Name: מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים Brucella זיהום של תאים הלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: למד זיהוי גורמי מארח בזיהום Brucella בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופיה בעלת תפוקה גבוהה ומסכי siRNA. שיטה זו מאפשרת חקירת אינטראקציות פתוגן-מארח ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות עתידיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים 51RT 0_126008 ו-51RTP0_151029 עבור פרויקט המחקר והפיתוח הטכנולוגי (RTD) InfectX ו-TargetInfectX, בהתאמה, במסגרת SystemsX.ch, היוזמה השוויצרית לביולוגיה מערכתית. אנו מכירים במענק 310030B_149886 מהקרן הלאומית למדע של שווייץ (SNSF). עבודתם של S.H.L ו-A.C. נתמכה על ידי תוכנית הדוקטורט הבינלאומית "מלגות למצוינות" של Biozentrum. סימון מונטווילר זוכה להכרה על הסיוע הטכני. ברצוננו להודות לדירק בומן על אספקת pNF106 ולז'אן צ'לי עבור pJC43 ו-pJC44.

<ol><li>Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+global+map+of+human+brucellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The new global map of human brucellosis.</a> Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).</li>
<li>Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+human+pathogenic+Brucella+species+with+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).</li>
<li>Guzman-Verri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+of+the+Rho+subfamily+are+required+for+Brucella+abortus+internalization+in+nonprofessional+phagocytes%3A+direct+activation+of+Cdc42%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42.</a> J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).</li>
<li>Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+intracellular+replication+requires+trafficking+through+the+late+endosomal%2Flysosomal+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment.</a> Traffic. 9, 678-694 (2008).</li>
<li>Boschiroli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Brucella+suis+virB+operon+is+induced+intracellularly+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).</li>
<li>Celli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+evades+macrophage+killing+via+VirB-dependent+sustained+interactions+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum.</a> J Exp Med. 198, 545-556 (2003).</li>
<li>Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acidification+of+phagosomes+containing+Brucella+suis+is+essential+for+intracellular+survival+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages.</a> Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).</li>
<li>Anderson, T. D., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+morphometric+analysis+of+Brucella+abortus-infected+trophoblasts+in+experimental+placentitis.+Bacterial+replication+occurs+in+rough+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum.</a> Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathog. 4, e1000110(2008).</li>
<li>Ramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+large-scale+RNAi+screens+for+pathogen+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry.</a> BMC genomics. 15, 1162(2014).</li>
<li>Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+InlC+secretion+to+investigate+cellular+infection+by+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes.</a> J Vis Exp. , e51043(2013).</li>
<li>Kentner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+reroutes+host+cell+central+metabolism+to+obtain+high-flux+nutrient+supply+for+vigorous+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).</li>
<li>Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+coopts+the+small+GTPase+Sar1+for+intracellular+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).</li>
<li>von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+affairs%3A+investigating+the+Brucella+intracellular+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle.</a> FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

פתוגנים חיידקיים פיתחו אסטרטגיות רבות למניפולציה של תאים מארחים אוקריוטיים לטובתם. פתוגנים הגורמים לזיהומים חריפים מראים לעתים קרובות התפשטות מהירה המלווה בדאגה משמעותית של מערכת החיסון ואובדן כדאיות של תאים נגועים. לעומת זאת, ברוצלה ופתוגנים אחרים הגורמים לזיהומים כרוניים מצליחים ליצור אינטראקציות ארוכות טווח בתוך תאי המארח. לכן, חיידקים צריכים לכוונן את תפקודי התא המארח לטובתם מבלי לשבש את ההומאוסטזיס התאי. אסטרטגיה נפוצה לזיהוי גורמי התא המארח המעורבים בתהליך זיהום בקנה מידה גנומי היא השימוש בדלדול גנים שיטתי...

מיני Brucella הם גראם שליליים, פתוגנים תאיים פקולטטיבי השתייכות למעמד של α-פרוטאובקטריה. הם לגרום הפלות פוריות אצל מארחיהם טבעיים כגון בקר, עזים או כבשים וכתוצאה מכך הפסדים כלכליים חמורים באזורים אנדמיים. ברוצלוזיס היא אחת מחל zoonotic החשובות ביותר בעולם גורמים יותר מחצי מיליון זיהומי אדם חדשים מדי שנת 1. הילוכים לאדם נגרמים לרוב על ידי מגע ישיר עם בעלי חיים נגועים או על ידי בליעה של מזון מזוהם כמו חלב לא מפוסטר. הסימפטומים של המחלה חום הם נוקבים, הגורמת לקשיים באבחון של ברוצלוזיס. בהעדר טיפול, חולים יכולים לפתח דלקת כרונית עם תסמינים חמורים יותר כגון דלקת פרקים, דלקת פנים הלב, וכן נוירופתיה 2. ברמה התאית Brucella הוא מסוגל לפלוש תאים phagocytic והלא phagocytic משכפל בתוך תאייםתא המכונה vacuole המכילים Brucella (BCV). הפנמה של חיידקים דורש rearrangements cytoskeleton אקטין ידי RAC, Rho, והפעלה ישירה של Cdc42 3. בתוך התא המארח איקריוטיים, את BCV traffics לאורך מסלול endocytic ולמרות אינטראקציה עם lysosomes, חיידקים מצליחים למנוע השפלה 4. החמצה של BCV ידי שלפוחי ATPase נדרש כדי לגרום הביטוי של מערכת הפרשת IV סוג בקטריאלי (T4SS) 5. הוא האמין כי effectors חיידקי מופרש T4SS חיוני Brucella להקים הנישה בשכפול הדנ&quot;א שלו, מאז מחיקה של T4SS 6 או עיכוב של עופרת ATPase שלפוחי מפגמי הקמת הנישה התאית 7. חיידקים אינם משתכפלים במהלך שלב של סחר עד שהם להגיע תא vacuolar הנגזרות ER 8. לאחר התפשטות תאיים מתרחשת, BCV נמצא CLעמותת OSE עם סמני ER כגון calnexin וגלוקוז-6-phosphatase 6. המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו Brucella נכנס לתאים, נמנע שפלת lysosomal, ולבסוף משכפל ב תא ER-כמו להישאר אלמונים למדי. גורמי מארח מעורבים שלבים שונים של זיהום זוהו בעיקר על ידי גישות ממוקדות או מסך RNA התערבות קטן בקנה מידה קטנה (siRNA) בצע בתאים תסיסנית 9. אלה שפכו אור על תרומתם של גורמים ממארחים במהלך הדבקת Brucella אבל אנחנו עדיין רחוקים הבנה מקיפה של התהליך כולו. הנה, פרוטוקולים המאפשרים זיהוי של גורמי מארח אנושיים באמצעות התערבות RNA בקנה מידה גדולה (RNAi) הקרנה בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום אוטומטי ניתוח תמונה אוטומטי מוצגים. transfection siRNA ההפוך של תאים הלה מבוצע described קודם לכן 10,11 עם שינויים קלים. את assay קצה מכסה חלק גדול של מחזור החיים התאיים Brucella למעט היציאה והזיהום של תאי שכנים. כדי להמשיך לאפיין את הנפילות ב assay נקודות הקצה, פרוטוקול שונה כדי לזהות גורמים הכרוכות בביצוע הפעולות הראשונות של הזיהום משמש. זן abortus Brucella כי constitutively מבטא GFP משמש עבור assay הסיום שבו חיידקים מותרים להדביק תאים במשך ימים. במהלך תקופה זו, חיידקים לחדור לתאים, תנועה לנישה בשכפול הדנ&quot;א הנגזרות ER, לשכפל במרחב פרי-גרעיני. הרמות הגבוהות של אות ה- GFP לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לזהות תאים בודדים מהימן אשר מכילים חיידקים משכפלים. כדי ללמוד כניסת Brucella ב assay תפוקה גבוהה, חשוב להיות מסוגל להבחין בין חיידקים תאיים תאיים. השיטה המוצגת כאן circumvמכתים נוגדן הפרש המציג של חיידקים תאיים תאיים. היא מבוססת על זן Brucella להביע GFP טטרציקלין מושרה בשילוב עם ביטוי המכונן של dsRed. הנוכחות של סמן dsRed מכונן מאפשרת זיהוי של כל החיידקים שנמצאים במדגם. ביטוי של GFP הוא המושרה על ידי תוספת של anhydrotetracycline אנלוגי טטרציקלין רעיל (ATC) בו זמנית עם איון של חיידקים תאיים על ידי גנטמיצין (GM). בעוד תא-חדיר אנטיביוטי Gm הורג חיידקים תאיים, ATC יכול להיכנס לתא המארח להשרות ביטוי של GFP סלקטיבי חיידקים תאיים. כתב כפול זה מאפשר הפרדה החזקה של חיידקים תאיים יחידים (GFP אות dsRed) מחיידקים תאיים (אות DsRed בלבד) באמצעות מיקרוסקופ השדה רחב. כדי להגיע ביטוי GFP לזיהוי על ידי Brucella תאיים מצאנו כי 4 שעות של אינדוקציה ידי ATC התוצאה היא רליאות מסוגל. תוכניות אינדוקציה דומות להביע GFP סלקטיבי חיידקים תאיים כבר השתמשו בעבר כדי ללמוד Shigella התאי 12.

<table><tbody><tr><td>אגר סויה טריפטי (TSA)</td> <td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>מרק סויה טריפטי (TSB)</td> <td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>חלב</td><td></td><td></td><td></td>רזה</tr><tr><td>250 מ"ל בקבוק פקק בורג</td><td>קורנינג</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>עוברי סרום עגל (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA מומת בחום (0.5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>תמיסת מלאי פי 10, לדלל 1:10 ב-PBS</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 Cell Counter</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td><td>ניתן להשתמש בהתקני ספירת תאים חלופיים</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384-well plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום מתקלף</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>מתקן ריאגנטים: "מתקן ריאגנטים Multidrop 384"ניתן</td> <td>להשתמש במתקן ריאגנטים חלופי</td> של <td>Thermo Scientific</td><td>5840150</td>.</tr><tr><td>מגיב טרנספקציה: "Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>מכונת כביסה אוטומטית לצלחות: "מכונת כביסה צלחות ELx50-16"</td> <td>BioTek</td><td>ELX5016</td><td>מכונת כביסה זו מכילה סעפת 16 ערוצים המתאימה לצלחות 384 בארות. הוא נכנס לארון בטיחות ביולוגית ויש לו מכסה המכסה את הצלחת במהלך הכביסה מה שמפחית את הסיכון לייצור אירוסול. ניתן להשתמש במכונות כביסה חלופיות עם תכונות דומות.</td></tr><tr><td>גנטמיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>אנהידרוטטרציקלין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>37919</td><td>100 & #956; תמיסת גרם/מ"ל ב-100% אתנול נשמרת ב-20 מעלות; C מוגן מפני אור בנייר אלומיניום</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>מתמוסס במאגר HEPES של 0.2 M, pH 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C ולהפשיר טרי יום לפני השימוש. אזהרה, PFA רעיל בשאיפה, במגע עם העור ובמקרה של בליעה.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>בנייה: pJC44 4 עוכל עם EcoRI ואחריו יצירת קצוות קהים עם אנזים Klenov ועיכול לאחר מכן עם SalI. TetR-GFP הוגבר מ-pNF106 באמצעות פריימר prAC090 ו-prAC092. לאחר העיכול עם SalI, מוצר TetR-GFP נקשר לווקטור pJC44 המעוכל.</td></tr><tr><td>פריימר prAC090</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>Primer prAC092</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT</td></tr><tr><td>TC HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress מיקרו</td><td>מכשירים מולקולריים&nbsp;</td><td>IXM IMAGING MSCOPE</td><td>מיקרוסקופ הדמיה סלולרי אוטומטי המצויד ב-Z-stage ממונע מדויק. ניתן להשתמש במערכות חלופיות למיקרוסקופיה אוטומטית ורכיבים חלופיים עבור קשיח ותוכנה המפורטים להלן.</td></tr><tr><td>לייזר מהיר מיקוד אוטומטי</td><td>התקנים מולקולריים&nbsp;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>CFI סופר פלואור 10X אובייקטיבי</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>MRF00100</td><td>NA 0.50, W.D 1.20 מ"מ, פריזמת DIC: 10X, פוטומטריה טעונה קפיץ</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ מונוכרום CCD מצלמה</td><td>התקנים מולקולריים&nbsp;</td><td>1-2300-1060</td><td>1,392 x 1,040 פיקסלים להדמיה, 6.45 x 6.45 ומיקרו; m פיקסלים, 12 ביטים דיגיטציה</td></tr><tr><td>תוכנת MetaXpress</td><td>התקנים מולקולריים&nbsp;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>מנוע אור. נעשה שימוש במקורות האור הבאים: סגול (DAPI), ציאן (GFP), ירוק/צהוב (RFP)</td></tr> <tr><td>סינגל בנד אקסיטר ל-DAPI</td><td>סמרוק</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td></tr><tr><td>פולט סינגל</td><td>סינגל סמרוק</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>סינגל בנד דיכרואיק ל-DAPI</td><td>סמרוק</td><td>FF409-DI03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>סינגל בנד אקסיטר ל-GFP</td><td>סמרוק</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td></tr><tr><td>פולט פס יחיד עבור GFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>סינגל בנד דיכרואיק עבור GFP</td><td>Semrock</td><td>FF495-DI03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>סינגל בנד אקסיטר ל-RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr><tr><td>פולט סינגל בנד ל-RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr><tr><td>סינגל בנד דיכרואיק ל-RFP</td><td>Semrock</td><td>FF593-Di03-25x36</td><td></td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

מיני Brucella הם פתוגנים תאיים פקולטטיבי מדביקי חיות כמארחים הטבעיים שלהם. הילוכים לבני האדם נגרמים לרוב על ידי מגע ישיר עם בעלי חיים נגועים או על ידי בליעה של מזון מזוהם והוא יכול לגרום לזיהומים כרוניים קשים. Brucella יכול לפלוש תאים phagocytic המקצועיים והלא-מקצועיים משכפל בתוך reticulum endoplasmic (ER) vacuoles -derived. הגורמים המארחים הנדרשים לשם כניסת Brucella לתוך תאי מארחים, הימנעות שפלת lysosomal, ושכפולים בתא ER-כמו להישאר אלמונים למדי. כאן אנו מתארים שני מבחנים לזהות גורמי מארח מעורבים כניסת Brucella ושכפול בתאים הלה. הפרוטוקולים מתארים את השימוש של התערבות RNA, בעוד שיטות הקרנה חלופיות יכולות להיות מיושמות. המבחנים מבוסס על זיהוי של חיידקים שכותרתו fluorescently שכותרתו fluorescently תאי מארח באמצעות אוטומטימיקרוסקופיה רחב בתחום. התמונות פלורסנט מנותחות באמצעות צינור ניתוח תמונה סטנדרטי CellProfiler המאפשר ניקוד זיהום מבוסס תא בודד. ב assay נקודות הקצה, שכפול תאיים נמדד ימים לאחר ההדבקה. זה מאפשר לחיידקי תנועת הנישה בשכפול הדנ&quot;א שלהם שבו התפשטות הוא יזם כ -12 שעות לאחר כניסת חיידקים. Brucella אשר הקים בהצלחת נישה תאית יהיה וכך התרבו מאוד בתוך תאי מארחים. מאז חיידקים תאיים יהיה מאוד במספרם חיידקים תאיים או תאיים בודדים שאינם בשכפול הדנ&quot;א, זן המבטאים constitutively GFP יכול לשמש. אות GFP החזקה לאחר מכן נעשתה שימוש כדי לזהות תאים נגועים. לעומת זאת, עבור assay הכניסה חיוני להבדיל בין תאיים ובקטריות התאיות. הנה, קידוד זן עבור GFP טטרציקלין מושרה משמש. הַשׁרָאָהשל GFP עם איון סימולטני של חיידקים תאיים על ידי גנטמיצין מאפשרת הבחנה בין תאיים ובקטריות תאיים על פי האיתות GFP, עם חיידקים תאיים רק להיות מסוגל להביע GFP. זה מאפשר זיהוי החזק של חיידקים תאיים יחידים לפני התפשטות תאית היא יזמה.

איור 1 א מציג דוגמה של ניתוח התמונה המשמש לזיהוי תאים נגועים באופן אוטומטי ב assay נקודות קצה. גרעינים של תאים הלה מגואלות DAPI זוהו, א-גרעין פרי של רוחב 8 פיקסלים סביב הגרעין, וגוף התא Voronoi ובהרחבה של הגרעין על ידי 25 פיקסלים חושבו. מאז חיידקים בעיקר להתרבות בחלל פרי-גרעינית, עוצמת GFP בתחום זה של התא היא מדידת החזקה ביותר להפלות בין תאים נגועים ולא נגועים. במקרים מסוימים, ניתן למצוא חיידקים להתרבות מחוץ פרי-גרעין או כיסוי במיד...

מתוארות שתי בדיקות לבדיקת תפוקה גבוהה מבוססת מיקרוסקופיה של גורמי מארח המעורבים בזיהום ברוצלה. בדיקת הכניסה מזהה גורמי מארח הנדרשים לכניסת ברוצלה ובדיקת נקודת הקצה הנדרשים לשכפול תוך תאי. בעוד שרלוונטי לגישות חלופיות, בדיקת siRNA בתאי HeLa משמשת להמחשת הפרוטוקולים.

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

המטרה הכוללת של בדיקה זו, המבוססת על מיקרוסקופיה בקיבולת גבוהה (high-throughput), היא לזהות גורמי מאכסן המעורבים בזיהום של תאי HeLa על ידי Brucella. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האינטראקציה בין המאכסן לפתוגן, כגון זיהוי חלבוני מאכסן המקדמים או מונעים קולוניזציה על ידי הפתוגן התוך-תאי Brucella. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שזרימת העבודה החלקית-אוטומטית, מהמעבדה ועד לניתוח התמונות, מאפשרת שימוש ברובוטים ויצירת ניסויים ביעילות ובקיבולת גבוהה.בדרך זו, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי האינטראקציות של Brucella עם המאכסן באמצעות סריקות siRNA. את רוב הפרוטוקול ניתן להחיל על אסטרטגיות סריקה אחרות, כגון ספריות siRNA.לאחר גידול תאי HeLa והכנת פלטות סריקה עם siRNAs בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הפשיר פלטה שחורה בעלת 384 בארות באמצעות סרימרגציה במהירות של 300 ×g ובטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הכן מצע טרנספקציה באמצעות dmem בטמפרטורת החדר ללא FCS. לדלל את סוכן הטרנספקציה ביחס של 1:200 ולערבב בזהירות לפני השימוש.באמצעות מפזר ריאגנטים, הוסף 25 µL של מצע טרנספקציה לכל באער בלוח 384 באערים וערבב את התמיסות על ידי הנעת הלוח קדימה ואחורה. הדגר את הלוח בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסים של ריאגנט טרנספקציית siRNA. בינתיים, הכן תאי HeLa על ידי שאיבת מצע התרבית והוספת 2.5 mL של 0.05% trypsin EDTA ב-PBS לשטיפה חד-פעמית של התאים הסובקונפלואנטיים בבקבוק של 75 cm².לאחר מכן, הוסיפו 1.5 milliliters של trypsin טרי והעבירו את הבקבוק ל-37 degrees Celsius למשך שתי עד שלוש דקות עד שהתאים יעגלו. השתמשו ב-10 milliliters של dmem 60%FCS מחומם מראש כדי לתלות מחדש את התאים. לאחר מכן, השתמשו בסופר תאים אוטומטי כדי לספור את התאים לפני הכנת תרחיף תאים בריכוז של 10,000 תאים ל-milliliter ב-dmem עם 16%FCS.הוסיפו 50 µL מתליה של התאים לכל באער של ריאגנט טרנספקציה, כך שיהיו 500 תאים בכל באער. הזיזו את הפלטה קדימה ואחורה כדי לפזר את התאים באופן שווה.לאחר מכן, השאירו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 5 עד 10 דקות כדי לאפשר לתאים לשקוע. השתמשו ב-parafilm כדי לאטום את הפלטה. דגרו אותה באינקובטור לח על פלטת אלומיניום שחוממה מראש בטמפרטורה של 37 °C עם 5% C02 למשך 72 שעות.עבודה עם הפתוגן B.abortus, המוגדר כרמה 3, היא מסוכנת ויש להישמע לתקנות בטיחות ביולוגית מקומיות, הכוללות לבישת חליפת מגן, כפפות מגן, מסכה ומשקפי מגן. יום אחד לפני ההדבקה, יש להחדיר את הכמות שנקבעה מראש של תרבית התנע של B.abortus לתוך 50 milliliters של מצע TSB KM, בבקבוק עם פקק הברגה בנפח 250 milliliters.השתמשו ב-parafilm לאיטום הבקבוק והדגירו את החיידקים למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובמהירות של 100 RPM על שייקר, עד להגעה לצפיפות אופטית (OD600) של 0.8 עד 1.1. מדדו את הצפיפות האופטית 600 של תרבית החיידקים. הכינו את מצע ההדבקה על ידי דילול תרבית החיידקים ב-dmem 10%FCS כדי להגיע לריבוי ההדבקה (MOI) הרצוי.או MOI. באמצעות שוטפת פלטות אוטומטית, החליפו את מצע הטרנספקציה ב-50 µL של מצע הדבקה. בתוך המנדף, העבירו את הפלטה לכלוב הצנטריפוגה וסבבו את פלטת 384 הבארים ב-400 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות.לאחר מכן, השתמשו ב-parafilm כדי לאטום את הפלטה והדגירו אותה על פלטת אלומיניום שחוממה מראש בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה, השתמשו בשוטה פלטות אוטומטית עם DMEM עם 10% FCS המכיל 100 µg/mL של dentrimycine או GM כדי לשטוף את התאים ולהשבית חיידקים חוץ-תאיים. לאחר מכן, השתמשו ב-parafilm כדי לאטום את הפלטה והחזירו אותה לפלטת האלומיניום שחוממה מראש בתוך האינקובטור למשך 40 שעות נוספות לצורך בדיקת נקודת הסיום.כדי לקבע את התאים, ראשית יש להשתמש ב-PBS לשטיפת הבארות. לאחר מכן, יש להחליף את ה-PBS ב-50 µL של 3.7% PFA ב-pH 7.4.דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, השתמשו ב-50 microliters של PBS כדי להחליף את תמיסת הקיבוע. לצביעת הדגימות באמצעות שוטף פלטות אוטומטי, התחילו בשימוש ב-50 microliters של 1%Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות כדי להחדיר את החומרים לתאים (permeabilization).לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים באמצעות PBS, יש להוסיף 50 µL של PBS עם 1 µg/mL של DAPI ולהדגיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS לפני הגנה עליהם מפני אור. העבירו את הפלטה למיקרוסקופ האוטומטי.הגדירו את פרמטרי המיקרוסקופ. בחרו בעדשה אובייקטיבית של 10-X. לאחר מכן, בחרו בפורמט הפלטה המתאים לפלטה של 384 בארות.רכשו תשעה אתרים לכל באר. בחרו באפשרות Enable laser-based focusing. לאחר מכן, בצעו מיקוד (focus) על הפלטה ועל תחתית הבאר.לאחר מכן, הגדירו את הבאר הראשונה שנרכשה כבאר הראשונית לאיתור הדגימה ואת כל האתרים עבור מיקוד אוטומטי של אתרים (site autofocus). לאחר מכן, עבור ערוץ ה-DAPI, כווננו ידנית את היסט ה-Z עבור המיקוד. לאחר מכן, לחצו על Find Sample כדי לקבוע את המיקוד על תחתית הבאר.השתמשו בפונקציית ה-AutoExposure כדי לקבל הערכה טובה של זמן החשיפה. תקנו ידנית את זמן החשיפה עבור ערוץ ה-DAPI כדי להבטיח טווח דינמי רחב עם חשיפת יתר נמוכה. השתמשו בזמן חשיפה זה כדי לדגום מספר אתרים ברחבי הפלטה.כוון ידנית את זמן החשיפה עד שהפיקסלים הבהירים ביותר יגיעו לכ-80% מהבהירות המקסימלית על פני האתרים. חזור על השלבים לקביעת המיקוד וזמן החשיפה בהתאם עבור כל שאר הערוצים. לאחר מכן, התחל ברכישת נתונים של הפלטה המלאה.עבור בדיקת נקודת הסיום, השתמש בערוצי ה-DAPI וה-GFP כדי לצלם את הפלטה המלאה. כדי להריץ ניתוח תמונות של תאים צבועים בבדיקת נקודת הסיום, לאחר חישוב מודל הצללה, בחר את תיקיית הקלט עם התמונות ואת תיקיית הפלט עבור התוצאות, בהתאם לפרוטוקול הטקסט תחת "View output settings". לאחר מכן, הגדר את הטקסט המשותף לתמונות, וטען את מודלי ההצללה.לחצו על Start test mode וודאו שהגדרות ההפסקה והתצוגה עבור כל המודולים מבוטלות. הפעילו את הגדרות ההפסקה והתצוגה עבור מודול תשעה ImageMath. סמל ההפסקה המופעל יופיע בצבע צהוב.פונקציית התצוגה המופעלת תופיע כעין פתוחה. לאחר מכן, לחץ על Run כדי להריץ את הניתוח עד למודול תשע. במודול תשע, התאם את הפרמטר multiply the second image by לערך שידכא את אות ה-DAPI ב-Brucella מבלי לדכא את הגרעינים.כדי לבחון את הערכים עבור המודול, לחצו על Step. לחצו לחיצה ימנית על התמונה שנפתחה והגדירו את ניגודיות התמונה (image contrast) ל-log normalized. חזרו שוב בצעדים אחורה עד למודול תשע.כווננו את הפרמטר multiply the second image by והריצו שוב את המודול עד שהאות של ה-Brucella ידוכא לחלוטין, ובו בזמן ששטחים שחורים המעידים על ביטול-יתר (oversubtraction) יהיו מינימליים. מציאת פרמטרים מתאימים עבור מודולים מסוימים דורשת אופטימיזציה הדרגתית של הפרמטרים. חשוב מאוד להריץ את המודולים שוב ושוב, לנסות ערכים שונים ולבחון את ההשפעה על התוצאה המוצגת.הפעל את אפשרויות ההפסקה והתצוגה עבור מודול 10. זהה את האובייקטים הראשוניים. הגדר את הגבול התחתון של הפרמטר ב-threshold, ברמה גבוהה מספיק כדי שהגרעינים יסומנו והרקע יזנח.כדי לזהות ערך מתאים, רחפו מעל המודול, לחצו לחיצה ימנית על תמונת הקלט והציגו את ההיסטוגרמה, שבה הפסגה מעידה בדרך כלל על הרקע. החל מעוצמת הרקע, הגבירו את הפרמטר עד להשגת סגמנטציה טובה של הגרעינים, כפי שמוצג בתמונת הפלט. מטרת תהליך ניתוח התמונה היא לזהות תאים המכילים חיידקים בשלב השכפול.דבר זה מושג על ידי הגדרת ספי thresholds שונות עבור אות הפתוגן בגרעין, במיקרו-סביבת הגרעין (peri-nucleus) ובגוף תא הוורונוי (Voronoi cell body). הפעל את אפשרויות ההפסקה והתצוגה עבור מודול 15. סנן אובייקטים, כפי שהודגם קודם לכן, ולחץ על Run.הגדירו את ערך המינימום של הפרמטר לגובה מספיק, כך שרק תאים עם Brucella גלויה בבירור בגרעין יישמרו, וכל השאר יסוננו. כדי לזהות ערך מתאים, דלגו על המודול והציגו את תמונת הפלט. הגבירו את הערך באופן מדורג עד שרק תאים עם Brucella גלויה בבירור בגרעין יישמרו.לאחר סינון תאים עם חיידקים בפרי-גרעין (peri-nucleus) ובגוף תא וורונוי (Voronoi cell body) במודולים 16 ו-17 בהתאם לפרוטוקול הטקסט, צא ממצב הבדיקה ובטל את סימון כל סמלי העין לצד המודולים כדי להבטיח שאף אחד מהמודולים לא יציג את התצוגה שלו לפני הרצת הניתוח המלא. לבסוף, לחץ על Analyze Images כדי להתחיל בניתוח. כאשר הניתוח יסתיים, בחן את תמונות ה-PNG שהתקבלו וכן את גיליון ה-CSV כדי לוודא שהניתוח פעל באופן אמין לאורך כל הפלטה.בצעו את בדיקת הכניסה ואת דירוג ההדבקה בהתאם לפרוטוקול הכתוב. איור זה מציג דוגמה לניתוח תמונות המשמש לזיהוי אוטומטי של תאים נגועים בבדיקת נקודת הסיום. זוהו גרעינים של תאי HeLa שנצבעו ב-DAPI.חושב אזור פרי-גרעיני (peri-nucleus) ברוחב של שמונה פיקסלים המקיף את הגרעין, וגוף תא וורונוי (Voronoi cell body) על ידי הרחבת הגרעין ב-25 פיקסלים. תא נחשב למודבק אם אות הפתוגן עלה על הסף המתאים לפחות במדגם אחד.חיידקי Brucella דורשים ארגון מחדש של actin כדי להשתלב בהצלחה בתאי המאכסן. לכן, דילול של ARP23 מהווה בקרת חיובית מתאימה לסריקת siRNA. דילול של ARPC3 הפחית את מספר התאים עם חיידקים השוכפלים יומיים לאחר ההדבקה.בהשוואה לתאי ביקורת שטופלו ב-scrambled. ניתוח תמונות אוטומטי הראה באופן כמותי ירידה בזיהום של תאי HeLa שבהם נושל ARPC3 בהשוואה לתאי ביקורת בגרף זה. נושל ARPC3 הראה גם הפחתה בזיהום Brucella במבחן הכניסה בהשוואה לתאי ביקורת.כפי שניתן לראות במספר המופחת של חיידשיי Brucella תוך-תאיים המוצגים בצהוב. לבסוף, כימות של הזיהום באמצעות ניתוח תמונה אוטומטי אישש כי מספר התאים הזוהמים, כמו גם מספר החיידקים התוך-תאיים בתאים הזוהמים, פחתו בעקבות דילול של ARPC3. לאחר שליטה בפרוטוקול, ניתן לקבל תוצאות ניתוח תמונה בתוך שבוע וחצי מתחילת הניסוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבחון בקפידה את תוצאות ניתוח התמונות כדי לוודא שהפרמטרים שנבחרו מתפקדים היטב לאורך כל הפלטה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון דימוי תאים חיים (life cell imaging), כדי לענות על שאלות נוספות, למשל כאשר עוקבים אחר תהליכי תעתוע (trafficking) של גורם מאכסן מסוים המקיים אינטראקציה עם Brucella.או כיצד דלטורה של גן משפיעה על הדינמיקה התוך-תאית של זיהום. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של הזיהומים לחקור גורמי מאכסן הדרושים לזיהום ב-Brucella במערך של תאי HeLa. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות גורמי מאכסן המעודדים, או מונעים, התנחלות מוצלחת של הפתוגן התוך-תאי Brucella abortus בתאי HeLa.אל תשכחו כי עבודה עם Brucella abortus עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להקפיד על כיבודן המלא של תקנות הביו-בטיחות המקומיות.

microscopy-based-assays-for-high-throughput-screening-host-factors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: קזנובה, א., ואחרים. בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה לסינון מהיר של גורמי מארח המעורבים בזיהום ברוסלה בתאי הלה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיה בתפוקה גבוהה של זיהום Brucella abortus בתאי אפיתל עם הפלת STING מתווכת siRNA, כדי לחקור את תפקיד חישת DNA ציטוזולי בשכפול חיידקים תוך-תאיים ובתגובה החיסונית המולדת של המארח.

הדמיה בקצב גבוה של זיהום תוך-תאי ברוסלה אבורדוס בתאי אפיתל של המארח

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך...

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

פיתחנו assay מבוססי לזיהוי של עיצוב רב טוב עבור בודק את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד. Assay הזה הוא תואם cytometry זרימה immunostaining, מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשרות מדידות כמותיים של אינטראקציות biomechanical בין תאים, מטריצה חוץ-תאית, לבין חיידקים פתוגניים.

Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד

מחקר זה פיתח בדיקה לסינון בתפוקה גבוהה נגד Mycobacterium abscessus עם זן כפול של כתב שנוצר לאחרונה, תוך שימוש בפלואורסצנטיות ולומינסנציה כדי להעריך את כדאיות החיידקים במהירות. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי לחוקרים השואפים לסנן תרופות חדשות נגד חיידק עמיד לתרופות.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

למד זיהוי גורמי מארח בזיהום Brucella בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופיה בעלת תפוקה גבוהה ומסכי siRNA. שיטה זו מאפשרת חקירת אינטראקציות פתוגן-מארח ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות עתידיות.

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים

גלה סרטונים נוספים