בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד שתי אוכלוסיות נפרדות של תאי מוצא פרי-וסקולריים (perivascular) רב-פוטנציאליים מרקמת לב אנושית. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום התחדשות הלב, כגון התרומה של תתי-אוכלוסיות של תאי הפרי-וסקולריות לתהליך זה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם קבלת אוכלוסיות של תאי מוצא בעלות הומוגניות גבוהה יותר וחיוניות משופרת בהשוואה למספר טכניקות הפרדה סטנדרטיות.

לטכניקה זו עשויות להיות הש implying לטיפול במחלה איסכמית של הלב, מכיוון שהוכח כי לסוגי תתי-תאים של תאי גזע פרי-וסקולריים (perivascular) יש פוטנציאל קרדיומיוגני. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקידם של תאים פרי-וסקולריים ברגנרציה של הלב, היא יכולה להיות מיושמת גם לחקירת היבטים אחרים של מחלות לב, כגון פיברוזיס של השריר הלבבי (myocardial fibrosis). באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקושי בשל הצורך בשימוש בתאים חיוניים, הנובע מדרישה לטריות הרקמה.

כדי להתחיל בהליך זה, לאחר הסרת הפריקרד, כלי הדם הגדולים והעליות, הניחו את הדגימה בתמיסת שטיפה בתוך צלחת פטרי. לאחר מכן, חתכו את שריר הלב הפרוקטוריאלי לחתיכות קטנות של בערך מילימטר מעוקב אחד ועבדו אותן מיד כדי להשיג את תפוקת התאים הגבוהה ביותר. לאחר מכן, הכינו תמיסת עיכול טרייה וחממו אותה ל-37 °C במקלח מים.

לאחר מכן, סננו את חתיכות הרקמה התלויות דרך מסננת של 100 micron ושטפו אותן פעמיים עם PBS. העבירו את חתיכות הרקמה למכל סטרילי של 30 milliliter עם מכסה אטום היטב. הוסיפו את תמיסת העיכול והניחו את המכל בתוך שקית פלסטיק אטומה במקלחית נערת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius המכוונת ל-120 RPM.

לאחר 15 דקות, הפכו את המכל שלוש פעמים. לאחר מכן, החזירו אותו לאמבט המים למשך 15 דקות נוספות. לאחר מכן, הוציאו את המכל ועצרו את פעילות הקולגנאזות באמצעות חמישה מיליליטר של DMEM המועשר ב-20% FBS.

לאחר מכן, בצעו טריטורציה (trituration) לרקמה שעברה עיכול על ידי פיפטור עדין 10 עד 20 פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 milliliters כדי לפרק גושי רקמה. לאחר מכן, סננו את התוך-סלולארית (suspension) באופן רצופי דרך מסנני תאים של 100 micron, 70 micron, ולבסוף 40 micron, כדי לקבל תמיסת תאים בודדים. לאחר מכן, סבבו את תמיסות התאים בצנטריפוגה במהירות של 200 x g למשך ארבע דקות.

שפוך בזהירות את הנוזל העליון ותלה את המשקע במילליטר אחד של תמיסת ליזיס לתאי דם אדומים למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, לפני הדילול בארבעה מילליטרים של תמיסת שטיפה. חזור על שלב הסנטריפוגה ותלה את המשקע במילליטר אחד של תמיסת שטיפה. דלל 10 µl של תרחיף התאים עם 90 µl של תמיסת שטיפה כדי להכין דילול של 1:10 של תרחיף התאים.

ערבב 10 µL של תרחיף התאים המדולל עם 10 µL של צבע trypan blue והנח 10 µL מהתערובת על hemocytometer סטנדרטי לספירת תאים. בהליך זה, הוסף 50 µL של סרום עכבר לתרחיף התאים והדגר אותו בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות כדי לחסום קישור לא ספציפי של נוגדים. לאחר מכן, סבב את תרחיף התאים בצנטריפוגה ב-200 x g למשך ארבע דקות.

הסיר את העליון (supernatant) ושחזר את התאים בתוך מדיום שטיפה. לאחר מכן, העבר מניה של 50 microliters של תגלי השטח לכל אחד משני נבובות הפוליסטירן בעלות התחתית העגולה המיועדות לציטומטריה זרימה עבור בקרת האיזוטייפ והבקרות ללא צביעה, והעבר את השארית לנבובת שלישית עבור צביעה רב-צבעית. הוסף חמישה נוגדנים לתגלי התאים הבודדים לצורך צביעה רב-צבעית.

ערבבב בעדינות באמצעות פיפט את הנוגדנים עם התאים והדגרה את כל המבחנות בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות בחושך. הכן את חרוזי בקרת הפיצוי (compensation control beads) על ידי הוספת טיפה אחת של חרוזי חיוביים ל-100 µL של תמיסת שטיפה בחמש מבחנות לציטומטריה זרימה. הוסף את הנוגדנים באופן נפרד לכל אחת מחמש המבחנות.

לאחר מכן, הדגרו את כל המבחנות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך. בינתיים, הכינו מבחנות לאיסוף תאים, שכל אחת מהן מכילה 500 microliters של מצע גידול EGM-2, והניחו אותן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגרת הנוגדנים, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת שטיפה כדי לשטוף את התאים והחרוזים במטרה להסיר נוגדנים שאינם קשורים.

סבבו את כל המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 200 x g למשך ארבע דקות. חזרו על שלבי השטיפה והסבב בצנטריפוגה וסננו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, השעיו את התאים במדיום שטיפה בריכוז של 1 × 10⁶ תאים ל-250 µL.

לאחר מכן, השעו שוב את החרוזים ב-100 microliters של תמיסת שטיפה. העבירו את תרחיפי התאים והחרוזים לממיין התאים על קרח ובחושך. הוסיפו טיפה אחת של חרוזים שליליים למבחנות בקרת הפיצוי של החרוזים החיוביים והשתמשו בהן כדי לקבוע את פיצוי הפלואורסצנציה.

לאחר מכן, הרץ את תאי הבקרה ללא צביעה כדי לקבוע את פלואורסצנציית הרקע ולהגדיר את המתחים. לאחר מכן, הרץ את האיזוטייפים של הבקרות כדי לקבוע את ספי פלואורסצנציית הרקע הקשורים לקשירה לא ספציפית. הרץ את הדגימה הצבועה בריבוי צבעים ואסוף את אוכלוסיות התאים הפריציטים והתאים האדוונטיציאליים אל מבחנות האיסוף.

בנוהל זה, הוסיפו 100 µL של תמיסת ג'לטין סטרילית בריכוז 0.2% לכל סמ"ר של שטח גידול, ונערה ידנית כדי לצפות את כל שטח הבארים. לאחר מכן, דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסירו את תמיסת הג'לטין לחלוטין.

שמרו את התאים שנאספו על קרח בזמן הכנת פלטות התרבית. לאחר מכן, סבבו את התאים שנאספו זה עתה בצנטריפוגה במהירות של 200 x g למשך ארבע דקות, וסספנדו בעדינות את משקע התאים בכמות מתאימה של EGM-2. לאחר מכן, זרעו את התאים על הפלטות המצופות בג'לטין.

בדמות זו, תאים חיים סוננו (gated) תחילה כדי להחריג תאים חיוביים ל-CD45, ולאחריהם תאים חיוביים ל-CD56. לאחר מכן, תאי אנדותל חיוביים ל-CD144 הוסרו מהfracc-שלילי ל-CD56. מאוכלוסייה סופית זו, נבחרו ונאספו פריציטים (pericytes) חיוביים ל-CD146 ושליליים ל-CD34, ותאי adventitial שליליים ל-CD146 וחיוביים ל-CD34.

שתי תרביות של פריציטים מיוקרדיאליים ותאי אדוונטיציה שזוהרו ב-FACS מראות מורפולוגיה של תאים בעלי צורה של כישוף או כוכב. לאחר רכישת המיומנות, ביצוע טכניקה זו ייקח כחמש שעות, אם תבוצע כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שדגימות טריות יותר יספקו את התוצאה הטובה ביותר של תאים חיוניים.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון קרדיומיופלסטית תאית, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון התאמת תאים אלו לטיפול במחלה איסכמית של הלב.