בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד שתי אוכלוסיות נפרדות של תאי מבשר פריוסקולרי רב-פוטנטיים מרקמת לב אנושית. שיטה זו עשויה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התחדשות הלב, כגון התרומה לתהליך זה על ידי תת-קבוצות של אוכלוסיית התאים הפרי-וסקולריים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מביאה לאוכלוסיות של תאי אב עם הטרוגניות מופחתת ושיפור הכדאיות של מבחר טכניקות הידבקות עיקריות.

לטכניקה זו יש השלכות בטיפול במחלת לב איסכמית מכיוון שהוכח כי תת-סוגים של תאי גזע פרי-וסקולריים הם בעלי פוטנציאל קרדיו-מיוגני. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקידם של תאים פריוסקולריים בהתחדשות הלב, ניתן ליישם אותה גם לחקירת היבטים אחרים של מחלות לב, כגון פיברוזיס בשריר הלב. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל שימוש בר-קיימא בתאים כתוצאה מרעננות הרקמות.

כדי להתחיל בהליך זה, לאחר הסרת קרום הלב, כלי הדם העיקריים והפרוזדורים, הניחו את הדגימה במדיום כביסה בצלחת פטרי. לאחר מכן, חותכים את שריר הלב החדר לחתיכות קטנות של כמילימטר מעוקב אחד ומעבדים אותם מיד כדי להשיג את תפוקת התאים הגבוהה ביותר. לאחר מכן, הכינו תמיסת עיכול טרייה וחממו אותה ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים.

לאחר מכן, סנן את חלקי הרקמה התלויים דרך מסננת של 100 מיקרון ושטוף אותם פעמיים עם PBS. העבירו את חתיכות הרקמה למיכל סטרילי של 30 מיליליטר עם מכסה אטום היטב. הוסיפו את תמיסת העיכול והניחו את המיכל בתוך שקית ניילון אטומה באמבט מים רועדים של 37 מעלות צלזיוס המוגדר ל-120 סל"ד.

לאחר 15 דקות, הפוך את המיכל שלוש פעמים. לאחר מכן, החזירו אותו לאמבט המים למשך 15 דקות נוספות. לאחר מכן, הסר והרוה את הקולגנאזות עם חמישה מיליליטר DMEM בתוספת 20% FBS.

לאחר מכן, יש לשלש את הרקמה המעוכלת על ידי פיפטה עדינה 10 עד 20 פעמים עם פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לפרק את כל גושי הרקמה. לאחר מכן, סנן את המתלה ברצף דרך מסנני תאים של 100 מיקרון, 70 מיקרון, ולבסוף, מסנני תאים של 40 מיקרון כדי לקבל תרחיף תא יחיד. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא ב-200 x גרם למשך ארבע דקות.

יש לשפוך בזהירות את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר כדוריות אדומות למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר לפני שמדללים אותו בארבעה מיליליטר של חומר כביסה. חזור על שלב הצנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום כביסה. יש לדלל 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם 90 מיקרוליטר של אמצעי כביסה כדי לבצע דילול של 1 עד 10 של תרחיף התאים.

מערבבים 10 מיקרוליטר מתרחיף התאים המדולל עם 10 מיקרוליטר כתם כחול טריפן ומניחים 10 מיקרוליטר מהתערובת על המוציטומטר רגיל לספירת תאים. בהליך זה, הוסף 50 מיקרוליטר של סרום עכבר לתרחיף התא ודגר אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לחסום קשירת נוגדנים לא ספציפיים. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא ב -200 x גרם למשך ארבע דקות.

הסר את הסופרנטנט והשהה אותו מחדש באמצעי כביסה. לאחר מכן, ציטט 50 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל אחד משני צינורות הציטומטריה העגולים של הזרימה התחתונה מפוליסטירן עבור האיזוטיפ והפקדים הלא מוכתמים והנח את הנפח הנותר בצינור שלישי לצביעה צבעונית. הוסף חמישה נוגדנים לתרחיף התא הבודד לצביעה צבעונית.

פיפטה בעדינות כדי לערבב את הנוגדנים עם התאים ולדגור את כל הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך. הכן את חרוזי בקרת הפיצוי על ידי הוספת טיפה אחת של חרוזים חיוביים ל-100 מיקרוליטר של מדיום כביסה בחמישה צינורות ציטומטריית זרימה. הוסף את הנוגדנים בנפרד לכל אחד מחמשת הצינורות.

לאחר מכן, דגרו על כל הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך. בינתיים, הכינו צינורות איסוף תאים, כל אחד עם 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית EGM-2, והניחו אותם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה של נוגדנים, הוסף חמישה מיליליטר של חומר כביסה כדי לשטוף את התאים והחרוזים על מנת להסיר נוגדנים לא קשורים.

צנטריפוגה כל הצינורות ב 200 x גרם למשך ארבע דקות. חזור על שלבי הכביסה והצנטריפוגה ושפך בזהירות את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים במדיום כביסה בריכוז של אחד כפול 10 עד התאים השישי לכל 250 מיקרוליטר.

לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים ב 100 מיקרוליטר של מדיום כביסה. העבירו את תרחיפי התא והחרוזים לממיין התאים על קרח בחושך. הוסף טיפה אחת של חרוזים שליליים לצינורות בקרת פיצוי החרוזים החיוביים והשתמש בהם כדי להגדיר את פיצוי הקרינה.

לאחר מכן, הפעל את תאי הבקרה הלא מוכתמים כדי לבסס את הקרינה ברקע ולהגדיר את המתחים. לאחר מכן, הפעל את איזוטיפים הבקרה כדי לקבוע את סף הקרינה ברקע הקשור לקשירה לא ספציפית. הפעל את הדגימה המוכתמת בשלל צבעים ואסוף את אוכלוסיות תאי הפריציט וההרפתקאות לתוך צינורות האיסוף.

בהליך זה, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ג'לטין סטרילית של 0.2% לסנטימטר מרובע של שטח הגידול וערבב ידנית כדי לצפות את כל הבארות. לאחר מכן, דגרו את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את תמיסת הג'לטין לחלוטין.

שמור את התאים שנאספו על קרח בזמן הכנת צלחות התרבית. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים הטריים שנאספו ב-200 x גרם למשך ארבע דקות והשעיה בעדינות של כדור התא בכמות מתאימה של EGM-2. לאחר מכן, זרעו את התאים על הצלחות המצופות בג'לטין.

באיור זה, תאים חיים היו מגודרים כדי להוציא תחילה תאים חיוביים ל-CD45 ואחריהם תאים חיוביים ל-CD56. לאחר מכן הוסרו תאי אנדותל חיוביים ל-CD144 מהמקטע השלילי CD56. מתוך אוכלוסייה סופית זו, נבחרו ונאספו פריציטים חיוביים ל-CD146, CD34 שליליים ותאי אדוונטיציאליים שליליים ל-CD146 וחיוביים ל-CD34.

שתי התרביות של פריציטים של שריר הלב המטוהר על ידי FACS ותאי הרפתקאות מציגות ציר למורפולוגיה של תאי כוכב. לאחר שליטה, טכניקה זו תארך כחמש שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהדגימות הטריות ביותר יספקו את התשואה הטובה ביותר של תאים ברי קיימא.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון קרדיומיופלסטיקה תאית, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון התאמה של תאים אלה לטיפול במחלת לב איסכמית.