Name: Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: למד מיקרו-הזרקת נפרוטוקסינים ב-Danio rerio למידול אי-ספיקת כליות חריפה. שיטה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של נזק תאי ותהליכי התחדשות בכליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי DP2OD008470 מענק NIH. בנוסף, זיכרון RAM נתמך בחלקו על ידי קרנות הניתנים על ידי אוניברסיטת בית הספר למוסמכים נוטרדאם. אנו מודים לצוות המחלקה למדעי הביולוגיה, המרכז הזברה מחקר, והמרכז בתאי גזע משובי רפואה באוניברסיטת נוטרדאם. תודה מיוחדת לחברי מעבדה לעיסוק דיונים על ביולוגית כליות ומשוב המועילות על עבודה זו.

הנהלים לעבודה עם עוברי דג הזברה המתוארת פרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת נוטרדאם. 1. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 50x של התקשורת העובר E3 על ידי ערבוב 73.0 גרם NaCl, 3.15 גרם KCl, 9.15 גרם CaCl 2, ו 9.95 גרם MgSO 4 ב 5 ליטר של מים מזוקקים, ולאחסן ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור culturing של עוברי דג זברה, לדלל את תמיסת 50x המלאה של תקשורת עובר E3 לפתרון עובד 1x עם מים מזוקקים, ולאחר מכן להוסיף 200 μl של מתילן כחול 0.05% לכל 1 ליטר של 1x E3 לפעול כמו פטריות, ולאחסן ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון חסימת פיגמנטציה של התקשורת העובר E3 עם 0.003% 1-פניל-2-thiourea (PTU) על ידי שילוב 40 מ&quot;ל של המניה 50x E3 עם 0.06 מ&quot;ג PTU. ואז להביא את הנפח לסך של 2 ליטר עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את O E3 / PTU / N ב RT כדי לקבל את אבקת PTU אל הפתרון. ואז לאחסן את E3 / PTU בRT. הערה: E3 / PTU יש חיי מדף של כשבוע, ופתרונות ישנים יהיו פחות יעילים חסימת פיתוח פיגמנטציה זחלי דג זברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן ההרדמה של 0.2% Tricaine (MS-222) על ידי הוספת 1 גרם של Tricaine 500 מ&quot;ל מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 7.2 עם 1 M טריס, pH 9.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לבצע פתרון methylcellulose 2% עבור הדמיה על ידי הצבת פתרון של E3 1x (לא מתילן כחול), עם 1/10 נפח ה של 0.2% Tricaine הוסיף ב 4 ° C.. הערה: פתרון methylcellulose הוא פתרון עבה, ברור כי משמש כדי לייצב עובר לחיות בעדינות במיקרוסקופ. לאחר המניפולציות מבוצעות העוברים ניתן לכבס ב 1x E3 לפזר את methylcellulose מבלי לפצוע את החיה ולאפשר מיקרוסקופיה בשלבים הבאים באותה הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מקורר 4 ° C, ומערבבים הפתרון 1x E3 / Tricaine במרץ בצלחת ומערבבים ומוסיפים בהדרגה את הכמות המתאימה של מתילאבקת תאית תוך המשך לבחוש במרץ. מוסיפים בהדרגה את אבקת הפתרון למנוע היווצרות של אגרגטים methylcellulose מסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל את האבקה מערבבת לתוך תמיסת 2% methylcellulose / E3 / tricaine, מערבבי הפתרון המשולב בחדר הקר ° C 4 O / N. ההערה: הטמפרטורה הקרה היא טובה ביותר עבור המסת האבקה מלאה. אם הפתרון אינו ברור לאחר לילה אחד, ומערבבים במשך יום עבודה נוסף ו / או O השני / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר בועות אוויר מן methylcellulose 2% / E3 / tricaine פתרון, aliquot את התערובת לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל ספין במהירות גבוהה (12,000 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או עד 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פתרון 2% methylcellulose / E3 / Tricaine ב 4 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. הערה: לפני השימוש, aliquots צריך להיות מחומם מראש ל RT לעבודה עם דגימות דג הזברה. </li></ol> 2. הכנת כלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן כלי מניפולטור העובר, המשמש positioning עובר microinjection, על ידי הצמדת טיפ טעינת ג&#39;ל על קצה מחט לנתח 5 &quot;ישר, ובטוח עם קלטת או דבק מגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מחטי microinjection באמצעות חולץ מחט, על ידי הנחת ראשון אש מלוטשת 10 זכוכית בורוסיליקט סנטימטר עם נימה לתוך המכשיר ולאבטח את הזכוכית בורוסיליקט ידי הידוק הידיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את זכוכית בורוסיליקט לעצב מחטים דקות-מחודדות. השתמש בהגדרות הבאות: מחממים 540, למשוך 245, מהירות 200, וזמן 125. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטי מקום בתוך צלחת פטרי, השעיית אותם על רצועת פלסטלינה כדי להגן על טיפי מחט, ולשמור את הכלי הסגור למניעת הצטברות אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסיים להכין את המחט עבור microinjections, להשתמש בסכין גילוח או מלקחיים בסדר קצה לחתוך את קצה משך של המחט כדי ליצור טיפ הזרקת זוויתי חד בקוטר של כ 0.05-0.1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מגש microinjection, להכין פתרון 1.5% agarose / E3 בתוך 100 מ&quot;ל בבקבוק Erlenmeyer ו לפזר את agarose על ידי חימום E3 לרתיחה במיקרוגל ואז להתקרר ב RT במשך כ -10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון agarose / E3 מקורר לתוך צלחת פטרי כדי להפוך בסיס עם עומק של כ -0.5 ס&quot;מ. כאשר זה יש הקרושה לשפוך שכבה שנייה עם עומק של כ 0.3 סנטימטרים ולהכניס את התבנית היטב עובר הטרומית ולאפשר agarose כדי לחזק ב RT. הערה: כאשר מכניסים את התבנית לתוך השכבה אגר העליון / E3, הצבת את התבנית לתוך אגר בזווית כדי להקטין את מספר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מגש microinjection כולו קבע, להרים את העובר הטרומי גם לעצב לאט ובזהירות באמצעות scoopula, ולאחר מכן למלא את המנה עם פתרון ולאחסן E3 על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. עובר כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת טנקי הזדווגות דג זברה על ידי הצבת מחיצות לתאי הזדווגות וממלאת במי מערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים דג אחד בכל צד של המחיצה שלuch כי כל תא מכיל הזדווגות נקבה אחד ודגי זכר אחד, ומכסה כל תא הזדווגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להסיר את המחיצות כדי לאפשר השרצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הדגים לאחר כ -30 דקות, ולאחר חזרת המבוגרים לאקווריום, לאסוף העוברים שלהם על ידי העברת מי טנק הזדווגות באמצעות כלי מסננת מתכת-רשת בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המסננת מעל צלחת פטרי ולשטוף עם E3 לאסוף את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים על 28.5 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עוברים הגיעו 24-26 somite שלב 26, למזוג רוב כלי התקשורת E3 ואז dechorionate על ידי הוספת 100 μl של 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל pronase על כל מנה של עוברים דוגרים צלחת ב RT (23 מעלות צלזיוס) במשך כ 15 דקות. הערה: זה ייקח כ 24-25 שעות מרגע הפריה כלפי העובר להגיע לשלב 24-26 somite אם הם נאספים באופן מתואר וטופח O / N ב 28.5 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצלחת עםE3 ולאחר מכן מערבולת בעדינות כדי לסלק את chorions מן העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג E3 / pronase ולשטוף את המנה עם 25 מיליליטר של E3 הטרי. צעד לשטוף חזור להסיר את כל pronase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור התפתחות פיגמנטציה, למזוג E3 ולהחליף עם 25 מ&quot;ל של טרי E3 / PTU כאשר עוברים הגיעו 24 שעות שלאחר ההפריה. הערה: בניסויים פורשים כמה ימים, להחליף את פתרון E3 / PTU עם תקשורת טריה פעם ביום כדי לשמור על הצלחת נקיה. </li></ol> 4. Microinjection של פתרון Nephrotoxin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הזרקה, להכין את פתרון nephrotoxin הרצויה יחד עם השליטה ברכב המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס או ומערבבים בעדינות כדי להבטיח את התרופה (ים) הוא / הם בתמיסה, בדיקת צידי הצינור העליון של עמודת המים. הערה: פתרונות Nephrotoxin ניתן להכין להכיל כמויות זעירות של dextran מצומדות fluorescently לפקח יעילות microinjection וגם להעריך פינוי כלייתי ב subseqזמן uent מצביע 20,28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מחט microinjection גזוז עם ~ 2-3 μl של nephrotoxin ידי השחלה טיפ טעינת ג&#39;ל בסדר לחלק האחורי של המחט להשעות את המחט בצורה אנכית עם חתיכת סרט לאפשר הפתרון למלא את קצה המחט גזוז על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שקצה המחט מלא, לאבטח את המחט הטעונה micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את נפח microinjection ידי הצבת טיפה של שמן מינרלי לשקופית מיקרומטר ולהזריק לתוך השמן כדי להעריך את גודל טיפה. נפח הזרקה של 500 pl בעל קוטר של 0.1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את המאפה של עוברים מן החממה, להרדים ידי הוספת כ 5 מ&quot;ל של Tricaine 0.2% כדי בצלחת העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח הרדמה מלאה, לגעת העובר בעדינות עם קצה של כלי מניפולטור העובר. חוסר התנועה מצביע הרדמה מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה מוצלחת, להעביר עובר אל עובש ההזרקה עם transfפיפטה אה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמרן כל עובר לתוך באר שונה של עובש נחת הראש באזור העמוק ביותר של כאלה היטב כי המטען נח לאורך השקע ואת הזנב מזדקר אל מחוץ למיתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט המלאה לתוך micromanipulator ומקם את קצה המחט ליד עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות את המחט לתוך כלי הזנב על ידי הזזת הג&#39;ויסטיק קדימה על דוושת הרגל כדי לספק את microinjection. הערה: זריקה מוצלחת תעיד על ידי צפייה הנוזל להיכנס במחזור. יתר על כן, שיתוף הזרקה של nephrotoxicant עם dextran מצומדות fluorescently מאפשרת לחוקר לאמת זריקה מוצלחת לאחר ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות בחזרה על הג&#39;ויסטיק כדי להוציא את המחט מן העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, להעביר את העוברים כדי בצלחת נקיה ולשטוף להסיר את Tricaine ולהחליף עם E3 טרי / PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה העובר לנקודת הזמן הרצוי כדי ישבניםמורפולוגיה של, אשר יכול להיות מתועד על ידי צילום תקשורת הרכבת methylcellulose, או תהליך לניתוח הניסיון כרצונכם. הערה: שחזור של עוברים יש לבחון כדי לקבוע את אחוז האנשים עם בצקת, אשר מציינת פגיעת כלייתית נפוצה. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מספר רחב של סוכנים טיפוליים קושר עם AKI 29. היו מקדמות מחקר משמעותי בהבנת הנזק הנגרמת על ידי תרכובות בודדים רבים, כגון גנטמיצין aminoglycoside 30 ו ציספלטין כימותרפיות בשימוש נרחב 31,32. שינויים פתולוגיים מסוימים מעורבים בתנאים אלה, עם זאת, להישאר בנושא של מחקר מתמשך. אתגר המתהווה אחת נותר הבנה כיצד תרופות מרובות להשפיע לרעה חולה, במיוחד אלה באוכלוסיות בסיכון גבוה כגון אלה במסגרות טיפול נמרצות ואת 29 הקשישים. לפיכך, מודלים המאפשרים מחקרי...

AKI הוא אובדן פתאומי של בתפקוד הכליות, אשר יכול להוביל לתוצאות הרסניות לבריאות 1. AKI הוא נושא בריאות משמעותי ברחבי העולם בשל שכיחותה הגבוהה של כ -20% בקרב חולים מאושפזים, עם אף גבוהים יותר שיעורים 30-50% במקרים בטיפול נמרצים והקשישים, ושיעורי תמותה של 50-70% 1-3. למרבה הצער, השכיחות של AKI גדלה והוא צפוי להסלים עוד יותר בעשור הקרוב, בין שאר כתוצאת המגוון של גורמים שיכולים לגרום AKI, הכולל שלאחר ניתוח מתח, איסכמיה, וחשיפת nephrotoxins כגון אנטיביוטיקה תרופות כימותרפיות 4. AKI כרוך ניזק לתאים פתאומי בתוך הכליה, שכיח ב nephrons, שהן היחידות הפונקציונליות החיוניות, והם מורכבים של מסנן דם וכן אבובית מפולחת המנקזת שתנו לתוך צינוריות איסוף מרכזיות 1. כאשר מספר לא מבוטל של nephrons הואניזוק במהלך AKI, ההשפעות המיידיות כוללות הפרעה בסילוק פסולת מהמחזור, ואת זרימת נוזל מופחת או בוטלו באמצעות nephrons עקב חסימה מתאי מתים וגוססים 1. במשך הזמן, חסימה צינורי יכול להוביל לניוון של nephrons כולו, אשר מפחית 1 תפקוד כלייתי לצמיתות. שינויים פיסיולוגיים הכליה הבאה AKI גם הקשורות בתופעות דלקתיות מורכבות שיכולים להוביל צלקות כרוניות 1. למרות התוצאות הללו, nephrons יש כמה היכולת לעבור התחדשות לאחר AKI כי reconstitutes 5,6 אפיתל צינורי. אמנם יש כבר הבנה מולקולרית גדל והולך של התחדשות נפרון, המנגנונים להישאר חמקמקה לגבי רבים מחייבים המשך חקירה 7. המידה שבה AKI גורם לנזק כלייתי קבע גם נותר עלום. המחקר הנוכחי מצביע על פוטנציאל ההתחדשות עבור הכליה הואגבוה ביותר בעקבות מקרים חמורים פחות של AKI, בעוד יותר פרקים בולטים או חוזרים להוביל מחלת כליות כרונית (CKD) ותסתיים ב סופנית מחלת כליות (ESRD) הדורש השתלת מצילות חיים או דיאליזה 8,9. בנוסף, אנשים שכבר סובלים CKD נמצאים בסיכון גבוה עוד יותר להידבקות פרק חמור של AKI 8,9. יחדיו, ברור שהמשך מחקר בסיסי וקליני חיוני להבין, לטפל ולמנוע AKI. מחקר במודלים של בעלי חיים כבר סייע להעריך את ההתקדמות של שינויים מקומיים וסביבתיים המתרחשים במהלך AKI 10. כדי להרחיב את ההבנה הזאת, כמו גם לפתח טיפולים חדשים, במודל חיה דג הזברה כבר המועסקים במגוון דרכים 11,12. Nephrons של הכליה דג הזברה, בשני העובר מבוגר, להציג רמה גבוהה של שימור עם יונקים 13-16. יתר על כן, פגיעה אפיתל נפרון ב zebrafish דומה לתהליך חוליות גבוהות, לפיה ההרס המקומי של תאים צינורי ואחריו התפשטות intratubular ואת הקמתה מחדש של נפרון אדריכלות 17-19. בעובר, אולם ניזק אבובית נרחב מן nephrotoxins כמו ציספלטין קשור קטלני 20,21. לשם השוואה, מבוגרי דג זברה לשרוד AKI ולהציג יכולות משובים מהותיות הכליות. כך למשל, בעקבות החשיפה גנטמיצין אנטיביוטי aminoglycoside, דג הזברה להתחדש נזק אפיתל אבובית ולגדול יחידות נפרון חדשים וכן 22-24. בעוד גנטמיצין הנגרמת אלה מחקרים AKI סיפקו מידע שלא יסולא בפז, להבנת נזק כלייתי מ nephrotoxins מגוונים נותר קריטי להעריך את ההשפעות בתגובה סוגים שונים של נזק 25. עובר דג הזברה, בשל גודלו, שקיפות עקיבות גנטיות, יש יתרונות רבים ללימודי nephrotoxin &lt;sup&gt; 25, שבהם השיטה של microinjection 20,21 משמשת לניהול המולקולה (ים) לחקירה. Nephrons נוצרות על ידי הפריה 24 שעות שלאחר (hpf) ומתחילים לסנן דם בכ 48 hpf 26,27. לפיכך, ההיווצרות המהירה והתפקוד של הכליה העוברית מאפשרים ניתוח הניסיון. עם זאת, תהליך של microinjection יש אתגרים טכניים ויש יכול להיות עקומת למידה תלולה מאסטרינג טכניקה. במאמר זה וידאו, אנו מתארים כיצד לבצע microinjections ולספק עצות לפתרון בעיות כדי להגביר את שיעור זריקות מוצלחות.

<table><tbody><tr><td>נתרן כלורי</td><td>AB01915</td><td></td><td>ביואנליטי אמריקאי</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>AB01652</td><td></td><td>ביואנליטי אמריקאי</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>AB00366</td><td></td><td>ביואנליטי אמריקאי</td></tr><tr><td>N-פנילתיאוריאה (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט (טריקאין)</td> <td>פלוקה אנליטי</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה בוער/חום</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>פלקון צלחות פטרי חד פעמיות, סטרילי, קורנינג:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>60 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>ברקוד 25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;( מגש מיקרו-הזרקה) 150 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור בטמפרטורה נמוכה</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו ניתוח פינצטה</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומטר</td><td>טד פלה, בע"</td>מ<td>2280-24</td><td></td></tr></tbody></table>

nephrotoxin microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

הכליות הן רגישות לפגוע מחשיפה לכימיקלים שהם לסנן ממחזור הדם. זה יכול להוביל לפציעת איבר הקשורים ירידה מהירה בתפקוד הכלייתי ופיתוח של התסמונת הקלינית המכונית אי-ספיקת כליות חריפה (AKI). סוכנים תרופתיים המשמשים לטיפול נסיבות רפואיות החל זיהום חיידקים לסרטן, כאשר מנוהלים בנפרד או בשילוב עם תרופות אחרות, יכולים ליזום AKI. דג זברה היא מודל חיה כדאי ללמוד את ההשפעות הכימיות על תפקוד כלייתי in vivo, כפי שהם יוצרים כליה עוברית המורכבת מיחידות פונקציונליות נפרון כי הם משומרים עם חוליות גבוהות, כולל בני אדם. יתר על כן, דג זברה יכול להיות מנוצל כדי לבצע מסך גנטי וכימי, המספק הזדמנויות להבהיר את ההיבטים התאיים ומולקולריים של AKI ולפתח אסטרטגיות טיפוליות כגון זיהוי של מולקולות כליה. הנה, אנחנו מדגימים microinjection איך לתוךעובר דג זברה יכול להיות מנוצל כפרדיגמה מחקרי nephrotoxin.

תחנת microinjection להגדיר כולל סטראו, micromanipulator ו ווסת לחץ (איור 1 א). שקוף של צלחת ההזרקה עדיפה להציג דגימות במהלך הליך זה (איור 1 ב). הכנת מחט הזריקה כרוכה משייכת הזכוכית בורוסיליקט המתאימה, ולאחריו הכנת הקצה עם חיתוך ולבסוף חזרה טעינה את המחט. באופן אופטימלי, קצה המחט הוא משופע ולא להקהות (התרשים 1C), חתך כי נעשה על ידי לדוג הקצה חד של מכשיר החיתוך, כגון מלקחיים בסדר, במהלך הליך החיתוך <...

פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשתמש בדגי zebrafish כדי לצפות בהשפעתם של נפרוטוקסינים (רעלים לכליות), כגון gentamicin או cisplatin, לצורך מידול של פגיעה כלייתית חריפה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמודל ה-zebrafish מאפשר דימות בזמן אמת של נזק תאי והתחדשות לאחר פגיעה כלייתית חריפה. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו כלי למניפולציה של עוברים לצורך מיקום העוברים להזרקה מיקרוסקופית, על ידי הצמדת טיפ להטענת ג'ל לקצה של מחט דיסקציה ישרה באורך חמישה אינץ', והדביקו אותה בעזרת סרט דבק או דבק מהיר.בשלב הבא, הכינו מחטי מיקרו-הזרקה דקות ומחדדות על ידי משיכת זכוכית בורוסיליקט שעברה ליטוש באש באמצעות פילמנט ומושך פיפטות. לאחר מכן, השתמשו בלהב תער או בקצה של פינצטה עדינה כדי לחתוך את קצות המחטים וליצור קצוות הזרקה זוויתיים וחדים. לאחר מכן, הניחו את המחטים על רצועה של חימר פיסולי בתוך צלחת פטרי כדי להגן על קצות המחט.להכנת מגש המיקרו-הזרקה, הכינו תמיסת agarose E3 בריכוז 1.5% בבקרחון ארלנמייר של 100 מילליטר על ידי המסת ה-agarose ב-E3 במיקרוגל. לאחר מכן, המתינו לתערובת להתקרר בטמפרטורת החדר למשך כעשר דקות. שפכו את תמיסת ה-agarose E3 שהתקררה אל תוך צלחת פטרי כדי ליצור בסיס בעומק של כ-0.5 סנטימטרים.לאחר שהתמיסה התגבשה, שפכו שכבה שנייה של תמיסת agarose E3. לאחר מכן, הכניסו את תבנית בארי הלעוזים המוכנה אל תוך האגר, בזווית שתמנע היווצרות בועות אוויר, והמתינו להתגבשות האגר בטמפרטורת החדר. לאחר שכל מגש המיקרו-הזרקה התגבש, הסירו את תבנית בארי הלעוזים לאט ובזהירות, מלאו את הצלחת בתמיסת E3 ואחסנו בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס.בנוהל זה, הכינו את מיכלי ההזדווגות של דגי הזברה על ידי הצבת מחיצות בתוך תאי ההזדווגות ומילוי במים מהמערכת. לאחר מכן, הניחו דג אחד בכל צד של המחיצה, כך שבכל תא הזדווגות יהיו נקבה אחת וזכר אחד, וכסו את שני תאי ההזדווגות. בבוקר למחרת, הסירו את המחיצות כדי לאפשר את השפירה.לאחר כ-30 דקות, בדקו אם קיימים עוברים בתחתית המיכל. לאחר מכן, החזירו את הדגים לאקווריום ואספו את העוברים שלהם על ידי העברת מי מיכל ההזדווגות דרך מסננת רשת סבב דקה. לאחר מכן, הפכו את המסננת מעל צלחת פטרי ושטפו אותה ב-E3 כדי לאסוף את העוברים.לאחר מכן, הדגרי את העוברים בטמפרטורה של 28.5 °C למשך הלילה. כאשר העוברים מגיעים לשלב של 24 עד 26 סומיטים, שפכי את רוב מצע ה-E3. לאחר מכן, בצעי דה-כוריון על ידי הוספת מצע E3, ולאחר מכן 100 µL של pronase בריכוז 50 mg/mL לכל צלחית עוברים, ולאחר מכן הדגרי את העוברים בטמפרטורה של 28 °C למשך 15 דקות.לאחר 15 דקות, מלאו את הצלחת ב-E3 ולאחר מכן סובבו אותה בעדינות כדי להפריד את הכוריון מהעוברים. לאחר מכן, שפכו את ה-E3 עם הפרונאז ושטפו את הצלחת ב-25 milliliters של E3 טרי. כדי למנוע התפתחות של פיגמנטציה, החליפו את ה-E3 ב-25 milliliters של E3 PTU טרי 24 שעות לאחר ההפריה. עבור ניסויים הנמשכים מספר ימים, החליפו את תמיסתו של ה-E3 PTU במצע טרי פעם ביום כדי לשמור על ניקיון הצלחת.ביום ההזרקה, הכין את תמיסת הנפרוטוקסין הרצויה עם בקרת הנשאי התאים (vehicle control) המתאימה. ערבב בעזרת וורטקס או ערבוב עדין. לאחר מכן, בדוק את דפנות המבחנה ואת חלקו העליון של עמוד הנוזל כדי לוודא שהתרופות מומסות בתמיסה.מלאו מחט מיקרו-הזרקה קצוצה עם שני עד שלושה מיקרוליטרים של נפריטוקסין (nephrotoxin) על ידי ה prestataire של קצה טעינת ג'ל דק לחלק האחורי של המחט, ותלו את המחט בצורה אנכית בעזרת רצועת דבק כדי לאפשר לתמיסה למלא את קצה המחט הקצוץ באמצעות כוח הכבידה. ברגע שקצה המחט מלא, אחרו את המחט הטעונה במיקרו-מניפולטור. בדקו את נפח המיקרו-הזרקה על ידי הנחת טיפה של שמן מינרלי על תיתור מיקרומטרי והזרקה לתוך השמן כדי להעריך את גודל הטיפה.בשלב הבא, הוצא את צלחון העוברים מהאינקובטור והרדם אותם על ידי הוספה של five milliliters של 0.2% tricaine לצלחון העוברים. לאחר מכן, העבר את העוברים לתבנית ההזרקה באמצעות פיפטת העברה. מקם כל עובר בבאר נפרדת של התבנית, כאשר הראש נמצא באזור העמוק ביותר של הבאר, כך שהגוף נח לאורך השקע והזנב בולט מעט החוצה.כעת, הכניסו את המחט המולאה לתוך המיקרו-מניפולטור ומקמו את קצה המחט לצד עובר. הכניסו בעדינות את המחט אל תוך וריד הזנב לצורך הזרקה מיקרוסקופית. השלב הקריטי ביותר בפרוצדורה הוא ההזרקה המיקרוסקופית.כדי להבטיח הצלחה, יש לחתוך את המחט בזווית חדה, ויש להזיזה בזהירות למיקומה לצד העובר. אם ההזרקה הצליחה, ניתן יהיה לראות את הנוזל חודר למחזור הדם. הזרקה משותפת של הרעל הכליתי עם דקסטרין מצומד למסמך פלואורסצנטי תאפשר לחוקר לוודא את הצלחת ההזרקה לאחר הפרוצדורה.לאחר מכן, הוצא בעדינות את המחט מהעובר. העבר את העובר לצלחית נקייה ושטוף כדי להסיר את ה-tricaine באמצעות E3 PTU טרי. לאחר מכן, דגור את העובר עד לנקודת הזמן הרצויה כדי להעריך את המורפולוגיה, שניתן לתעד באמצעות צילום במצע עיגון של מתיל תרגול (methyl cellulose).או עבדו לצורך ניתוח ניסיוני לפי הרצונכם. שימו לב כי יש להעריך את התאוששות העובריים כל 12 עד 24 שעות לאחר ההזרקה כדי לקבוע את אחוז הפרטים עם בצקת, המעידה בדרך כלל על פגיעה כלייתית. השקיפות של עוברי zebrafish מקלה על הליך המיקרו-הזרקה ויש להגבירה עוד יותר באמצעות טיפול כימי ב-PTU ב-24 hpf, כדי להפחית את התפתחות הפיגמנטציה במהלך מהלך ניסיוני טיפוסי.בשלב זה, ניתן לדגימי העוברים להתפתח עד לשלב ה-72 hpf, ולאחר מכן הם עברו הזרקה דמה (mock injection), הזרקה מיקרוסקופית של תמיסת מלח (saline vehicle), או הזרקה מיקרוסקופית של 2.5 mg/mL gentamicin. תצפית המשכית בחיים בוצעה יום ויומיים לאחר ההזרקה, תוך שימוש בתאורה של תאורה נגדית (transillumination) באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. בהשוואה לעוברים שעברו הזרקת דמה או הזרקת תמיסת מלח, רק הפרטים שהוזרקו ב-gentamicin הראו התפתחות של בצקת.במקרה זה, בצקת פריקרדיאלית המצביעה על ביטול תפקוד כליות תקין, באופן העולה בקנה אחד עם תצפיות שפורסמו בעבר. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון היברידיזציית C2 של דגימה שלמה (whole mount), על מנת לבחון שינויים בביטוי גנים לאחר חשיפה לרעלן כליות (nephrotoxin).

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים טכניקה של microinjecting aminoglycoside, גנטמיצין, תוך 2 ימים שלאחר fetilization (DPF) הזחלים דג הזברה לגרום לפציעה כליות חריפה (AKI). כמו כן, אנו מתארים שיטה אימונוהיסטוכימיה הר שלמה, פלסטיק הטבעה ואת חתך של הזחלים דג הזברה לדמיין את הנזק בתיווך AKI.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

נזק כלייתי אקוטי (AKI) בבני אדם היא בעיה קלינית נפוצה נגרמת על ידי נזק לתאי האפיתל המרכיבים nephrons כליות, AKI קשור עם שיעורי תמותה גבוהים של 5-70% 1. לאחר חורבן תא אפיתל, nephrons יש יכולת מוגבלת להתחדש, אם כי המנגנונים והמגבלות המנחים את התופעה הזאת להישאר ממעטים להבין. במאמר זה וידאו, אנחנו מתארים את הטכניקה שלנו אבלציה לייזר ממוקד של תאים נפרון כליה כליות העובר דג הזברה, או כלית ראשית. השיטה החדשה שלנו יכול לשמש כדי להשלים nephrotoxicity-Induced דגמים של AKI ולהשיג הבנה ברזולוציה גבוהה של...

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

סרטון זה מדגים מיקרו-הזרקה תוך ורידית של נפרוטוקסינים לווריד הזנב של עובר דג זברה כדי לחקור את ההשפעות הכימיות שלהם על תפקוד הכליות.

מיקרו-הזרקה תוך ורידית של נפרוטוקסינים לעובר דג זברה: טכניקה להעברת חומרים נפרוטוקסיים לזרם הדם של עובר דג זברה

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

כאן אנו מציגים שיטה אמינה לחקר התחדשות כליות במבוגרים על ידי גרימת פגיעה כלייתית חריפה על ידי הזרקת גנטמיצין. אנו מראים כי הפציעה תלויה במינון הגנטמיצין ובטמפרטורת הסביבה באמצעות הכלאה באתרה כדי לתייג lhx1a+ מפתח נפרונים חדשים.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לגרום לפגיעה בכליות חריפה (AKI) ב זברה-דג מבוגר באמצעות ציספלטין כסוכן נטרוקסי. פירטנו את השלבים כדי להעריך את הרבייה של הטכניקה ושתי טכניקות לניתוח דלקת ומוות תאים ברקמת הכליה, ציטומטריית זרימה ו- TUNEL, בהתאמה.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

למד מיקרו-הזרקת נפרוטוקסינים ב-Danio rerio למידול אי-ספיקת כליות חריפה. שיטה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של נזק תאי ותהליכי התחדשות בכליות.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

גלה סרטונים נוספים