שיטה קלה הצמח Polysome Profiling
28 באוגוסט 2016
פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לחילוץ ופיצול תעתיקים מרקמות צמחים על בסיס מספר הריבוזומים הקשורים. הוא מאפשר הערכה גלובלית של פעילות התרגום וקביעת סטטוס התרגום של mRNAs ספציפיים.
שלום, אני ססיל. אני עובדת ב-LGBP במרסיי. הפרוטוקול שנתאר בווידאו זה הוא שיטה פשוטה לבידוד פוליסומים ומונוסומים מרקמות צמחים שונות, במטרה לזהות mRNA שמתורגם באופן פעיל ולחקור את ויסות התרגום.
כדוגמה, נראה לכם את בידוד הפוליסומים מנבטי Arabidopsis thaliana בני שישה ימים, בידוד RNA עוקב ואת ניתוח התוצאות. זרעו את הזרעים על צלחת והשאירו אותם למשך יומיים בטמפרטורה של ארבע מעלות. לאחר מכן, גדלו את הצמחים במשך שישה ימים.
קצרו את הנבטים וגרסו אותם בחנקן נוזלי. שקלו 300 milligrams של אבקת הצמח והוסיפו 2.4 milliliter של polysome buffer. הצנטריפוגו כדי לאסוף את שברי הצמח והעמיסו את העלייה (supernatant) על חלקו העליון של מדרג סוכרוז (sucrose gradient).
בצעו סבב ב-Ultra-centrifuge gradient ולאחר מכן אספו אותו מהתחתית למעלה תוך כדי קריאה רציפה של ה-OD. חלקו את הדגימות לפרקציית polysome, פרקציית monosome ופרקציית supernatant, והשקיעו את ה-RNA למשך לילה. בצעו Ultra-centrifuge, השעיו את המשקע וחלצו RNA לצורך ניתוח המשך. מספר ימים לפני ביצוע ה-polysome profiling, הכינו את ה-sucrose gradient.
הכינו תמיסות סוכרוז בריכוזים של 50%, 35% ו-20% ושמרו אותן בטמפרטורה של ארבע מעלות. מזגו את שכבת הסוכרוז 50%. הקפיאו אותה במקפיא של מינוס 40 מעלות.
לאחר שש שעות, הוסיפו את השכבה של 35% והקפיאו אותה במקפיא של 40- מעלות למשך לילה. שפכו את השכבה הראשונה של 20% והקפיאו אותה. ביום הניסוי, הוציאו מהמקפיא את מספר הגרדיאנטים הדרוש.
הוסיפו את שכבת ה-20% sucrose האחרונה והניחו למדרגי הריכוז להפשיר בחדר קר. הכינו את הדגימה מהצמח שנאסף בזה הרגע. במקרה זה, אנו משתמשים בנבטים בני שישה ימים של Arabidopsis thaliana.
קצור את הצמחים שהוקפאו בחנקן נוזלי וגרס אותם היטב. שקול 300 milligrams של אבקת צמחים. הוסף במהירות 2.4 milliliter של באפר פוליסומים טרי והומוגנז.
העבירו את התמיסה בעזרת פיפט לשתי מבחנות של 1.5 milliliter. סבבו בצנטריפוגה את התמצית הציטוזולית. שאבו את העילוי באמצעות פיפט.
הקפידו להימנע משברים של הצמח. אלו יפגעו בפרופיל בשלב הבא. העבירו את העילוי למדרג הסוכרוז מבלי להפר את המדרג.
הניחו את המדרג (gradient) בתוך דלי של רוטור SW 41.בצעו צנטריפוגציה. כדי להדמיות של פרופיל הפוליסומים ולאסוף את הפראקציות, אנו משתמשים במערכת פשוטה המורכבת מצינור קפילרי שצולל אל תוך המדרג. הוא מחובר לקיובט UV.
המערכת מחוברת באופן עצמאי למשאבה פריסטלטית. ספקטרופוטומטר UV רושם באופן רציף את ה-OD בזמן שהגרדיאנט עובר דרך הקיווטה. אספן הפרקציות מאפשר איסוף של פרקציות בנפח של שני מיליליטר.
נקה את הקובט והנח אותו בספקטרופוטומטר. הוצא את הגרדיאנט מהמיכל מבלי להפריע לו. על הכלורופילים להתרכז בחלקו העליון של הגרדיאנט.
הטמיעו את צינורות הנימיות עד לתחתית המעבר (gradient). הפעילו את משאבת הפריסטלטיקה. המעבר נאסף מהתחתית למעלה וערך ה-OD נקרא באופן רציף.
נאספים פракציות של שני מיליליטר. להלן צורתו של פרופיל קלאסי. שיקוע ה-RNA מבוצע באמצעות guanidinium hydrochloride ואיסופרופנול.
ראשית, שפכו נפח אחד של guanidinium hydrochloride למבחנה של 50 milliliter ולאחר מכן הוסיפו את הפראקציה. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 נפח של isopropanol ו-50 microgram של courier שווה. שקיעו את ה-RNA למשך לילה בטמפרטורה של minus 20 degrees.
העבירו את הפראקציות למבחנות אולטרה-צנטריפוגה בנפח 40 milliliter ואזנו את המבחנה באמצעות isopropanol. ביצעו צנטריפוגה. הסירו את העלילית ויבשו את המשקע באוויר. השעיקו את המשקע ב-200 microliters של תמיסת TE buffer חמה.
בצע חילוץ נוסף של ה-RNA באמצעות חילוץ פנול-כלורופורם קלאסי. כאן מוצג פרופיל מייצג של תמצית פוליסומים מנבטי Arabidopsis בני שישה ימים. השיא המרכזי תואם למונוסום, ה-mRNA המקושר לריבוסום בודד.
החלק הראשון של הפרופיל תואם לפראקציות הפוליסומליות, כלומר ל-mRNA הקשור לריבוזומים רבים. כל שיא תואם להצטרפות של ריבוזום חדש ל-mRNA. החלק האחרון של הפרופיל תואם למה שנקרא פראקציית העילוי (supernatant), המכילה תת-יחידות ריבוזומליות חופשיות ו-RNA.
כמות גדולה של תת-יחידות 60S יוצרת כתף לצד שיאו של המונוסום. כדי להעריך את שלמותן, ניתן להריץ את ה-RNAs שחולצו מהfraksions על ג'ל agarose קלאסי לפני שימוש בניסויים נוספים. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבודד פוליסומים מנבטים של Arabidopsis thaliana, אך גם מרוזטות צעירות וזקנות וכן מעלי Nicotiana benthamiana, עגבנייה ואורז, לכן הוא אמור לעבוד עם מגוון רחב של צמחים ורקמות.
ה-RNAs המטוהרים תואמים לניתוח באמצעות מערך מיקרו (micro array) וכן לזיהוי של RNAs קטנים הקשורים לפרקציות פוליסומליות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד פוליסומים ומנוסומים מרקמות צמחים, המאפשרת זיהוי של mRNAs המתורגמים באופן פעיל וחקר של בקרה על התרגום. הדוגמה המוצגת מתמקדת בבידוד פוליסומים מנבטי Arabidopsis thaliana בני שישה ימים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- בקרה על תרגום
- ניתוח mRNA
רקע
- הבנת פעילות התרגום חיונית לחקר ביטוי גנים.
- פוליסומים הם מקבצי ריבוזומים המתרגמים mRNA, בעוד שמונוסומים הם ריבוזומים בודדים.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי מצב התרגום של mRNA ספציפיים.
- Arabidopsis thaliana משמשת כאורגניזם מודל במחקר צמחים.
מטרת המחקר
- בידוד פוליזומים ומונוזומים מרקמות צמחים.
- זיהוי mRNA המתורגם באופן פעיל.
- חקר בקרה של תרגום בצמחים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זריעת זרעים בצלחות והשריה בקור (stratification) למשך יומיים.
- גידול נבטים למשך שישה ימים בתנאים אופטימליים.
- בידוד פוליסומים ומונוסומים מרקמות הצמח.
- ניתוח RNA לקביעת פעילות התרגום.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של פוליסומים מנבטי Arabidopsis thaliana.
- זיהוי של mRNAs המתורגמים באופן פעיל.
- תובנות לגבי בקרה על התרגום ברקמות צמחים.
- הדגמת יעילות השיטה לחקר תהליכי תרגום.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה מהימנה לחקר התרגום בצמחים.
- הוא משפר את ההבנה של ויסות ביטוי גנים.
- ניתן ליישם גישה זו על מיני צמחים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרופיל פוליסומים מספק תמוګه ישירה של הפעילות התרגומית, ובכך מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של היפותזות לגבי מטרות בתהליכי גילוי ביו-פארמה מבוססי צמחים. על ידי הבחנה בין מאגרי mRNA המתורגמים באופן פעיל, השיטה תומכת בתיקוף מטרות ובסריקה פנוטיפית במערכות בעלות רלוונטיות חקלאית. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בעת תיעדוף מובילים לשיפור יבולים או ליישומים של חקלאות מולקולרית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי קישור בין שפע של mRNA לתוצר התרגום.
- ערך תפעולי: מבהיר את פעילות המסלול באמצעות מדדי מעורבות ריבוזומית.
- ערך חיזוי: תומך בתיעדוף תיקי פיתוח על ידי זיהוי מטרות עם מעורבות תרגומית מתמשכת.
סקרינג ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקת תרכובות בפלטפורמות ביטוי בצמחים.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרופיל OD260 כמותי ושחזוריות של פראקציות.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה ברקמות של Arabidopsis, Nicotiana, עגבנייה ואורז.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין תיקוף מטרות בשלב הגילוי להערכת סמנים ביולוגיים פרה-קליניים במערכות צמחים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקדת בערך ניבוי על ידי בידוד אוכלוסיות mRNA המוגדרות על ידי עומס ריבוזומים.
- מערכת רלוונטית למחלה: ישימה על מודלים של גידולים המשמשים בחקלאות מולקולרית ובייצור ביו-פרמצבטי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, תומכת בבדיקת השערות לפני זיהוי מובילים (leads) ומאפשרת רציפות תרגומית להערכה פרה-קלינית במערכות מבוססות צמחים.
- ביולוגיה של הגילוי: בודק מעורבות של מטרה על ידי מדידת שינויים ביחסי פוליסום/מונוסום תחת תנאים ניסיוניים.
- סינון: מספק תוצאות של ריבוזומ-פרופיילינג המסייעות להשוות השפעות של תרכובות או הפרעות גנטיות.
- אנליטיקה: מייצר עקומות OD260 כמותיות ותוצרי RNA מופרדים לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: תואם לגילוי סמנים ביולוגיים בשרשראות ייצור מולקולרית בצמחים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת הפרדה השמישה לרקמות ומינים שונים של צמחים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי פתרון מצבים תרגומליים של mRNA המטרה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פראקציונציה סטנדרטית של מדרג סוכרוז וניטור רציף של OD.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת ראיות ישירות למודולציה של המטרה ברמת התרגום.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון המבוסס על נתוני פעילות תרגומלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמות צמחים ובהכנת באפר פוליסומים.
- תלוי בציוד אולטרה-צנטריפוגה ובמערכות לאיסוף פרקציות עם ניטור UV.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור הכנת גרדיאנט ופרוטוקולים של איחוד פרקציות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למערכות צמחים שאינן מודל.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות לשמירה על שלמות ה-RNA במהלך שלבי הפרקציונציה והמיצוי.
