זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתרבת תאי אנדותל של וריד טבילית אנושי ולנתח דינמיקה של השלד התאי ונדידת תאים באמצעות דימוי בזמן אמת (time lapse) של תאים חיים. השיטות המתוארות בסרטון זה יכולות לסייע במענה על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה התאית, המולקולרית והמכנו-ביולוגית. לדוגמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות כיצד צורת התא והניידות שלו מושפעות מהאינטראקציה עם רכיבי ECM שונים.

הדגמה חזותית היא קריטית מכיוון ששלבי הכנת הדגימה קשים לביצוע. הם דורשים טיפול מדויק בתאים באופן מהיר לאורך התהליך. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ניידות תאי אנדותל במהלך אנגיוגנזה, ניתן להחילה אותה גם על חקירות מיקרוסקופיות של כמעט כל מערכת מודל של תאים נצמדים.

בעזרת פינצטה, הוציאו כיסוי זכוכית (coverslip) מצנצנת אחסון המכילה 100% ethanol והעבירו אותו בלהבת מבער בונסן כדי לעקרו. לאחר מכן, הניחו אותו בתוך פטריה בקוטר 35 מילימטר. הכינו כיסוי זכוכית אחד עבור כל דגימה.

אל מבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 milliliters הוסיפו 10 µL של תמיסת סטיק של fibronectin בריכוז של 1 mg/mL ו-990 µL של PBS. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפטה 250 µL מהתמיסה על כל זכוכית כיסוי. פזרו את התמיסה באופן אחיד כדי לכסות את השטח.

דגרו את כיסויות הזכוכית למשך שלוש שעות לפחות בטמפרטורה של 37 °C. לפני השימוש, שטפו כל כיסיית זכוכית שלוש פעמים עם 2 mL של PBS. בעזרת המוציטומטר, קבעו את מספר תאי ה-HUVECs שגודלו והעבירו למבחנת מיקרוצנטריפוז' נפח המכיל 100,000 תאים לכיסיית זכוכית עבור ניסויי אי-נדידה, או 500,000 תאים לכיסיית זכוכית עבור ניסויי נדידה.

סובב את התאים במהירות של 1,400 ×g למשך ארבע דקות כדי לשקע אותם. לאחר הסבב, עבור כל תנאי שייבדק, השהה עד מיליון תאים ב-100 µL של בופר אלקטרופורציה ושלב אותם עם 1 µg של cDNA. העבר את התאים לקובטת אלקטרופורציה.

בצע טרנספקציה לתערובת התאים וה-DNA באמצעות התוכנית המיועדת לאלקטרופורציה של HUVEC. לאחר מכן, הצל את התאים שעברו טרנספקציה על ידי הוספה של 500 microliters של endothelial basal medium מלא. לאחר מכן, זרע את נפח התאים המתאים על לוחות כיסוי מצופים בפיברונקטין.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות כדי לאפשר זמן לביטוי של מבני ה-cDNA. כהכנה לדימוג, קחו שתי רצועות של סרט דביק דו-צדדי בגודל 2.5 סנטימטר על 0.65 סנטימטר והצמידו אותן אופקית לאורך הקצה העליון והתחתון של זכוכית מיקרוסקופ נקייה. שימו לב כי חשוב להשאיר רווח קטן בין הסרט לדופן הזכוכית לצורך איטום התא.

הנח את לביד הכיסוי כאשר צד התאים פונה כלפי מטה, כך ששני קצוות לביד הכיסוי ינוחו על הסרט. השתמש בפינצטה כדי ללחוץ בעדינות ולהבטיח את קיבועה של לביד הכיסוי. באמצעות מיקרופיפט, הוסף 40 µL של מדיום דימוי בין לביד הכיסוי לבין השקופית.

וודאו שהרווח בין זכוכית הכיסוי לבין העשייה מלא לחלוטין במדיום דימוי. במידת הצורך, ספגו עודפי מדיום באמצעות נייר סופג. אטמו את כל שולי העשייה בעזרת VALAP חם.

בדקו אם ישנן דליפות על ידי לחיצה עדינה על כיסוי הזכוכית. הניחו את כיסוי הזכוכית המורכב והאטום על במה של מיקרוסקופ שחוממה מראש ל-37 °C. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסק מסתובב (spinning disk confocal microscope), צלמו סדרות תמונות בשיטת time lapse, תמונות של חלבון פלואורסצנטי כחול ותמונות DIC.

נתח את דינמיקת המיקרוטובוליים ואת הלוקליזציה המשותפת כפי שמתואר במסמך המצורף. לצורך ביצוע בדיקת נדידת תאים, לאחר שלב האלקטרופורציה, הצל את התאים שעברו טרנספקציה על ידי הוספת 80 µl של מצע בסיסי מלא לאנדותל. לאחר מכן, העבר בעזרת פיפט את כל דגימת ה-80 µl כטיפה אחת למרכז של זכוכית כיסוי מיובשת ומצופה בפיברונקטין.

אין לפרוס את הטיפה. ייבוש זכוכית המכסה הכרחי כדי למנוע מהטיפה בנפח 80 µL להיפרד בעת המגע עם זכוכית המכסה. גישה זו מאפשרת ריכוז של תאי HUVECs בתוך שטח קטן של זכוכית המכסה, ובכך מקדמת היווצרות מהירה של שכבה אחת רציפה (confluent monolayer) של תאים.

דגרו את לביש 유리 (coverslip) בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד ליצירת שכבה אחת רציפה (confluent monolayer). לאחר מכן, שטפו את הפלטיות פעמיים במצע בסיס אנדותליאל מלא כדי להסיר תאים שלא נצמדו. כדי ליצור קצה פצע בשכבת ה-HUVEC, החזיקו בעדינות את הלביש בעזרת פינצטה וגררו בחוזקה להב תער לרוחב מרכז שכבת התאים.

אפשרו לתאים להתאושש באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות. לאחר מכן, הרכיבו והניחו את לוחות הכיסוי לצורך דימוי כפי שבוצע קודם לכן. רכשו תמונות בניגוד פאזה במרווחי זמן של 10 דקות למשך 12 שעות, באמצעות עדשת פאזה 10X עם מפתח מספרי 0.45 וקונדנסור בעל מרחק עבודה ארוך עם מפתח מספרי 0.52.

השתמשו בלוח ה-ND Acquisition של תוכנת רכישת התמונות. לבסוף, כמתו את הפיצול והנדידה של תאי HUVEC כפי שמתואר במסמך המצורף. תאי HUVEC עברו טרנספקציה לביטוי של mApple-labeled-EB3, חלבון הקשור לקצוות מיקרוטובוליים, ונרכשו תמונות בשיטת time lapse.

תמונות גולמיות של EB3 מוצגות משמאל. שביטי EB3 כחולים שעוקבו באמצעות תוכנת plusTipTracker מוצגים מימין. שביטים שזוהו בכל פריים קושרו על בסיס השינוי במיקומם מפריים לפריים כדי ליצור מסלולי EB3 ושכבת חפיפה חזותית של מסלולי EB3, כפי שמוצג כאן.

צמיחה איטית וקצרת-מועד של מיקרוטובוליים מוצגת באדום, צמיחה איטית וארוכת-מועד של מיקרוטובוליים מוצגת בירוק, צמיחה מהירה וקצרת-מועד של מיקרוטובוליים מוצגת בצהוב, וצמיחה מהירה וארוכת-מועד של מיקרוטובוליים מוצגת בכחול. כדי לנתח את ההסתעפות של תאי אנדותל, צולמו תמונת DIC ותמונת פלואורסצנציה של תא HUVEC בודד בהגדלה של 60 פעמים. גבול סביב קצה התא סומן ידנית בתמונת הפלואורסצנציה.

נקודות המוצא של הענפים הוגדרו לאחר מכן על ידי שרטוט קו ישר לרוחב הענף, העובר דרך זווית הקימור הגדולה ביותר משני צדי הענף. ענפים שהיו ארוכים יותר מרוחבם ובאורך מינימלי של 10 microns נספרו, והאורך נמדד מנקודת המוצא של הענף ועד לקצה הדיסטלי שלו. כדי להעריך את נדידת שולי הפצע של תאי אנדותל, תאי HUVECs תורגדו בצפיפות גבוהה, ובוצעו צילומי time lapse של תאים חיים לאחר פגיעה, כפי שמתואר בסרטון זה.

כפי שמוצג כאן, תאי אנדותל מקצות הפצע נדדו באופן כווני אל תוך אזור הפצע. תנועה זו נותחה באמצעות הגוף הגרעיני כסמן ייחוס למעקב אחר מהירות הנדידה, העקביות והמרחק. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לגדל, להעביר טרנספקציה ולהכין HUVECs עבור ניסויי דימוג של צורת תאים ודינמיקה של השלד התאי, או עבור מחקרי נדידת תאים מקצות הפצע.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון צימוד פוליאקרילאמיד או קולגן על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות למעורבות תאים של ECMs שעברו שינוי. תודה לצפייה, ובהצלחה בניסוייכם.