טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים
4 באפריל 2016
מאמר זה מציג שיטה רגישה הנקראת Circle-Seq לטיהור DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי (eccDNA). השיטה כוללת טיהור עמודות, הסרת ה-DNA הכרומוזומלי הליניארי שנותר, הגברת מעגל מתגלגל ורצף תפוקה גבוהה. Circle-Seq ישים לסינון בקנה מידה גנומי של eccDNA איקריוטי ולחקר חוסר יציבות הגנום ושונות במספר העתק.
טיהור רחב-גנומי של DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי מתאים לתאים אוקריוטיים. שלום, אני רסמוס. כאן אציג את התווה המלא של השיטה לטיהור DNA מעגלי.
בחלק הראשון, תאי שמרים גודלים ונאספים. לאחר מכן, DNA מעגלי מטוהר ומועשר בשלושה שלבים. ראשית, באמצעות הפרדה בעמודה, שבה מעגלי ה-DNA מטוהרים ומועשרים.
לאחר מכן, באמצעות טיפול ב-DNA בעזרת אקסונוקליאז כדי לעכל את כל ה-DNA הליניארי שנותר, ולבסוף על ידי הגברה של מעגלי DNA באמצעות פולימראז phi-29. בחלק החמישי של פרוטוקול זה, מעגלי ה-DNA יעברו ריצוף והקריאות ימופו לגנום הייחוס של Saccharomyces cerevisiae. בסוף סרטון זה, נציג בפניכם מספר תוצאות מייצגות.
נדון בפרספקטיבות למחקרים עתידיים וביתרונות שבשימוש בשיטה זו. חלק ראשון, קציר תאים. תרבית ההתנעה גדלה ב-30 °C עם ערבוב עד לצפיפות מקסימלית, שהיא כ-200 מיליון תאים ל-milliliter ומושגת לאחר 24 עד 48 שעות.
את התרבית שגדלה מעבירים למבחנת Falcon ומשקיעים באמצעות סבוב בצנטריפוגה למשך שלוש דקות. את הנוזל העליון (supernatant) מסירים. את המשקע הגדול מערבלים במכשיר vortex בבuffer TE ומשקיעים שוב באמצעות סבוב בצנטריפוגה.
חלק שני, טיהור בעמודה. בשלב זה, אנו משתמשים בערכה מסחרית לטיהור בעמודה המפיקה פלסמידים בדרגת ניקיון גבוהה מתוך DNA גנומי חיידקי. לפני השימוש בערכה זו עבור שמרים, יש לפרק את דופן התא.
פעולה זו מבוצעת על ידי השעיה מחדש של משק התאים השטוף בבפר L-1 מהערכה. תלי התאים מועברים לשפופרת מיקרוצנטריפוגה ומוסיפים חרוזי זכוכית בנפח השווה לשליש מהנפח הכולל. הדגימה עוברת ערבוב ב-vortex במהירות מקסימלית למשך 10 דקות, והחרוזים מוסרים באמצעות סבב צנטריפוגה במהירות של 2,000 סל"ד למשך 30 שניות.
את הנוזל העליון מעבירים למבחנה חדשה. בשיטה זו אנו מוסיפים פלסמידים מדוללים מאוד לנוזל העליון בשלושה יחסי ריכוז שונים. אנו מציעים להוסיף פלסמיד מדולל מאוד למחזור.
זה יכול לשמש כמדריכי ייחוס פנימיים. ניתן להשתמש בזה כדי לבצע בקרת איכות של טהרת ה-DNA וההגברה שלו; בנוסף, ניתן לבצע הערכה כמותית חלקית של DNA שאינו מעגלי לתא באמצעות פלסמידי spike-in אלו. יש להוסיף פלסמידים מדוללים מאוד בלבד, מכיוון שהם ישפיעו על רזולוציית הרצף של DNA מעגלי אחר.
את תרחיף התאים המכיל פלסמידים מתוספים מטפלים בתמיסת L-2 מהערכה ופועלים לפי הפרוטוקול של הערכה. לאחר טעינת העמודה, חלבונים, ליפידים ו-DNA כרומוזומלי מוסרים באמצעות שטיפת העמודה פעמיים. DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי מועשר באופן משמעותי בפרקציית האלוציה.
חלק שלושה, עיכול DNA ליניארי. בשלב זה, אנו משתמשים באקסונוקלאז כדי לעכל DNA ליניארי שנותר. אקסונוקלאז תלוי ATP פוגע באופן ספציפי ב-DNA ליניארי דו-גדילי וחד-גדילי מבלי לעכל DNA מעגלי.
הספציפיות של האקסונוקלאז ל-DNA ליניארי אוששה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל לאחר 29 שעות של טיפול ב-DNase. התוצאות מראות כי DNA גנומי עובר עיכול בעוד ש-DNA פלסמיד נשאר, כפי שמוצג על ידי החץ האדום. שמרים מכילים 16 כרומוזומים, שאורכם يصل עד 1,500 kilobases.
כדי להקל על עיכול על ידי אקסונוקליאז (exonuclease), נעשה שימוש באנדונוקליאז בעל אתר חיתוך נדיר כדי להשיג מספר רב יותר של קצוות DNA נגישים. בשימוש באנזים ההגבלה NotI, כל כרומוזום נחתך עד שבע פעמים כפי שסומן. DNA שעבר טיהור בעמודה מטופל ב-NotI בטמפרטורה של 37 °C בבלוק חימום למשך הלילה.
לאחר אינאקטיבציה תרמית של NotI, ה-DNA המגזז מעובד עם אקסונוקלאזות ב-37 מעלות בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר הטיפול באקסונוקלאז, האנזימים עוברים אינאקטיבציה תרמית ב-70 מעלות למשך 30 דקות. עיכול של כל ה-DNA הכרומוסומלי הליניארי באמצעות ATP ואקסונוקלאז נוספים עשוי להימשך מספר ימים. כדי להבטיח שכל ה-DNA הליניארי עוכיל לחלוטין, הדגימות מנותחות בשיטות PCR או qPCR תוך שימוש בגן ייחוס פנימי כגון ACTI.
חלק ארבע, הגברת DNA. בשלב זה, אנו מעשירים ומגבירים DNA מעגלי באמצעות הפולימראז phi-29. התגובה מתבצעת ב-30 °C תוך שימוש באוליגונוקלאוטידים random hexamer וב-phi-29.
לפולימראז יש דיוק גבוה ופעילות הגהה, המבטיחים הגברה בלתי מוטה של ה-DNA. כל פולימראז יכול, באמצעות שכפול מעגל מתגלגל (rolling circle replication), לסנתז עד 100 kilobases של DNA. הפולימראז הוא גם בעל פרוססיביות גבוהה המגבירה את ה-DNA עד פי 10⁹.
חלק חמישי, ריצוף. בהתאם לפרוטוקול עבור פלטפורמת ריצוף מהדור הבא (next generation sequencing) בעלת תפוקה גבוהה, ה-DNA עובר סוניקציה לגודל ממוצע של 300 base pairs ומרוצף כקריאות single end של 141 nucleotide. קריאות הריצוף ממופות לגנום הייחוס של Saccharomyces cerevisiae, באמצעות מאגר הנתונים החינמי Galaxy.
הנתונים המרצפים מועלים ל-Galaxy והקריאות ממופות באמצעות Bowtie2, מתאם קריאות קצר המאפשר מיפוי של קריאות חלקיות. חלק שישי, תוצאות מייצגות. לאחר הריצוף והמיפוי לגנום הייחוס של Saccharomyces cerevisiae, ניתן להציג את הקריאות בדפדפן הגנום בתוך תוכנת Galaxy.
ניתן, למשל, לספור DNA ממקור מעגלי כאזורים המכילים קריאות רציפות (coherent reads) הגדולות מ-one kilobase, כפי שמוצג על המסך. דוגמה לאזור בכרומוזום ארבע המכיל קריאות רציפות המשתרעות על פני יותר מ-one kilobase היא האזור עם הגנים six ו-seven של נשאי ההקסוז (hexose transporter).
בשל ההומולוגיה הגבוהה של הרצפים בין הגנים של נשאי ההקסוז, אנו מציעים שרקומבינציה הומולוגית לא תקינה מובילה לעיגול של DNA זה. במודל עבור מוטציה של DNA מעגלי, התהליך מתרחש כאשר תהליך תיקון ה-DNA מתבצע באופן לא מושלם. לדוגמה, אם מתרחש שבירה של גדיל כפול באלמנט חוזר, הרצף ההומולוגי באותה כרומטידה יכול לשמש כתבנית לתיקון ה-DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית.
לאחר כריתה (resection), פלישת גדיל, סינתזת DNA ופתרון של כל הצמתים, מעגל DNA יכול להיווצר מהגנום ולגרום למחיקת DNA בכרומוזום. ניתן להדמיאן את ההשפעות של טיפול ב-DNA באמצעות אקסונוקליאזות ו-phi-29 polymerase באמצעות צביעה ב-propidium iodide. בקרות צביעה של DNA גנומי נראות כפי שמופיע בתמונה השמאלית, בעוד ש-DNA פלסמידי נראה כפי שמופיע בתמונה הימנית.
לאחר 29 שעות של טיפול באקסונוקליאז עבור 400 nanograms של DNA גנומי, רוב ה-DNA מעוכל כפי שמוצג בתמונה השמאלית. תוצאה זו מאושרת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל כפי שמוצג בתמונת הג'ל מימין. לאחר 72 שעות של טיפול באקסונוקליאז ולאחריו סינתזת DA על ידי phi-29 polymerase, עדיין ניתן לזהות מיליוני עותקים של DNA.
באופן דומה, לאחר 29 שעות של טיפול באקסונוקליאז (exonuclease) ב-400 nanograms של DNA גנומי, בתוספת של 100 nanograms של DNA פלסמידי, רוב ה-DNA הגנומי מעוכלי. עם זאת, ה-DNA הפלסמידי אינו מעוכלי, כפי שניתן לראות בתמונת הג'ל. לאחר טיפול ב-phi-29 polymerase בדגימה שעברה טיפול באקסונוקליאז למשך 72 שעות, רוב ה-DNA המוגבר מופיע כפלסמידים צבועים.
ראשית סרקנו גנים עבור DNA מעגלי והופתענו מאוד למצוא כמה מאות סוגים שונים של דגימות DNA. כן, זה היה באמת מפתיע לגלות עד כמה מעגלי DNA נפוצים באוכלוסיית השמרים, ואנו מאמינים שניתן להשתמש בשיטה זו עבור סוגים רבים של מחקרים. באופן מובמא, אחת האפשרויות תהיה לבחון רקמה אנושית.
אנו יודעים שגנים יכולים להתרבות על גבי אלמנטים לא-מעגליים ובשמרים כמובן, ואפילו בתאי גידול. אני חושב שבדרך כלל יהיה מעניין לבחון תאים סומטיים ולחקור איזה סוג של DNA מעגלי נמצא שם וכיצד אנו עשויים להשפיע על תהליך זה. Circularization. בתאים מזדקנים ישנם מעגלים המצטברים ככל שאנו מזדקנים, ואנו מצפים למצוא גנים רבים יותר על גבי DNA מעגלי.
בנוסף, נרצה לבחון את המנגנונים המולקולריים של מעגול DNA, והדבר הברור לעשות הוא לבחון שמרים, שבהם קיימים מוטנטים הפגומים ברקומינציה הומולוגית וברקומינציה לא-הומולוגית. בחקר מוטנטים אלו, אנו מצפים שפרופיל מעגול ה-DNA יהיה שונה בין סוגי המוטנטים השונים, ובתקווה שמחקרים בשמרים נוכל ללמוד הרבה יותר על מעגול DNA. בהשוואה לשיטות אחרות, שיטה זו רגישה הרבה יותר. ייתכן שבאמצעותה נוכל למצוא מעגל DNA בערך באחת מתוך 10,000 תאים.
וככל שידוע לי ממחקרים מתוך הניסוי שנערך בהרחבה, אללים מוטנטיים צריכים בדרך כלל להגיע לשיעור של 1% עד 10% מהאוכלוסייה לפני שניתן לזהותם. נכון, ובטכניקה זו אין צורך בידע מוקדם על מעגלי ה-DNA שנוצרו, בניגוד לטכניקות אחרות, או שמעגלי ה-DNA צריכים להיות קשוריים במידה מסוימת ואז ניתן לזהותם בקלות כהגברות באמצעות ריצוף או צביעת כרומוזומים.
כן, כך שבאמת אני מניח שהיתרון המרכזי הוא הרגישות, ואני מקווה שנוכל לבצע הרבה דברים מעניינים בעזרת שיטה זו.
סקירה כללית
מאמר זה מציג את Circle-Seq, שיטה רגישה וחזקה לטיהור, הגברה וזיהוי רחב-גנומי של DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי (eccDNA) ב-Saccharomyces cerevisiae. הפרוטוקול משלב טיהור מבוסס עמודה, עיכול נרחב על ידי אקסונוקלאז, הגברה בשיטת גלגול מעגלי (rolling-circle amplification) וריצוף מהדור הבא כדי לאפשר פרופיל מקיף של אוכלוסיות eccDNA. השיטה חושפת את השכיחות והמגוון של eccDNAs ומציעה ישימות רחבה למחקרים על יציבות ואבולוציה של גנום איקריוטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- גנטיקה מולקולרית
- גנומיקה
- טיהור וריצוף DNA
רקע
- מולקולות DNA מעגליות חוץ-כרומוזומליות (eccDNAs) נפוצות בשמרים ובאוקריוטים אחרים.
- eccDNAs תורמים לשונות גנטית ועשויים להשפיע על יציבות הגנום ועל אבולוציה.
- שיטות קיימות לזיהוי eccDNA חסרות רגישות או דורשות ידע מוקדם על רצפי המטרה.
- דרושות שיטות זיהוי משופרות כדי לחקור את ההיווצרות והתפקוד של eccDNA.
מטרת המחקר
- פיתוח ותיקוף של שיטה רגישה לניקוי וזיהוי של eccDNA ברחב הגנום.
- אפיון המגוון והשפעות של eccDNAs באוכלוסיות של שמרים.
- אספקת פרוטוקול שניתן להחיל על מערכות אוקריוטיות אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול וקציר של תאי שמרים בצפיפות גבוהה.
- טיהור של DNA מעגלי באמצעות עמודה, כולל פירוק של דופן התא והסרה של חלבונים, ליפידים ו-DNA כרומוזומלי.
- עיכול נרחב באמצעות exonuclease (עם טיפול מקדים ב-endonuclease בעל תדירות חיתוך נמוכה) כדי לפרק DNA ליניארי תוך שימור DNA מעגלי.
- הגברה של eccDNA בשיטת rolling-circle באמצעות phi-29 polymerase והקסמרים אקראיים.
- ריצוף בתושבה גבוהה ומיפוי של הקריאות לגנום הייחוס של השמרים באמצעות Bowtie2 והדמיה בפלטפורמת Galaxy.
- הכללה של plasmid spike-ins בדילול גבוה כביקורות פנימיות להערכת איכות וככימות.
תוצאות עיקריות
- מאות מינים נבדלים של eccDNA הגדולים מ-1 kb זוהו באוכלוסיות של שמרים.
- זיהוי חוזר של גנים ספציפיים (למשל, ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7) על גבי DNA מעגלי במאבחי שמרים שונים מצביע על אתרים שמורים למעגול DNA.
- השיטה הדגימה רגישות גבוהה, תוך זיהוי eccDNAs הנוכחים בשיעור של עד 1 מתוך 10,000 תאים.
- הגברה בשיטת Rolling-circle וטיפול באקסונוקליאז העשירו ביעילות את ה-DNA המעגלי והסירו DNA ליניארי, כפי שאושר באמצעות אלקטרופורזה בג'ל וצביעה.
מסקנות
- שיטת Circle-Seq מאפשרת זיהוי רגיש, בלתי מוטה ובכל רחבי הגנום של eccDNAs בתאים איקריוטים.
- השיטה ישימה באופן נרחב לחקר המגוון של eccDNA, מנגנוני ההיווצרות שלו ותפקידם ביציבות הגנום ובאבולוציה.
- ניתן להתאים את Circle-Seq לשימוש באורגניזמים אחרים, כולל רקמות אנושיות ותאי גידול.
שאלות נשאלות בביאיות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טיהור ואפיון של DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי (eccDNA) ברמה הגנומית מאפשרים לצוותי ביו-פארמה לבחון יציבות גנומית, וריאציה סומטית ומנגנוני הסתגלות במערכות איקריוטיות. תהליך העבודה של Circle-Seq מספק זיהוי רגיש ובלתי מוטה של eccDNA, התומך בהפחתת סיכונים מנגנונית ובתיקוף מטרות בשלבי הגילוי המוקדמים ובמחקר תרגומי. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בקבלת החלטות לגבי פורטפוליו, במקרים שבהם פלסטיות גנומית או ארגון מחדש של ה-DNA עשויים להשפיע על אסטרטגיות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיפוי מקיף של eccDNA כדי להבהיר את המנגנונים של ארגון מחדש גנומי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי חשיפת לוקוסים הנוטים למעגול (circularization) ולשונות גנטית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים במערכות שבהן חוסר יציבות גנומית עלול להטעות את הערכת המטרה.
- מספק זיהוי בלתי מוטה, ובכך מפחית את ההסתמכות על ידע מוקדם לגבי שינויים גנומיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין דגימות DNA מעגליות בדרגת ניקיון גבוהה עבור תהליכי רצף ואנליזה המשכיים.
- מבצע סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות באמצעות בקרות פנימיות לצורך הדירות והערכה כמותית.
- מאפשר סריקה רחבה (high-throughput) הניתנת להרחבה של פרופילי eccDNA באוכלוסיות תאים.
- מספק תוצרי כמותיים המתאימים לאנליזה השוואית ולאופטימיזציה של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לגילוי של eccDNA במודלים אוקריוטיים מגוונים.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מעקב אחר סממנים של חוסר יציבות גנומית.
- מספק תובנות מותאמות סיכון לקידום מועמדים במקרים שבהם eccDNA עשוי להשפיע על הפנוטיפ או על העמידות.
- מסייע בגילוי ביו-מרקרים הקשורים לפלסטיות גנומית ולהסתגלות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת Circle-Seq משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לאפיון של eccDNA ברחבי הגנום, החל מבדיקת השערות ראשונית ועד למחקר תרגומי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על יציבות הגנום ומנגנונים אדפטיביים באמצעות זיהוי לא מוטה של eccDNA.
- סריקה: מספק פרופילים כמותיים וניתנים לשחזור של eccDNA לסריקה השוואית בין תנאים או שורות תאים.
- אנליטיקה: מספק נתוני רצף ברזולוציה גבוהה ותוצרי מיפוי לצורך ניתוח סטטיסטי חסון.
- מחקר תרגומי: מאפשר מעקב אחר eccDNA כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים במודלים של מחלות או במחקרי הזדקנות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע תהליך עבודה רגיש ובעל יישום רחב, הניתן להתאמה למערכות איקריוטיות רבות ולשאלות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובמחקרים מכניסטיים העוסקים באי-יציבות גנומית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של טיהור וזיהוי של eccDNA באמצעות בקרות פנימיות ופרוטוקולים ניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי הבהרת גורמי סיכון גנומיים ופוטנציאל אדפטיבי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תוכניות שבהן eccDNA עשוי להשפיע על התגובה הטיפולית או על עמידות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית, טיהור DNA ואנליזה של ריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing).
- נדרשת גישה לפולימרזים בעלי נאמנות גבוהה (high-fidelity polymerases), אקסונוקליאזות ותשתיות ריצוף.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת דגימות ולניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה למודלים אוקריוטיים שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור רקמות או סוגי תאים ספציפיים.
- טיפול נרחב באקסונוקליאז ושלבי בקרת איכות הם קריטיים להסרה מהימנה של DNA לינארי.
