מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים Brucella זיהום של תאים הלה

המטרה הכוללת של בדיקה מבוססת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה זו היא לזהות גורמים מארחים המעורבים בזיהום ברוצלה של תאי HeLa. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציה של פתוגן מארח, כגון זיהוי חלבונים מארחים המקדמים או מונעים קולוניזציה על ידי הפתוגן התוך-תאי ברוצלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזרימת העבודה האוטומטית למחצה מהמעבדה הווטרינרית לניתוח תמונות מאפשרת רובוטים ויצירת ניסויים יעילים בתפוקה גבוהה.

כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות מארח ברוצלה באמצעות מסכי siRNA. ניתן ליישם את רוב הפרוטוקול על אסטרטגיות סינון אחרות. לדוגמה, או ספריות siRNA.

לאחר תרבית תאי HeLa והכנת לוחות סינון עם siRNAs על פי פרוטוקול הטקסט, יש להפשיר צלחת באר שחורה של 384 על ידי צנטריפוגה ב-300 פעמים G וטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הכן מדיום טרנספקציה באמצעות dmem בטמפרטורת החדר ללא FCS. כדי לדלל את מגיב הטרנספקציה אחד עד 200 ולערבב בזהירות לפני השימוש.

בעזרת מתקן ריאגנט הוסף 25 מיקרוליטר של מדיום טרנספקציה לכל באר של צלחת 384 הבאר וערבב את התמיסות על ידי הזזת הצלחת קדימה ואחורה. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לאפשר היווצרות קומפלקס ריאגנטים של טרנספקציה siRNA. בינתיים, הכינו תאי HeLa על ידי שאיבת מדיום התרבית והוספת 2.5 מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA ב-PBS כדי לשטוף את התאים התת-משותפים של בקבוק של 75 סנטימטר רבוע פעם אחת.

לאחר מכן מוסיפים 1.5 מיליליטר טריפסין טרי ומעבירים את הבקבוק ל -37 מעלות צלזיוס למשך שתיים-שלוש דקות עד שהתאים מתעגלים. השתמש ב-10 מיליליטר של dmem מחומם מראש 60% FCS כדי להשעות מחדש את התאים. לאחר מכן, השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים לפני הכנת תרחיף תאים של 10,000 תאים למיליליטר ב-dmem עם 16% FCS.

הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של מגיב טרנספקציה. התוצאה היא 500 תאים לבאר. הזז את הצלחת קדימה ואחורה כדי לפזר את התאים באופן שווה.

לאחר מכן, השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתייצב. השתמש בפרפילם כדי לאטום את הצלחת. ודגרו אותו באינקובטור לח על צלחת אלומיניום שחוממה מראש ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% C02 למשך 72 שעות.

העבודה עם הפתוגן מדרגה 3 B.abortus מסוכנת ויש לעקוב אחר תקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות הכוללות לבישת חליפת מגן, כפפות מגן, מסכה ומשקפי מגן. יום אחד, לפני ההדבקה, יש לחסן את הכמות שנקבעה קודם לכן של תרבית התחלה של B.abortus ב-50 מיליליטר של מדיום TSB KM. בבקבוק פקק הברגה של 250 מיליליטר.

השתמש בפרפילם כדי לאטום את הבקבוק ולגדל חיידקים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-100 סל"ד על שייקר לצפיפות אופטית של 600.8 עד 1.1. מדוד את הצפיפות האופטית 600 של תרבית החיידקים. והכינו את מדיום הזיהום על ידי דילול תרבית החיידקים ב-dmem 10%FCS כדי להשיג את ריבוי הזיהום הרצוי.

או, MOI. באמצעות מכונת כביסה אוטומטית החלף את מדיום הטרנספקציה עם 50 מיקרוליטר של מדיום זיהום. בתוך מכסה המנוע, העבירו את הצלחת לכלוב הצנטריפוגה וצנטריפוגה את צלחת הבאר 384 בטמפרטורה של 400 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן, השתמש בפרפילם כדי לאטום את הצלחת ולדגור אותה על צלחת אלומיניום שחוממה מראש ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% C02 למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה עם מכונת הכביסה האוטומטית השתמש ב-dmem עם 10% FCS המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר של דנטרימיזן או GM כדי לשטוף את התאים כדי לנטרל חיידקים חוץ-תאיים. לאחר מכן, השתמש בפרפילם כדי לאטום את הצלחת ולהניח אותה בחזרה על צלחת האלומיניום שחוממה מראש בחממה למשך 40 שעות נוספות לבדיקת נקודת הקצה.

כדי לתקן את התאים, השתמש תחילה ב- PBS כדי לשטוף את הבארות. לאחר מכן, החלף את ה-PBS ב-50 מיקרוליטר של 3.7% PFA. ב-2 ב-pH 7.4.

ודוגרים על התאים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר הדגירה השתמש ב -50 מיקרוליטר PBS כדי להחליף את מדיום הקיבוע. כדי להכתים את הדגימות עם מכונת הכביסה האוטומטית, התחל בשימוש ב-50 מיקרוליטר של 1%Triton X-100 ב-PBS למשך 10 דקות כדי לחלחל לתאים.

לאחר השימוש ב-PBS לשטיפת התאים שלוש פעמים, הוסיפו 50 מיקרוליטר PBS עם מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים לפני שתגן עליהם מפני אור. העבירו את הצלחת למיקרוסקופ האוטומטי.

הגדר את פרמטרי המיקרוסקופ. בחר את הסובייקטיבי של פי 10. לאחר מכן בחר את פורמט הצלחת המתאים לצלחת הבאר 384.

רכוש תשעה אתרים לכל באר. בחר הפוך מיקוד מבוסס לייזר לזמין. וכן, התמקדו בצלחת ובתחתית הבאר.

לאחר מכן, הגדר את הבאר הראשונה שנרכשה כבאר הראשונית למציאת המדגם וכל האתרים למיקוד אוטומטי באתר. לאחר מכן, עבור ערוץ DAPI התאם ידנית את היסט Z עבור המיקוד. לאחר מכן, לחץ על מצא דוגמה כדי להגדיר את המיקוד בתחתית הבאר.

שימוש בפונקציית החשיפה האוטומטית קבל הערכה טובה עבור זמן החשיפה. תקן ידנית את זמן החשיפה של ערוץ DAPI כדי להבטיח טווח דינמי רחב עם חשיפת יתר נמוכה. השתמש בזמן חשיפה זה כדי לצלם מספר אתרים ברחבי הצלחת.

והתאם את זמן החשיפה באופן ידני עד שהפיקסלים הבהירים ביותר יגיעו לכ-80% מהבהירות המקסימלית על פני האתרים. חזור על השלבים כדי להגדיר את המיקוד וזמן החשיפה, בהתאם לכל הערוצים האחרים. לאחר מכן, התחל לרכוש את הצלחת המלאה.

לבדיקת נקודת הקצה, השתמשו בערוצי DAPI ו- GFP להדמיית הלוח המלא. כדי להריץ ניתוח תמונה על תאים מוכתמים בבדיקת נקודת הקצה, לאחר חישוב מודל הצללה, על פי פרוטוקול הטקסט תחת הצג הגדרות פלט בחר את תיקיית הקלט עם התמונות ותיקיית פלט עם התוצאות. לאחר מכן, הגדר את הטקסט המשותף לתמונות, וטען את דגמי ההצללה.

לחץ על התחל מצב בדיקה וודא שהגדרת ההשהיה והתצוגות עבור כל המודולים מושבתת. הפעל את הגדרת ההשהיה והתצוגה עבור מודול תשע ImageMath. סמל ההשהיה המופעל יופיע בצהוב.

פונקציית התצוגה המופעלת תופיע כעין פקוחה. לאחר מכן, לחץ על הפעל כדי להריץ את הניתוח עד מודול תשע. במודול תשע, התאם את הפרמטר, הכפל את התמונה השנייה לערך שידכא את אות ה-DAPI בברוצלה מבלי לדכא את הגרעינים.

כדי לבדוק את הערכים עבור המודול, לחץ על Step. לחץ לחיצה ימנית על התמונה החדשה שנפתחה והגדר את ניגודיות התמונה לרישום מנורמל. שוב ושוב, צעד אחורה למודול תשע.

התאם את הפרמטר, הכפל את התמונה השנייה וצעד שוב מעל המודול עד שאות הברוצלה מדוכא לחלוטין ובמקביל ממוזערים אזורים שחורים המעידים על חיסור יתר. מציאת פרמטרים טובים עבור מודולים מסוימים מחייבת אופטימיזציה הדרגתית של הפרמטרים. בהחלט חשוב לעבור שוב ושוב על המודולים, לנסות ערכים שונים ולהתבונן בהשפעה על התוצאה המוצגת.

אפשר השהיה ותצוגה עבור מודול 10. זיהוי אובייקטים עיקריים. הגדר את הגבול התחתון של הפרמטר על הסף, גבוה מספיק כדי שהגרעינים יהיו מפולחים ומתעלמים מהרקע.

כדי לזהות ערך טוב, צעד מעל המודול, לחץ לחיצה ימנית על תמונת הקלט והצג את ההיסטוגרמה שבה השיא מציין בדרך כלל רקע. החל מעוצמת הרקע הגדל את הפרמטר עד להשגת פילוח טוב של גרעינים כפי שמוצג בתמונת הפלט. מטרת צינור ניתוח התמונה היא לזהות תאים המכילים חיידקים משכפלים.

זה מושג על ידי קביעת ספים שונים לאות הפתוגן בגרעין, פרי-גרעין וגוף התא וורונוי. אפשר השהיה ותצוגה עבור מודול 15. סנן אובייקטים, כפי שמוצג קודם ולחץ על הפעל.

הגדר את ערך המינימום של הפרמטר גבוה מספיק כך שרק תאים עם ברוצלה נראית בבירור בגרעין יישמרו, וכל השאר יסוננו. כדי לזהות ערך טוב, צעד מעל המודול והצג את תמונת הפלט. הגדל את הערך בשלבים עד שנשמרים רק תאים עם ברוצלה הנראית בבירור בגרעין.

לאחר סינון תאים עם חיידקים בגוף התא פרי-גרעין ווורונוי במודולים 16 ו-17 לפי פרוטוקול הטקסט, צא ממצב הבדיקה ובטל את הסימון של כל סמלי העיניים ליד המודולים כדי לוודא שאף אחד מהמודולים לא מציג את התצוגה שלו לפני הפעלת הניתוח המלא. לבסוף, לחץ על נתח תמונות כדי להתחיל בניתוח. לאחר סיום הניתוח, בדוק את תמונות ה-PNG המתקבלות כמו גם את גיליון ה-CSV כדי לוודא שהניתוח עבד בצורה מהימנה בכל הצלחת.

בצע את בדיקת הכניסה וניקוד ההדבקה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. איור זה מציג דוגמה לניתוח תמונה המשמש לזיהוי אוטומטי של תאים נגועים בבדיקת נקודת הקצה. זוהו תאי גרעין HeLa מוכתמים ב-DAPI.

פרי-גרעין ברוחב שמונה פיקסלים המקיף את הגרעין. וגוף תא וורונוי על ידי הרחבת הגרעין, ב -25 פיקסלים, חושב. תא נחשב נגוע אם אות הפתוגן חרג מהסף המקביל בתא אחד לפחות.

ברוצלה דורשת סידורי פעולה מחדש למעורבות מוצלחת של תאים מארחים. לפיכך, דלדול ARP23 הוא בקרה חיובית מתאימה לבדיקת siRNA. דלדול ARPC3 הפחית את מספר התאים עם חיידקים מתרבים יומיים לאחר ההדבקה.

בהשוואה לתאים מבוקרים שטופלו במקושקשים. ניתוח תמונה אוטומטי נצפה באופן כמותי לירידה בזיהום של תאי HeLa מדוללים ARPC3 בהשוואה לתאים מבוקרים בגרף זה. דלדול ARPC3 הראה גם ירידה בזיהום ברוצלה בבדיקת הכניסה בהשוואה לתאים מבוקרים.

כפי שניתן לראות על ידי המספר המופחת של ברוצלה תוך-תאית המתוארת בצהוב. לבסוף, כימות הזיהום על ידי ניתוח תמונה אוטומטי אישר כי מספר התאים הנגועים כמו גם מספר החיידקים התוך-תאיים בתאים נגועים הופחת על ידי דלדול ARPC3. לאחר שליטה, פרוטוקול זה יכול לתת תוצאות ניתוח תמונה תוך שבוע וחצי לאחר תחילת הניסוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לסקור היטב את תוצאות ניתוח התמונה כדי להבטיח שהפרמטרים שנבחרו מתפקדים היטב לאורך הצלחת המלאה. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית תאי חיים על מנת לענות על שאלות נוספות. כמו כשאתה סוחר בגורם מארח מסוים מקיים אינטראקציה עם ברוצלה.

או כיצד דלדול הגן משפיע על הדינמיקה התוך-תאית של זיהום. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של זיהומים לחקור את גורמי המארח הנדרשים לזיהום ברוצלה בבדיקת תאי HeLa. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות גורמים מארחים המקדמים, או מונעים, קולוניזציה מוצלחת של תאי HeLa על ידי הפתוגן התוך-תאי Brucella abortus.

אל תשכח שעבודה עם ברוצלה אבורטוס עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להקפיד על תקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות.