Name: יישום של מערכת קוהרנטית אנטי סטוקס פיזור ראמאן (CARS) על טי: ספיר OPO לייזר מבוסס תקן לייזר מיקרוסקופ סריקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: למד כיצד ליישם מיקרוסקופיית CARS לדימוי תאים חיים ללא תוויות באמצעות לייזר Ti:sapphire ו-OPO. שיטה זו מאפשרת מחקר ביולוגי ונוירולוגי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד"ר פיליפ קומבט (IES, UM, מונפלייה, צרפת) על השאלת האוסילוסקופ המהיר ולהכיר בתמיכה הכספית מ-Montpellier RIO Imaging (MRI). משאבי אנוש מכירים בכך ש-ANR מעניקה ל-France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) ול-France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) רשתות תשתית לפיתוחים קוהרנטיים של הדמיית ראמאן. עבודה זו נתמכה בעיקר על ידי מענק של מועצת המחקר האירופית (FP7-IDEAS-ERC 311610) ומענק INSERM - AVENIR ל-NT.

<ol><li>Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValeur%2C+B+%22Molecular+Fluorescence%3A+Principles+and+Applications%22">Molecular Fluorescence: Principles and Applications</a>. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+imaging+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA+B%22%5BJournal%5D)">Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy.</a> JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li>
<li>Yelin, D., Silberberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+third-harmonic-generation+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology.</a> Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+Second-Harmonic+Generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).</li>
<li>Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).</li>
<li>Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+imaging+and+scoring+of+collagen+in+fibrotic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues.</a> Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+Instrumentation%2C+theory%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications.</a> J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).</li>
<li>Volkmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+and+microspectroscopies+based+on+coherent+anti-Stokes+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D%3A+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy.</a> J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).</li>
<li>Evans, C. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+chemical+imaging+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).</li>
<li>Mukamel, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMukamel%2C+S+%22Principles+of+nonlinear+optical+spectroscopy%22">Principles of nonlinear optical spectroscopy</a>. , Oxford University Press. New York. (1995).</li>
<li>Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope.</a> Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).</li>
<li>Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vibrational+imaging+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering.</a> Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipid+metabolism+in+live+Caenorhabditis+elegans+using+fingerprint+vibrations%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-scanning+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+and+applications+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology.</a> Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).</li>
<li>Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diffusion+in+the+human+nail+measured+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).</li>
<li>Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+molecular+cutaneous+absorption+in+human+skin+using+label+free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy.</a> J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).</li>
<li>Kano, H., Hamaguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-nonlinear+optical+imaging+of+a+living+cell+using+a+supercontinuum+light+source+generated+from+a+photonic+crystal+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber.</a> Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).</li>
<li>Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+parametric+oscillator-based+light+source+for+coherent+Raman+scattering+microscopy%3A+practical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview.</a> J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106(2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal+platform+for+nonlinear+optical+microscopy+and+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy.</a> Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).</li>
<li>Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Photonics+Rev%22%5BJournal%5D)">Multimodal nonlinear optical microscopy.</a> Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).</li>
<li>Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multimodal+nonlinear+optical+microscopy+reveals+fundamental+insights+of+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development.</a> Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).</li>
<li>Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+imaging+of+atherosclerotic+lesions+using+multimodal+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007(2007).</li>
<li>Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+disease+and+enlightening+biomedicine%3A+Raman+spectroscopy+as+a+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool.</a> Analyst. 138, 3871-3884 (2013).</li>
<li>A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator">http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator</a> (2015).</li>
<li>Ozçelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pals1+is+a+major+regulator+of+the+epithelial-like+polarization+and+the+extension+of+the+myelin+sheath+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves.</a> J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).</li>
<li>Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+saturated+and+unsaturated+lipids+by+wide-field+CARS-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy.</a> Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).</li>
<li>Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+spectra+measurement+of+olive+oil+and+other+vegetable+oils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils.</a> J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).</li>
<li>King, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy%3A+normal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Handb.+Clin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy: normal structure.</a> Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).</li>
<li>Monsma, P. C., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoroMyelin+Red+is+a+bright%2C+photostable+and+non-toxic+fluorescent+stain+for+live+imaging+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin.</a> J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).</li>
<li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).</li>
<li>Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chasing+lipids+in+health+and+diseases+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vib.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).</li>
<li>Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal%2C+3D+in+vivo+imaging+of+sebaceous+glands+by+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy%3A+normal+function+and+response+to+cryotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy.</a> J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

החלק המאתגר ביותר של העבודה הוא סנכרון הזמני של קרני לייזר. זה דורש פוטודיודה מהיר בשילוב עם אוסצילוסקופ מהר, אבל רק חופפים גסים בזמן יכולים להתבצע בהתחלה. ואז התאמה נוספת של כמה ס&quot;מ נדרש. לבסוף, מהלכי מיקרומטר ידי במת תרגום ליניארי מאפשרים ביצוע ההתאמה בסדר הסופי של אורך קו דיחוי על מנת להפעיל את אות CARS. אות זה נשמר בטווח צר של כ -20 מיקרומטר, כפי שנצפו על ידי כוונון כונן מיקרומטר הבמה תרגום. זה מתאים משמרת שיא של הקרן כמחצית המשך הדופק, כלומר, 140 fsec. החפיפה המ...

מיקרוסקופיה אופטית הפכה טכניקה גדולה להדמיה הורסת של תהליכים דינמיים חיים במערכות ביולוגיות עם רזולוצית subcellular. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא כיום בניגוד ההדמיה הנפוץ ביותר בשימוש בתאי חיים בשל סגולי והרגישות 1 הגבוהים שלה. לוח צבעים גדול של בדיקות ניאון התפתח (צבעי אקסוגניים, חלבונים מקודדים גנטי, חלקיקים מוליכים למחצה). טכניקות פלורסנט מבוסס תאורת מדגם שונות פרחו (כגון מיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים) לבצע הדמית 3D וכדי להפחית חסרון עיקרי של שיטה זו אשר photobleaching 2. מגבלות נוספות כוללות את הדרישה של תיוג fluorophore כי רוב המינים מולקולריים אינם פלורסנט מהותי ולכן fluorophores אלה צריכים להיות מוצגים באופן מלאכותי במדגם צלם. מניפולציה מלאכותית זו עלולה להיות הרסנית במיוחד עבור מולקולות קטנות או גורם סירצילום רעיל ential. סיבות אלו הופכות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לא מתאים לתצפיות ב- vivo. לפיכך, השימוש בטכניקות הדמיה אופטיות עם רגישות גבוהה וניגודים מולקולריים מסוימים ללא השימוש של מולקולות ניאון רצוי מאוד במדע הביו-רפואי. כמה שיטות הדמיה קויות אופטיות ללא תיוג או מכתים צמחו, כולל 5 השני-הרמוני דור (SHG) 3,4 ושלישי-הרמוני דור (THG). מיקרוסקופיה SHG נעשתה שימוש כדי הסדרים מבניים תמונה ברמה המולקולרית כגון microtubules או קולגן 6. THG מופק heterogeneities האופטי כגון ממשק בין 7 בינוני ושומנים מימיים. THG גם הודגם המיאלין תמונה 8,9. יכול להיות מיושם הן טכניקות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי שני הפוטונים ודורשים רק קרן לייזר אחת. עם זאת הם דורשים עוצמת הלייזר בהספק גבוה (בדרך כלל 50mW ב 860 ננומטר במשך 10 SHG, 25 - 50 מגה ואט עם 1,180 ננומטר עבור 9 THG), המהווה מזיק בדגימות חיים, ואינו מספק את הספציפיות הכימיות כי נדרשה מבנים ביולוגיים ספציפיים באופן חד משמע תמונה. מבחינה כימית הדמיה סלקטיבית ניתן לקבל אותות הרטט מולקולרי הגלום מבוסס על פיזור ראמאן. כאשר קרן אור פוגעת משנה, פוטונים יכולים להיספג מפוזרים על ידי אטומים או מולקולות. רוב הפוטונים המפוזרים תהיה אותה האנרגיה, כלומר, תדר, כמו פוטוני האירוע. תהליך זה נקרא פיזור ריילי. עם זאת, מספר קטן של פוטונים יהיה מפוזר בתדירות אופטית שונה מהתדירות של פוטוני האירוע, כלומר, עם תהליך פיזור קשיח נקרא פיזור ראמאן. ההבדל באנרגיה שמקורה העירור של אופני תנודה תלויים במבנה מולקולרי סביבה. לכן, ראמאן ספונטנית prov פיזוראידו הדמיה סלקטיבית כימי כמו יש מולקולות שונות תדרי רטט ספציפיים. עם זאת, הוא מוגבל בשל האות החלשה מאוד שלה. מיקרוסקופיה Confocal ראמאן פותחה ומספקת רזולוצית מרחבית 3D, אבל זה דורש רכישת כוח וארוכה ממוצעים הגיע זמן 11. כדי להתגבר על קשיים אלה, ההתקדמות בטכנולוגיית לייזר אפשרו עלייה של מיקרוסקופיה הרטט אופטית לא לינארית, ב פיזור אנטי סטוקס ראמאן קוהרנטי מסוים (CARS) 11,12,13. CARS הוא תהליך אופטי לא לינארית מסדר שלישי. שלוש קרנות ליזר, מורכב קרן משאבה בתדר ω P, קרן סטוקס בתדר ω S וקרן בדיקה (לרוב להיות המשאבה) מתמקדות בדגימה וליצור קרן אנטי סטוקס בתדר ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. האות אנטי סטוקס ניתן לשפר באופן משמעותי כאשר ההבדל התדירבין המשאבה לבין סטוקס הקורות והוא מכוון R Ω הרטט המולקולרי ראמאן = (ω P - ω S). אות CARS מבוססת על אינטראקצית פוטון מרובה. זה יוצר אפוא הזמנות אות קוהרנטית גודל חזק יותר פיזור ראמאן ספונטני. מיקרוסקופיה CARS הוצגה לראשונה באופן ניסיוני על ידי דאנקן et al. 15. Zumbusch et al. השתפר אז הטכניקה, באמצעות שתי אלומות לייזר femtosecond ממוקד האינפרה-אדום הקרוב עם עדשה אובייקטיבי של הצמצם המספרי גבוה, מה שמאפשר את המצב התאמת שלב של מכוניות הימנעות רקע שני הפוטונים שאינם התהודה 16. מיקרוסקופיה CARS ולכן התפתחה ככלי רב עוצמה עבור הדמיה תא ורקמות חיים, על ידי איתור מולקולות כימית כגון שומנים (באמצעות רטט למתוח CH) 17,18, מים (דרך למתוח OH ויברציות), חלבונים, DNA בתאים חיים 19,20 אבל גם deuterated תרכובת כימיתים עבור תרופות 21 יישומים קוסמטיים 22. המגבלה העיקרית של מיקרוסקופיה הקוית מקורו המורכב ואת עלות המקורות האופטיים. מערכת CARS דורשת שני לייזרים מתכווננים גל עם משכי דופק קצרים ועם temporally מרחבית רכבות דופקות מסונכרנים. מיקרוסקופים CARS מוקדם התבססו על שני מסונכרן picosecond Ti: לייזרים ספיר 20. CARS הדמיה גם התקבל Ti femtosecond יחיד: לייזר ספיר יצירת מקור אור supercontinuum 23. לאחרונה, מקורות לייזר מורכב יחיד femtosecond Ti: לייזר ספיר שאיבה מתנדים פרמטרית אופטיים מתכונן (OPO) שימשו במשך מיקרוסקופיה CARS. הגדרה זו מאפשרת קורות מסונכרנים באופן זמני מעצם מהותו עם הבדל של תדירויות בין המשאבה לבין קרן סטוקס מכסה ספקטרום התדר המולקולרי המלא 24. בנוסף, מיקרוסקופים סריקת לייזר המבוסס על מודעות מראשיתליזר FS מפתח וכן OPO, המשמש בעיקר קרינת שני פוטונים (TPF) זמינים כעת עבור-פיסיקאים שאינם. הפוטנציאל של סט-אפ כזה יכול להיות מאוד משופר ללא צורך בהשקעה הנוספת על ידי שילוב של הדמיה אופטית לא לינארית שני, מאחר ולכל שיטת הדמיה קוי (NLO) הוא רגיש מבנים או מולקולות ספציפיות. הדמית NLO מולטימודליות ולכן מהוונת את הפוטנציאל של מיקרוסקופיה NLO עבור דגימות ביולוגיות מורכבות 25. הצימוד של טכניקות אלה אפשר את חקירת שאלות ביולוגיות רבות, בפרט על מטבוליזם שומנים, פיתוח עור או סרטן 26, פיתוח שרירי שלד 27, טרשת עורקת 28. יתר על כן, יישום סריקת קרן ליזר עם מכוניות נותן את היכולת של הדמיה גבוה שיעור, כלומר, כלי מושך ללמוד תהליכים דינמיים in vivo. מטרת עבודה זו היא להראות כל צעד ליישם tCARS הוא טכניקה על מיקרוסקופ סריקת לייזר multiphoton סטנדרטי. המיקרוסקופ מבוסס על fsec Ti: לייזר ספיר וכן OPO (שאוב על ידי Ti: ספיר לייזר) מופעל על ידי תוכנה עבור ביולוגים. השילוב בוצע על ידי התאמת אורך אחד בנתיב קרן לייזר על מנת לסנכרן בזמן שתי הקורות. אנו מתארים את השלב-אחר-צעד ליישום הטכניקה הזו מחייב רקע בסיסי בלבד באופטיקה ניסיון. כמו כן, אנו ממחישים CARS ההדמיה מתקבלים על נדני המיאלין של עצב השת של מכרסמים, ואנחנו מראים הדמיה זו יכולה להתבצע בו זמנית עם הדמיה אופטית לא לינארית אחר, כגון טכניקת קרינת שני פוטונים סטנדרטיים דור שני-הרמוני.

<table><tbody><tr><td>אוסצילוסקופ</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 מגה-הרץ&nbsp;</td></tr><tr><td>גלאי פוטו</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 ננומטר</td></tr><tr><td>Ti: זיקית לייזר ספיר Ultra Family II</td> מתנד פרמטרי אופטי <td>קוהרנטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO משפחה קומפקטית</td><td>APE ברלין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ בוחן Axio LSM 7 מגה פיקסל</td><td>קארל זייס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריסקופ ממונע</td><td>ניופורט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0</td><td>Carl Zeiss</td> Beam combiner Carl Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מודולטור אקוסטו-אופטי</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO מנחת כוח</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier</td><td>Tube Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandpass מסננים</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 ננומטר; 500 - 550&nbsp; ננומטר; 465 - 610&nbsp; ננומטר</td></tr><tr><td>מראה דיכרואית</td><td>קרל זייס</td><td></td><td>אורך גל חיתוך 760&nbsp; מראות</td></tr><tr><td>כסף</td><td>ננומטר ניופורט</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&lambda;/10, 480 - 20,000&nbsp; ננומטר, כמות 4</td></tr><tr><td>שלב תרגום חד צירי עם מיקרומטר סטנדרטי</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>כמות 1</td></tr><tr><td>לוח לחם אלומיניום</td><td>Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>כמות 1</td></tr><tr><td>תושבת מראה</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>כמות 4</td></tr><tr><td>מחזיק מראה עבור &Oslash; אופטיקה 1 אינץ'&nbsp;</td><td>כמות של Thorlabs</td><td>MH25</td><td>4</td></tr><tr><td>דיאפרגמות קשתית&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>כמות 3</td></tr><tr><td>קופסת מגן</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>כמות 1</td></tr><tr><td>פוסטים אופטיים</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>כמות 8 (אורכים בהתאם להגדרה)</td></tr> <tr><td>661 - 690 ננומטר מסנן פס פס</td><td>Semrock</td><td>676/29 ננומטר BrightLine&reg; מסנן פס פס יחיד</td><td>כמות 1</td></tr><tr><td>חרוזי פלורסנט</td><td>ThermoFisher</td><td>TetraSpeck&trade; ערכת</td><td></td>גודל מיקרוספירות פלואורסצנטיות</tr><tr><td>כרטיס צפייה בלייזר</td> כרטיס <td>צפייה בלייזר</td><td>Thorlabs</td><td></td> IR</tr><tr><td>זכוכית בטיחות לייזר</td><td>ניופורט</td><td>LV-F22. P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פלואורומיאלין וסחר; כתם מיאלין פלואורסצנטי אדום&nbsp;</td><td>תרמו-פישר</td><td>F34652</td><td></td></tr></tbody></table>

יישום של מערכת קוהרנטית אנטי סטוקס פיזור ראמאן (cars) על טי: ספיר opo לייזר מבוסס תקן לייזר מיקרוסקופ סריקה

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

מיקרוסקופים סריקת לייזר המשלב femtosecond Ti: לייזר ספיר מתנד פרמטרי אופטי (OPO) לשכפל קו לייזר נהיו זמינים ביולוגים. מערכות אלה נועדו בעיקר עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי שני פוטונים רב ערוצית. עם זאת, ללא כל שינוי, מיקרוסקופיה אופטית שאינו ליניארי משלימה כגון דור השני הרמוני (SHG) או דור הרמוני שלישי (THG) יכולה גם להתבצע עם הסט-אפ הזה, המאפשר הדמיה ללא תווית של מולקולות מובנהיות או בינוני מימי ממשקי שומנים. טכניקות אלו מתאימות גם אותו להסתכלות-vivo, אבל מוגבלות וספציפי כימיים. מבחינה כימית הדמיה סלקטיבית ניתן לקבל אותות הרטט הגלום מבוסס על פיזור ראמאן. מיקרוסקופיה Confocal ראמאן מספקת רזולוצית מרחבית 3D, אבל זה דורש הספק ממוצע גבוה וזמן רכישה ארוך. כדי להתגבר על קשיים אלה, ההתקדמות בטכנולוגיית לייזר התירו development של מיקרוסקופיה רטט הקוית האופטית, ב אנטי סטוקס ראמאן קוהרנטי במיוחד פיזור (CARS). מיקרוסקופיה CARS ולכן התפתחה ככלי רב עצמה עבור הדמית תא ביולוגית חייה, על ידי שומני מיפוי כימי (באמצעות רטט למתוח CH), מים (באמצעות תנודות מתיחת OH), חלבונים או דנ&quot;א. בעבודה זו, אנו מתארים את יישום הטכניקה CARS על מיקרוסקופ סריקת לייזר multiphoton תקן מצמידים OPO. היא מבוססת על סנכרון בזמן של שני קווי לייזר על ידי התאמת אורך אחד בנתיב קרן לייזר. אנו מציגים יישום צעד-אחר-צעד של טכניקה זו על מערכת multiphoton קיימת. רקע בסיסי באופטיקה ניסיונית הוא מסייע למערכת המוצגת אינה דורשת ציוד משלים יקר. כמו כן, אנו ממחישים CARS הדמיה מתקבל על נדני המיאלין של עצב השת של מכרסמים, ואנו מראים כי הדמיה זו יכולה להתבצע בו זמנית עם הדמיה אופטית לא לינארית אחר, כגון t הסטנדרטיוו-פוטון טכניקת קרינה ואת הדור השני-הרמוני.

<html> תדירות הרכבת הדופק לסטנדרטים Ti: לייזר ספיר הוא בדרך כלל סביב 80 מגה-הרץ. OPO יש אותו תדר שכן הוא שאוב על ידי Ti: ספיר לייזר. אוסצילוסקופ מהיר של MHz 200 לפחות ולכן נדרש. פוטודיודה מהיר בטווח 600 עד ננומטר 1,100 נדרש גם. המעבר הזמני המקסימאלי מתרחש כאשר Ti: ספיר ואת אותות OPO מוזזים של 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6.2 ננו-שניות. זה מתאים משמרת נתיב קרן מקסימלית של 1.9 מ &#39;איור 2 מציג את הרכבת הדופק שנרשם בגין קרן לייזר...

קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן פיזור (CARS) מיקרוסקופיה מבוסס על רטט טבוע של אג&quot;ח מולקולה התיר ללא תווית כימי סלקטיבית הדמית תא חייה. עבודה זו מציגה יישום טכניקה מיקרוסקופיה משלימים על מיקרוסקופ סריקת לייזר multiphoton התקן על בסיס Ti femtosecond: לייזר ספיר לייזר OPO.

יישום של מערכת קוהרנטית אנטי סטוקס פיזור ראמאן (CARS) על טי: ספיר OPO לייזר מבוסס תקן לייזר מיקרוסקופ סריקה

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להטמיע טכניקת מיקרוסקופיה משלימה הנקראת CARS, המאפשרת דימוי של סגנון חיים (lifestyle imaging) ללא סימון ובסלקטיביות כימית, באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזרי רב-פוטוני סטנדרטי המבוסס על לייזר טיטניום-ספיר (titanium-sapphire) בעל פולסים של פמטו-שנייה ומתנד פרמטרים אופטיים (optical parameter oscillator). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה או מדעי המוח, כגון הבנה של מחלות הקשורות לליפידים, מנגנוני חדירה לעור או הפרעות עוריות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הקלות שבה ניתן להטמיעה במיקרוסקופ סריקה לייזרי סטנדרטי המבוסס על לייזרי Ti:Sapphire ו-OPO.את הפרוצדורה ידגימו Hassan Boukhaddaoui, עמית מחקר וראש פלטפורמת הדימיון של המעבדה, ו-Vasyl Mytskaniuk. הפעילו את לייזרי הטיטניום-ספיר וה-OPO כפי שמוצג בפרוטוקול הכתוב. הדליקו את מחשב המיקרוסקופ.הפעילו את מתגי רכיבי המיקרוסקופ. הפעילו את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על הסמל בשולחן העבודה והגדירו אותה בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, מקמו מראית דיכרואית עם אורך גל חסימה של 760 nanometers במגירה של הפתח הצדדי.אתרו זאת במרחב האינסוף שמעל לבית העדשות של העדשה. הגדירו את מסנן הפס הצר ואת קוביית המחזיר לפני PMT1 כדי להקליט רק את אות ה-CARS באורך גל של 670 nanometers, על מנת לשחזר את התוצאות המוצגות. לאחר מכן, מקמו מסנני פס צרים ספציפיים לפני PMT3 לצורך תצפית פלואורסצנטית של המיאלין, ולפני PMT4 לצורך תצפית SHG.בתוכנה, הגדירו את האות בגלאי באמצעות מסנן מעבר פס (band pass filter) ייעודי. פתחו את כלי נתיב האור (light path tool) בתפריט מנהל ההגדרות (setup manager) בלשונית הרכישה (acquisition), לאחר מכן הפעילו את ה-PMT הרצוי ובחרו צבע עבור הערוץ. לדוגמה, השתמשו בירוק עבור CARS, ובמגנטה עבור SHG.שתי הקרניות הנובעות מאותו לייזר טיטניום-ספיר (titanium sapphire laser) אינן מסונכרנות בעת הגעתן למיקרוסקופ, מכיוון שקרניית ה-OPO מתעכבת בזמן יצירתה. פעל לפי נוהל זה כדי לסנכרן אותן מחדש על ידי התאמת האורך של אחת מרפי קרניית הלייזר באמצעות שילוב של קו השהיה. השימוש בפוטודיודה מהירה ובאוסצילוסקופ מהיר הוא הכרחי.ראשית, באמצעות כבלי BNC, חברו את ערוץ הקלט CH1 של האוסצילוסקופ ליציאת הסנכרון החשמלית (sync out) של הלייזר בחיבור BNC. לאחר מכן, חברו את ערוץ הקלט CH2 לפוטודיודה. לאחר מכן, בחרו בערוץ CH1 כטריגר על ידי לחיצה על תפריט trigger, לאחר מכן על כפתור המקור (source) בתפריט הראשי, ואז על כפתור התפריט הצדדי המתאים לערוץ שנבחר כ-CH1.כעת מקמו וקבעו באמצעות מוטות קיבוע אופטיים אל הפוטודיודה במישור המוקד של עדשת מיקרוסקופ אוויר 10x. בכלי הערוצים (Channels tool), הגדירו את אורך הגל של לייזר טיטניום-ספיר ל-830 nanometers בעוצמה נמוכה, שהיא פחות מ-1% מהעוצמה המלאה. בכלי מצב הרכישה (Acquisition Mode tool), צמצמו את שטח הסריקה לנקודה אחת כדי להאיר את הפוטודיודה עם הקרן הדקה ביותר.לאחר מכן, הפעילו את סריקת הלייזר על ידי לחיצה על כפתור ה-continuous. לחצו על Autoset באוסצילוסקופ והזיזו ידנית את הפוטודיודה כדי לקבל רצף פולסים על מסך האוסצילוסקופ. לחצו על כפתור ה-run/stop כדי להקפיא את התצוגה.בשלב הבא, כבו את סריקת לייזר הטיטניום-ספיר (titanium-sapphire). בתוכנה, לחצו על כלי הערוצים (Channels), בטלו את הבחירה בלייזר של 830 ננומטר והגדירו את אות ה-OPO ל-1107 ננומטר ובהספק נמוך. לאחר מכן, הפעילו את סריקת לייזר ה-OPO, הקליטו את רצפי הפולסים של לייזר ה-OPO באוסצילוסקופ וכבו את סריקת לייזר ה-OPO.כעת, השוו את הסטייה הזמנית בין אותות הטיטניום-ספיר (titanium-sapphire) וה-OPO. חשבו את אורך קו ההשהיה, שישמש למיקום המראות. לפני ההמשך, הרכיבו משקפי מגן והסירו צמידי שרשראות או שעונים מהפרקים.כעת, פתחו את קו לייזר הטיטניום-ספיר (titanium-sapphire) שבו יוטמע קו ההשהיה, על ידי הסרת צינורות ההגנה. לאחר מכן, בחרו אורך גל בטווח הנראה כדי שניתן יהיה לצפות בקרינת הלייזר בקלות, למשל, 700 nanometers בהספק נמוך, והפעילו את סריקת הלייזר. כעת, הניחו שתי דיאפרגמות צמצם (iris diaphragms) בקו הלייזר הפתוח באמצעות מוטות התמיכה האופטיים.מקמו צמצם אחד ביציאה של קו ההשהיה ומקמו את הצמצם השני בכניסה לפריסקופ. לאחר מכן, הקטינו את מפתח הצמצם וכווננו את מיקומי הצמצמים כך שיתאימו למסלול קרן הלייזר, ולאחר מכן קבעו אותם על השולחן האופטי. לבסוף, כווננו את המיקום האנכי של צמצם נייד שלישי.דיאפרגמות המפתח ישמשו כבקרת איכות להליך הכיוון מחדש, כדי לבדוק את מיקום קרן הלייזר תוך כדי מיקום עקבי של ארבעת המראות של קו ההשהיה. כעת, מקם את המראה M1 על תושבת מראות קינמטית קומפקטית בכניסה לקו ההשהיה, וכוון את מיקומה ואת אוריינטצייתה כדי לשמור על גובה הקרן באמצעות דיאפרגמת צמצם ניידת. לאחר מכן, מקם את המראות M2 ו-M3 בזווית של 90 מעלות על במה התרגול בהתאם לאורך קו ההשהיה המחושב, וכוון את אוריינטצייתן באמצעות דיאפרגמת הצמצם הניידת.מקמו את M4 ביציאה של קו ההשהיה (delay line) ממש לפני הצמצם, וכוונו בזהירות את מיקומו וזוויותיו כדי להתאימו למסלול קרן הלייזר העוברת דרך שני דיאפגמות הצמצם הקבועות. כעת, מקמו את כרטיס הצפייה בלייזר ביציאה של עדשת המיקרוסקופ ובדקו את פרופיל קרן הלייזר. במידת הצורך, כוונו קלות את כיוונו של M4 עד להשגת דיסקה בהירה ואחידה.לבסוף, מקם מחדש את הפוטודיודה המהירה תחת קרן הלייזר במישור המוקד של הדגימה. לאחר מכן, צפה בהסטה הזמנית בין קרן לייזר הטיטניום-ספיר (titanium-sapphire) לבין קרן ה-OPO באוסצילוסקופ. במידת הצורך, שנה את אורך קו ההשהיה על ידי הזזת כל במת ההזזה כדי לסנכרן את הפולסים.החפיפה המרחבית של שתי הקרניות הדרושה לאות CARS מושגת על ידי ויזואליזציה של חרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים המקובעים לשקופית מיקרוסקופ. התמקד בחרוזים באמצעות עדשת מים 20x. כעת, בכלי הערוצים (Channels tool) בלשונית הרכישה, הוסף את ערוץ 1, או השתמש בערוץ קיים.בחר באורך גל של 830 nanometers ובעוצמה נמוכה עבור קרן לייזר הטיטניום-ספיר. שנה את הצבע לירוק בתיבת ערוץ 1 (track one) מחלון הערוצים (Channels), ובתיבת PMT3 או PMT4 מחלון נתיב האור (light path). לאחר מכן, הוסף ערוץ 2 (track two) עבור קרן לייזר ה-OPO והגדר את אורך הגל ל-1107 nanometers ועוצמה נמוכה.שנו את הצבע לאדום בתיבת ערוץ 2 (track two) מחלון הערוצים (Channels) ובתיבת PMT3 או PMT4 מחלון נתיב האור (light path). כעת, בחרו את שטח הסריקה המקסימלי וכווןנו את ההגבר (gain) של שני הערוצים ל-600. לאחר מכן, בצעו סריקה רצופית של שתי הקרניות על הדגימה על ידי לחיצה על continuous.עקוב אחר התמונה באזור המסך בתצוגה הדו-ממדית (2D). הגבר את העוצמה של שני הלייזרים. במידת הצורך, הזז מעט את ידית המיקוד כדי למצוא את מישור המיקוד של החרו지를.לבסוף, התאימו את החיתוך והגדילו את התמונה על חריץ בודד או על קבוצה של חריצים סמוכים. לאחר מכן, השתמשו בבקר הפריסקופ כדי להחליף את קרני האור במישור XY. בתוכנה, פתחו את לשונית Maintain.לחצו על אפשרויות המערכת והציגו את חלון כלי הפריסקופ המוטורי. פרטים נוספים נידונים בפרוטוקול הטקסט. לאחר חפיפה של תמונות משני קרני הלייזר, מושג סנכרון.כדי להשיג את הכוונון הזמני המדויק להפעלת CARS, הכינו זכוכית עם טיפה של שמן זית וכיסוי זכוכית. לאחר מכן, באמצעות עדשת שיקוע במים 20x, התמקדו בקצה של כיסוי הזכוכית. כעת, בערוץ אחד, הגדירו את אורך הגל ל-830 nanometrs עבור קרן לייזר הטיטניום-ספיר ואת 1107 nanometers עבור ה-OPO.הפעילו את שני הלייזרים בערוץ הראשון כדי לקבל סריקה סימולטנית. התחילו כאשר שני הלייזרים בעוצמה נמוכה. לאחר מכן, בחלון נתיב האור, בטלו את הסימון של PMT4 ובחרו ב-PMT1.לאחר מכן, בחרו את שטח הסריקה המקסימלי והפעילו את סריקות הלייזר על ידי לחיצה על כפתור ה-continuous. כוונו את ההגבר (gain) ל-600 ובמידת הצורך, הגבירו את העוצמה של שני הלייזרים. לאחר מכן, כוונו את עוצמת התצוגה בבלוק הבקרה של אפשרויות תצוגת התצוגה (display view option control block).לאחר מכן, הזיזו באיטיות את במת ההזזה של קו ההשהיה עד שהאות יתחזק באופן משמעותי. כעת, הפחיתו את ההספק של שני הלייזרים. לבסוף, בדקו האם האות הוא אות CARS על ידי כיבוי לסירוגין של אחד משני הלייזרים.אם עוצמת האות נחלשת או נעלמת, פירושו שהתקבל אות CARS. מכיוון שהמערכת הסופית מיועדת לאנשים שאינם פיזיקאים, יש לסגור את נתיב האור של קו ההשהיה באמצעות קופסת כיסוי וצינורות, כדי למנוע גישה ישירה לקרן לייזר בעלת הספק שיאה גבוה, שאינה נראית ומסוכנת. עם זאת, יש לאפשר גישה לכפתור של במה ההזזה.צבע פלואור-מיאלין אדום, בעל סלקטיביות למיאלין, שימש לצפייה במעטפת המיאלין. הארה סימולטנית באורכי גל של 830 ו-1095 ננומטרים מספקת אות CARS. העיגולים תואמים למעטפת המיאלין המקיפה אקסונים בחתך רוחבי.אותו מבנה נמצא בעת חפיפה של תמונות CARS ותמונות פלואורסצנציה. רמת הפירוט של CARS והסימון הפלואורסצנטי דומה מאוד. דבר זה עשוי לבטל את הצורך בשימוש בצבעים.המערכת יכולה להפיק בו-זמנית גם אות הרמוני שני מסיבי הקולגנו שנמצאים בשטח הפנים החיצוני של העצבים הסיאטיים. גלאי שונה משמש להקלטת אות באורך גל של 550 nanometers, מכיוון שמסנן חסימה רחב (narrow band pass filter) ב-670 nanometers משמש להקלטת אות ה-CARS. הסיבים מוצגים בצבע מגנטה מלאכותי.אות ה-CARS לבדו מראה בבירור את מעטפות המיאלין. על ידי הדמיה סימולטנית של שני האותים, ניתן לראות את מעטפות המיאלין בירוק מוקפות בסיבי קולגן במגנטה. אות CARS דורש פחות אנרגיה מאשר אותים של SHG או THG.אותות CARS הושגו עם 4 milliWatts באורך גל של 830 nanometers ו-13 milliWatts ב-1095 nanometers, בעוד שנדרשו 50 milliWatts ב-1095 nanometers כדי לקבל אות SHG. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לשנות באופן הדרגתי את אחד מנתיבי קרני הלייזר כדי לסנכרן את שתי קרני הלייזר זמנית. מימוש קו ההשהיה יכול להתבצע תוך מספר שבועות על ידי ביולוגים בעלי רקע בסיסי באופטיקה ניסויית או בשיתוף פעולה עם פיזיקאים.יש לזכור כי עבודה עם קרני לייזר בעלות הספק גבוה ושאינן נראות עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט אמצעי זהירות, כגון הרכבת משקפי מגן במהלך ביצוע הפרוצדורה וסגירה סופית של נתיב קרן הלייזר.

implementation-coherent-anti-stokes-raman-scattering-cars-system-on

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שילוב של שלוש קצר פעמו לייזר באורך גל יחיד משמש ליצור פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) ומכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS). ההבדל בין אותות אלה מספק רגישות משופרת אחרת קשה לזהות אותות ראמאן קוהרנטית, המאפשר הדמיה של scatterers ראמאן חלש.

דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (CARS)

מקור: Espinoza, R.,  et al. הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים בזמן אמת של מוח עכבר לצורך אבחון רקמות. J. Vis. exp. (2022).  הסרטון מדגים הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים (SRS) של מקטעי רקמת מוח של עכבר. שתי קרני לייזר מסונכרנות מכוונות אל קטע הרקמה כדי לעורר תנודות מולקולריות, וכתוצאה מכך שינוי עוצמה יחסי בקרניים. שומנים וחלבונים ברקמה מתגלים באמצעות זוגות תדרים מובחנים של קרני הלייזר. לאחר מכן מוקצים לאותות המתקבלים צבעים נפרדים, ויוצרים תמונה דו-צבעונית המסייעת בזיהוי החלבונים והשומנים...

הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים של רקמת מוח של עכבר

בכתב יד זה, היישום של מיקרוסקופ ראמאן מגורה (SRS), המתקבל על ידי שילוב של הגדרת הניסוי SRS הערכה עם מיקרוסקופ סריקת לייזר, מתואר. מיקרוסקופ SRS מבוסס על שני מקורות לייזר (שניים), טי-ספיר (Ti: Sa) ומתנד פרמטרי אופטי מסונכרן (פופו).

יישום של מיקרוסקופ לא לינארית על בסיס פיזור ראמאן מגורה

מתוארת מתודולוגיית הדמיית פיזור ראמאן קוהרנטית להדמיה וכימות של תרכובות תרופתיות בתוך העור. מאמר זה מתאר הכנת רקמות עור (אדם ועכבר) ויישום פורמולציה מקומית, רכישת תמונה לכימות פרופילי ריכוז מרחביים-טמפורליים, וניתוח פרמקוקינטי ראשוני להערכת אספקת תרופות מקומית.

הדמיה וכימות של תרכובות פרמצבטיות בתוך העור באמצעות הדמיית פיזור ראמן קוהרנטית

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכניקת הדמיה עוצמתית, לא פולשנית ונטולת תוויות. יישום מתפתח אחד הוא היסטולוגיה של ראמאן, שבה הדמיית SRS בשני צבעים במעברי החלבון והשומנים ראמאן משמשת ליצירת תמונות פסאודו-המטוקסילין ואוזין. כאן אנו מדגימים פרוטוקול להדמיית SRS בשני צבעים בזמן אמת לאבחון רקמות.

בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) של פיזור קדם-תהודה אלקטרונית של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן היא פלטפורמה חדשה להדמיית חלבונים מבוססת אפיטופים מרובבים מאוד. כאן אנו מציגים מדריך מעשי הכולל הכנת נוגדנים, צביעת דגימת רקמות, הרכבת מיקרוסקופ SRS והדמיית רקמות epr-SRS.

הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

מאמר זה מציג את השילוב של מודול מיקוד ספקטרלי ולייזר פולסים בעל פלט כפול, המאפשר הדמיה היפרספקטרלית מהירה של ננו-חלקיקי זהב ותאים סרטניים. עבודה זו נועדה להדגים את הפרטים של טכניקות אופטיות רב-מודאליות לא ליניאריות במיקרוסקופ סריקת לייזר סטנדרטי.

הדמיה ביומולקולרית של קליטת תאים של ננו-חלקיקים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית רב-מודאלית לא ליניארית

מאמר זה משווה באופן ישיר את ניגודי הרזולוציה, הרגישות וההדמיה של פיזור ראמאן מגורה (SRS) ופיזור ראמן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS) המשולבים באותה פלטפורמת מיקרוסקופ. התוצאות מראות של-CARS יש רזולוציה מרחבית טובה יותר, SRS נותן ניגודים טובים יותר ורזולוציה ספקטרלית טובה יותר, ולשתי השיטות יש רגישות דומה.

השוואה ישירה של פיזור ראמן מגורה היפרספקטרלי ומיקרוסקופיית פיזור ראמן אנטי-סטוקס קוהרנטית להדמיה כימית

הדמיה של מיאלינציה היא מטרה חשובה עבור חוקרים רבים החוקרים את מערכת העצבים. CARS היא טכניקה התואמת את האימונופלואורסצנציה שיכולה לדמות באופן טבעי שומנים בתוך רקמות כגון המוח המאיר מבנים מיוחדים כגון מיאלין.

יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח

למד כיצד ליישם מיקרוסקופיית CARS לדימוי תאים חיים ללא תוויות באמצעות לייזר Ti:sapphire ו-OPO. שיטה זו מאפשרת מחקר ביולוגי ונוירולוגי מתקדם.

יישום של מערכת קוהרנטית אנטי סטוקס פיזור ראמאן (CARS) על טי: ספיר OPO לייזר מבוסס תקן לייזר מיקרוסקופ סריקה

גלה סרטונים נוספים