מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים

המטרה הכוללת של בדיקה זו, המבוססת על מיקרוסקופיה בקיבולת גבוהה (high-throughput), היא לזהות גורמי מאכסן המעורבים בזיהום של תאי HeLa על ידי Brucella. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האינטראקציה בין המאכסן לפתוגן, כגון זיהוי חלבוני מאכסן המקדמים או מונעים קולוניזציה על ידי הפתוגן התוך-תאי Brucella. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שזרימת העבודה החלקית-אוטומטית, מהמעבדה ועד לניתוח התמונות, מאפשרת שימוש ברובוטים ויצירת ניסויים ביעילות ובקיבולת גבוהה.

בדרך זו, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי האינטראקציות של Brucella עם המאכסן באמצעות סריקות siRNA. את רוב הפרוטוקול ניתן להחיל על אסטרטגיות סריקה אחרות, כגון ספריות siRNA.

לאחר גידול תאי HeLa והכנת פלטות סריקה עם siRNAs בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הפשיר פלטה שחורה בעלת 384 בארות באמצעות סרימרגציה במהירות של 300 ×g ובטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הכן מצע טרנספקציה באמצעות dmem בטמפרטורת החדר ללא FCS. לדלל את סוכן הטרנספקציה ביחס של 1:200 ולערבב בזהירות לפני השימוש.

באמצעות מפזר ריאגנטים, הוסף 25 µL של מצע טרנספקציה לכל באער בלוח 384 באערים וערבב את התמיסות על ידי הנעת הלוח קדימה ואחורה. הדגר את הלוח בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסים של ריאגנט טרנספקציית siRNA. בינתיים, הכן תאי HeLa על ידי שאיבת מצע התרבית והוספת 2.5 mL של 0.05% trypsin EDTA ב-PBS לשטיפה חד-פעמית של התאים הסובקונפלואנטיים בבקבוק של 75 cm².

לאחר מכן, הוסיפו 1.5 milliliters של trypsin טרי והעבירו את הבקבוק ל-37 degrees Celsius למשך שתי עד שלוש דקות עד שהתאים יעגלו. השתמשו ב-10 milliliters של dmem 60%FCS מחומם מראש כדי לתלות מחדש את התאים. לאחר מכן, השתמשו בסופר תאים אוטומטי כדי לספור את התאים לפני הכנת תרחיף תאים בריכוז של 10,000 תאים ל-milliliter ב-dmem עם 16%FCS.

הוסיפו 50 µL מתליה של התאים לכל באער של ריאגנט טרנספקציה, כך שיהיו 500 תאים בכל באער. הזיזו את הפלטה קדימה ואחורה כדי לפזר את התאים באופן שווה.

לאחר מכן, השאירו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 5 עד 10 דקות כדי לאפשר לתאים לשקוע. השתמשו ב-parafilm כדי לאטום את הפלטה. דגרו אותה באינקובטור לח על פלטת אלומיניום שחוממה מראש בטמפרטורה של 37 °C עם 5% C02 למשך 72 שעות.

עבודה עם הפתוגן B.abortus, המוגדר כרמה 3, היא מסוכנת ויש להישמע לתקנות בטיחות ביולוגית מקומיות, הכוללות לבישת חליפת מגן, כפפות מגן, מסכה ומשקפי מגן. יום אחד לפני ההדבקה, יש להחדיר את הכמות שנקבעה מראש של תרבית התנע של B.abortus לתוך 50 milliliters של מצע TSB KM, בבקבוק עם פקק הברגה בנפח 250 milliliters.

השתמשו ב-parafilm לאיטום הבקבוק והדגירו את החיידקים למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובמהירות של 100 RPM על שייקר, עד להגעה לצפיפות אופטית (OD600) של 0.8 עד 1.1. מדדו את הצפיפות האופטית 600 של תרבית החיידקים. הכינו את מצע ההדבקה על ידי דילול תרבית החיידקים ב-dmem 10%FCS כדי להגיע לריבוי ההדבקה (MOI) הרצוי.

או MOI. באמצעות שוטפת פלטות אוטומטית, החליפו את מצע הטרנספקציה ב-50 µL של מצע הדבקה. בתוך המנדף, העבירו את הפלטה לכלוב הצנטריפוגה וסבבו את פלטת 384 הבארים ב-400 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות.

לאחר מכן, השתמשו ב-parafilm כדי לאטום את הפלטה והדגירו אותה על פלטת אלומיניום שחוממה מראש בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה, השתמשו בשוטה פלטות אוטומטית עם DMEM עם 10% FCS המכיל 100 µg/mL של dentrimycine או GM כדי לשטוף את התאים ולהשבית חיידקים חוץ-תאיים. לאחר מכן, השתמשו ב-parafilm כדי לאטום את הפלטה והחזירו אותה לפלטת האלומיניום שחוממה מראש בתוך האינקובטור למשך 40 שעות נוספות לצורך בדיקת נקודת הסיום.

כדי לקבע את התאים, ראשית יש להשתמש ב-PBS לשטיפת הבארות. לאחר מכן, יש להחליף את ה-PBS ב-50 µL של 3.7% PFA ב-pH 7.4.

דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, השתמשו ב-50 microliters של PBS כדי להחליף את תמיסת הקיבוע. לצביעת הדגימות באמצעות שוטף פלטות אוטומטי, התחילו בשימוש ב-50 microliters של 1%Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות כדי להחדיר את החומרים לתאים (permeabilization).

לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים באמצעות PBS, יש להוסיף 50 µL של PBS עם 1 µg/mL של DAPI ולהדגיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS לפני הגנה עליהם מפני אור. העבירו את הפלטה למיקרוסקופ האוטומטי.

הגדירו את פרמטרי המיקרוסקופ. בחרו בעדשה אובייקטיבית של 10-X. לאחר מכן, בחרו בפורמט הפלטה המתאים לפלטה של 384 בארות.

רכשו תשעה אתרים לכל באר. בחרו באפשרות Enable laser-based focusing. לאחר מכן, בצעו מיקוד (focus) על הפלטה ועל תחתית הבאר.

לאחר מכן, הגדירו את הבאר הראשונה שנרכשה כבאר הראשונית לאיתור הדגימה ואת כל האתרים עבור מיקוד אוטומטי של אתרים (site autofocus). לאחר מכן, עבור ערוץ ה-DAPI, כווננו ידנית את היסט ה-Z עבור המיקוד. לאחר מכן, לחצו על Find Sample כדי לקבוע את המיקוד על תחתית הבאר.

השתמשו בפונקציית ה-AutoExposure כדי לקבל הערכה טובה של זמן החשיפה. תקנו ידנית את זמן החשיפה עבור ערוץ ה-DAPI כדי להבטיח טווח דינמי רחב עם חשיפת יתר נמוכה. השתמשו בזמן חשיפה זה כדי לדגום מספר אתרים ברחבי הפלטה.

כוון ידנית את זמן החשיפה עד שהפיקסלים הבהירים ביותר יגיעו לכ-80% מהבהירות המקסימלית על פני האתרים. חזור על השלבים לקביעת המיקוד וזמן החשיפה בהתאם עבור כל שאר הערוצים. לאחר מכן, התחל ברכישת נתונים של הפלטה המלאה.

עבור בדיקת נקודת הסיום, השתמש בערוצי ה-DAPI וה-GFP כדי לצלם את הפלטה המלאה. כדי להריץ ניתוח תמונות של תאים צבועים בבדיקת נקודת הסיום, לאחר חישוב מודל הצללה, בחר את תיקיית הקלט עם התמונות ואת תיקיית הפלט עבור התוצאות, בהתאם לפרוטוקול הטקסט תחת "View output settings". לאחר מכן, הגדר את הטקסט המשותף לתמונות, וטען את מודלי ההצללה.

לחצו על Start test mode וודאו שהגדרות ההפסקה והתצוגה עבור כל המודולים מבוטלות. הפעילו את הגדרות ההפסקה והתצוגה עבור מודול תשעה ImageMath. סמל ההפסקה המופעל יופיע בצבע צהוב.

פונקציית התצוגה המופעלת תופיע כעין פתוחה. לאחר מכן, לחץ על Run כדי להריץ את הניתוח עד למודול תשע. במודול תשע, התאם את הפרמטר multiply the second image by לערך שידכא את אות ה-DAPI ב-Brucella מבלי לדכא את הגרעינים.

כדי לבחון את הערכים עבור המודול, לחצו על Step. לחצו לחיצה ימנית על התמונה שנפתחה והגדירו את ניגודיות התמונה (image contrast) ל-log normalized. חזרו שוב בצעדים אחורה עד למודול תשע.

כווננו את הפרמטר multiply the second image by והריצו שוב את המודול עד שהאות של ה-Brucella ידוכא לחלוטין, ובו בזמן ששטחים שחורים המעידים על ביטול-יתר (oversubtraction) יהיו מינימליים. מציאת פרמטרים מתאימים עבור מודולים מסוימים דורשת אופטימיזציה הדרגתית של הפרמטרים. חשוב מאוד להריץ את המודולים שוב ושוב, לנסות ערכים שונים ולבחון את ההשפעה על התוצאה המוצגת.

הפעל את אפשרויות ההפסקה והתצוגה עבור מודול 10. זהה את האובייקטים הראשוניים. הגדר את הגבול התחתון של הפרמטר ב-threshold, ברמה גבוהה מספיק כדי שהגרעינים יסומנו והרקע יזנח.

כדי לזהות ערך מתאים, רחפו מעל המודול, לחצו לחיצה ימנית על תמונת הקלט והציגו את ההיסטוגרמה, שבה הפסגה מעידה בדרך כלל על הרקע. החל מעוצמת הרקע, הגבירו את הפרמטר עד להשגת סגמנטציה טובה של הגרעינים, כפי שמוצג בתמונת הפלט. מטרת תהליך ניתוח התמונה היא לזהות תאים המכילים חיידקים בשלב השכפול.

דבר זה מושג על ידי הגדרת ספי thresholds שונות עבור אות הפתוגן בגרעין, במיקרו-סביבת הגרעין (peri-nucleus) ובגוף תא הוורונוי (Voronoi cell body). הפעל את אפשרויות ההפסקה והתצוגה עבור מודול 15. סנן אובייקטים, כפי שהודגם קודם לכן, ולחץ על Run.

הגדירו את ערך המינימום של הפרמטר לגובה מספיק, כך שרק תאים עם Brucella גלויה בבירור בגרעין יישמרו, וכל השאר יסוננו. כדי לזהות ערך מתאים, דלגו על המודול והציגו את תמונת הפלט. הגבירו את הערך באופן מדורג עד שרק תאים עם Brucella גלויה בבירור בגרעין יישמרו.

לאחר סינון תאים עם חיידקים בפרי-גרעין (peri-nucleus) ובגוף תא וורונוי (Voronoi cell body) במודולים 16 ו-17 בהתאם לפרוטוקול הטקסט, צא ממצב הבדיקה ובטל את סימון כל סמלי העין לצד המודולים כדי להבטיח שאף אחד מהמודולים לא יציג את התצוגה שלו לפני הרצת הניתוח המלא. לבסוף, לחץ על Analyze Images כדי להתחיל בניתוח. כאשר הניתוח יסתיים, בחן את תמונות ה-PNG שהתקבלו וכן את גיליון ה-CSV כדי לוודא שהניתוח פעל באופן אמין לאורך כל הפלטה.

בצעו את בדיקת הכניסה ואת דירוג ההדבקה בהתאם לפרוטוקול הכתוב. איור זה מציג דוגמה לניתוח תמונות המשמש לזיהוי אוטומטי של תאים נגועים בבדיקת נקודת הסיום. זוהו גרעינים של תאי HeLa שנצבעו ב-DAPI.

חושב אזור פרי-גרעיני (peri-nucleus) ברוחב של שמונה פיקסלים המקיף את הגרעין, וגוף תא וורונוי (Voronoi cell body) על ידי הרחבת הגרעין ב-25 פיקסלים. תא נחשב למודבק אם אות הפתוגן עלה על הסף המתאים לפחות במדגם אחד.

חיידקי Brucella דורשים ארגון מחדש של actin כדי להשתלב בהצלחה בתאי המאכסן. לכן, דילול של ARP23 מהווה בקרת חיובית מתאימה לסריקת siRNA. דילול של ARPC3 הפחית את מספר התאים עם חיידקים השוכפלים יומיים לאחר ההדבקה.

בהשוואה לתאי ביקורת שטופלו ב-scrambled. ניתוח תמונות אוטומטי הראה באופן כמותי ירידה בזיהום של תאי HeLa שבהם נושל ARPC3 בהשוואה לתאי ביקורת בגרף זה. נושל ARPC3 הראה גם הפחתה בזיהום Brucella במבחן הכניסה בהשוואה לתאי ביקורת.

כפי שניתן לראות במספר המופחת של חיידשיי Brucella תוך-תאיים המוצגים בצהוב. לבסוף, כימות של הזיהום באמצעות ניתוח תמונה אוטומטי אישש כי מספר התאים הזוהמים, כמו גם מספר החיידקים התוך-תאיים בתאים הזוהמים, פחתו בעקבות דילול של ARPC3. לאחר שליטה בפרוטוקול, ניתן לקבל תוצאות ניתוח תמונה בתוך שבוע וחצי מתחילת הניסוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבחון בקפידה את תוצאות ניתוח התמונות כדי לוודא שהפרמטרים שנבחרו מתפקדים היטב לאורך כל הפלטה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון דימוי תאים חיים (life cell imaging), כדי לענות על שאלות נוספות, למשל כאשר עוקבים אחר תהליכי תעתוע (trafficking) של גורם מאכסן מסוים המקיים אינטראקציה עם Brucella.

או כיצד דלטורה של גן משפיעה על הדינמיקה התוך-תאית של זיהום. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של הזיהומים לחקור גורמי מאכסן הדרושים לזיהום ב-Brucella במערך של תאי HeLa. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות גורמי מאכסן המעודדים, או מונעים, התנחלות מוצלחת של הפתוגן התוך-תאי Brucella abortus בתאי HeLa.

אל תשכחו כי עבודה עם Brucella abortus עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להקפיד על כיבודן המלא של תקנות הביו-בטיחות המקומיות.