העבירו את העילוי למדרג הסוכרוז מבלי להפר את המדרג.הניחו את המדרג (gradient) בתוך דלי של רוטור SW 41.בצעו צנטריפוגציה. כדי להדמיות של פרופיל הפוליסומים ולאסוף את הפראקציות, אנו משתמשים במערכת פשוטה המורכבת מצינור קפילרי שצולל אל תוך המדרג. הוא מחובר לקיובט UV.המערכת מחוברת באופן עצמאי למשאבה פריסטלטית. ספקטרופוטומטר UV רושם באופן רציף את ה-OD בזמן שהגרדיאנט עובר דרך הקיווטה. אספן הפרקציות מאפשר איסוף של פרקציות בנפח של שני מיליליטר.נקה את הקובט והנח אותו בספקטרופוטומטר. הוצא את הגרדיאנט מהמיכל מבלי להפריע לו. על הכלורופילים להתרכז בחלקו העליון של הגרדיאנט.הטמיעו את צינורות הנימיות עד לתחתית המעבר (gradient). הפעילו את משאבת הפריסטלטיקה. המעבר נאסף מהתחתית למעלה וערך ה-OD נקרא באופן רציף.נאספים פракציות של שני מיליליטר. להלן צורתו של פרופיל קלאסי. שיקוע ה-RNA מבוצע באמצעות guanidinium hydrochloride ואיסופרופנול.ראשית, שפכו נפח אחד של guanidinium hydrochloride למבחנה של 50 milliliter ולאחר מכן הוסיפו את הפראקציה. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 נפח של isopropanol ו-50 microgram של courier שווה. שקיעו את ה-RNA למשך לילה בטמפרטורה של minus 20 degrees.העבירו את הפראקציות למבחנות אולטרה-צנטריפוגה בנפח 40 milliliter ואזנו את המבחנה באמצעות isopropanol. ביצעו צנטריפוגה. הסירו את העלילית ויבשו את המשקע באוויר. השעיקו את המשקע ב-200 microliters של תמיסת TE buffer חמה.בצע חילוץ נוסף של ה-RNA באמצעות חילוץ פנול-כלורופורם קלאסי. כאן מוצג פרופיל מייצג של תמצית פוליסומים מנבטי Arabidopsis בני שישה ימים. השיא המרכזי תואם למונוסום, ה-mRNA המקושר לריבוסום בודד.החלק הראשון של הפרופיל תואם לפראקציות הפוליסומליות, כלומר ל-mRNA הקשור לריבוזומים רבים. כל שיא תואם להצטרפות של ריבוזום חדש ל-mRNA. החלק האחרון של הפרופיל תואם למה שנקרא פראקציית העילוי (supernatant), המכילה תת-יחידות ריבוזומליות חופשיות ו-RNA.כמות גדולה של תת-יחידות 60S יוצרת כתף לצד שיאו של המונוסום. כדי להעריך את שלמותן, ניתן להריץ את ה-RNAs שחולצו מהfraksions על ג'ל agarose קלאסי לפני שימוש בניסויים נוספים. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבודד פוליסומים מנבטים של Arabidopsis thaliana, אך גם מרוזטות צעירות וזקנות וכן מעלי Nicotiana benthamiana, עגבנייה ואורז, לכן הוא אמור לעבוד עם מגוון רחב של צמחים ורקמות.ה-RNAs המטוהרים תואמים לניתוח באמצעות מערך מיקרו (micro array) וכן לזיהוי של RNAs קטנים הקשורים לפרקציות פוליסומליות.

an-easy-method-for-plant-polysome-profiling

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

המטרה הכוללת של טכניקה פרופיל polysome הוא ניתוח של פעילות translational של הפרט mRNAs או transcriptome mRNAs במהלך סינתזת החלבון. השיטה זו חשוב ללימודים של רגולציה סינתזה של חלבון, הפעלת תרגום ודיכוי בריאות ומחלות האנושי מרובים.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

מתרגם הריבוכמה אהדה (מלכודת) מציעה את האפשרות לנתח תוכניות התפתחותיות עם עיבוד מינימלי של איברים ורקמות. הפרוטוקול מניב RNA באיכות גבוהה מתאים המיועדים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-יחידת משנה ריבוזומבית. כלים לניתוח במורד הזרם, כגון רביעיית-PCR או RNA-seq, חושפים פרופילי ביטויים ספציפיים לסוג תאים.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיהור פוליזום אאוקריוטי מגושי סויה שלמים. לאחר הריצוף, ניתן להשתמש בצינורות סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים כדי לזהות גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי ברמות השעתוק והטרנסלטום.

טיהור פוליזום מגושים סימביוטיים של פולי סויה

הפרוטוקול המוצג כאן כולל פרופיל פוליזומלי כדי לבודד טרנסלטום, mRNA הקשור לריבוזומים, לרנ"א לא פוליזומלי ופוליזומלי מארבידופסיס באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. שיטה זו מדגימה את יעילות התרגום של Arabidopsis בלחץ חום.

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

למדו שיטה פשוטה לבידוד פוליסומים ומונוסומים מרקמות צמחים באמצעות Arabidopsis thaliana. שיטה זו מאפשרת לזהות mRNA בתרגום פעיל ולחקור רגולציה תרגומית בצמחים.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

גלה סרטונים נוספים