Name: זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: למדו לתרבת תאי אנדותל ורידי טבור אנושיים ולנתח דינמיקת מיקרו-טובולים ונדידת תאים באמצעות הדמיה חיה בזמן אמת. השיטה מאפשרת חקר התנהגות ציטוסקלטית ואנגיוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה מיוחדת לד&quot;ר קלייר מ ווטרמן עבור חונכות ודיונים, מישל ביירד ומייק דוידסון למתן רבים של מבנים cDNA פלורסנט המשמש במחקרים אלה, ועם קתרין אפלגייט Gaudenz Danuser לפיתוח תוכנת ניתוח MT plusTipTracker. עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי מענק קא&quot;מ מן הריאות הלאומי ללב ודם (NHLBI) לבין המכון הלאומי לבריאות (NIH). (גרנט: 4K22HL113069).

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שימוש HUVECs בניסויי מורפולוגיה והגירה. Live- תא הדמיה של דינמיקת צמיחת MT שכותרתו EB3 בתוך HUVECs דורשת תנאי תרבית תאים מתאימים לשחזור כדי למדוד ולהעריך שינויים בצמיחת MT ומורפולוגיה HUVEC, כך שהם יכולים להיות מוקצים אז אל קיו איתות ECM. HUVECs מייצגים מודל מצוין לחקר צורת התא ואת תנועתיות. הם מאוד מקובלים transfection עם cDNAs fluorescently שכותרתו, הם מפגינים מורפולוגיות דרמטיות בתגובה הוא רמזי איתות מסיסים ופיסיים, והם שומרים על היכולת לארגן את עצמם לתוך צינורות כלי דם כאשר ספקו תנאי תרבית תאים מתאימים 65-70. בתרביות תאים ראשוניים, כגון HUVECs, מצריכה טיפול וניטור קפדני של מספר מעבר התא על מנת להבטיח את התאים בריאים וכי הם יתנהגו באופן רגיל בזמן ניסויים. לדוגמא, בעת ביצוע ניסויים חוקרים את cytoskeleטון ו / או מורפולוגיה תא, HUVECs לא אמור לשמש לניסויים מעבר למעבר תרבית תאים עשירית, כפי HUVECs בדרך כלל מתחילה להציג מורפולוגיות לא אחידות סביב המעבר כשנים-עשר עד חמישה-עשר. צפיפות תאים גם רגולטור חשוב לבריאות ושגשוגם HUVEC. חקירות הסתעפות HUVEC (ראה פרוטוקול 10.1-10.4, לעיל) להשתמש תרבויות צפיפות תאים נמוכות יחסית על מנת לספק את תאי מרחב פיזי כדי אינטראקציה עם ECM שלהם להאריך בליטות קנים. לעומת זאת, במחקרי גירת פצע קצה (ראה פרוטוקול 10.5-10.8), HUVECs הוא תרבות בשכבה לפני הפציעה. כפי HUVECs כזה, פצע קצה להציג מורפולוגיה יחסית un קנים, להאריך המובילים בליטות בקצה, ולהציג אינטראקציות תאי תאים עם השכנים המיידיים שלהם כפי שהם נודדים לתוך הפצע. אזהרות ואת היתרונות של Dynamics מעקב MT In Living HUVECs. ספינינג מיקרוסקופיה דיסק היא גישה מצוינתלבחון השערות ניסיוניות הדורשים בהירות התמונה confocal עם הזמן ברזולוציה גבוהה. עם מודול מצלמת הליזר המתאים, גישה מיקרוסקופיה זו רגישה קרינת פליטה נמוכה והוא יכול לסייע photobleaching מופחת לעומת סוגים אחרים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חשוב לציין, גישה זו גם מתאימה גם עבור בינוני עד הדמית זמן ברזולוציה גבוהה כפי שנדרש להפקה מדידות מקיפות של דינמיקת צמיחת MT בגישת תיוג EB3, במגוון סוגי תאים שונים. בעוד המתודולוגיה EB3 של תיוג גדל MT פלוס קצוות יש יתרונות ברורים על פני שיטות אחרות של MTS תיוג פלורסנטי, יש לה גם חסרונות ייחודיים. לדוגמא, קיים יחס של מערך MT שאינו צומח באופן פעיל בכל זמן נתון, כולל הוא את האוכלוסייה של MTS פירוק ואוכלוסיית סטאבילה, MTS הלא דינמי 71-74. EB3 לא לתייג שני אלה אוכלוסיות של MTS וולכן התרומה של שתי אוכלוסיות אלה לא יכללו בניתוח נתוני הניסוי. מתודולוגיות אלטרנטיבי לבחינת מערך MT כולו התמקד ביטוי טובולין שכותרתו פלורסנטי, אשר משלב לתוך כל האוכלוסיות של MTS ומאפשר זיהוי של גדל, מתכווץ, ואת סטאבילה MTS. עם זאת, בגלל צפיפות גבוהה יחסית של המערך MT סמוך למרכז התא צמוד למרכז בארגון microtubule (MTOC), תיוג מערך MT כולו יוצר חיסרון בביצוע ניתוח התמונה של הקצוות MT שאינם ליד התא בפריפריה 75-77. ניסויים באמצעות שיתוף תיוג שני צבעים של MTS עם טובולין פלורסנט EB3 פלורסנט בתאים חיים חשפו, איכותית, כי הרוב המכריע של MTS שכותרתו טובולין הם גם שכותרתו EB3 78. בנוסף, לא היתה שיטה יעילה של מעקב אוטומטי של MTS שכותרתו עם טובולין ניאון. משמעות הדבר היא כי אוסף נתוניםtion ומדידות של דינמיקת MT בתאים המבטאים טובולין פלורסנט דורשים מעקב ביד של MTS פרט, תהליך שהוא לשגיאה ומייגעת. כתוצאה מכך, ניתוח חישובית אוטומטי של MTS EB3 שכותרתו הפך המתודולוגיה המועדף למדידת דינמיקת MT כפי שהוא יכול להיות מיושם על ניסויי דינמיקת MT פני סוגי תאים רבים בתוך מגוון רחב של משטרים הניסיונות 35,79. קישור Dynamics צמיחה MT כדי HUVEC מורפולוגיה וההגירה. מנקודת המבט של חוקר cytoskeletal, אחד הסתגלות שימושית מאוד של ניתוח המעקב אוטומטי plusTipTracker היא היכולת למדוד ולהעריך הוא שינויי תא ואזוריים בדינמיקת צמיחת MT. דרישת תא להפוך מקוטב היא תנאי מוקדם הכרחי נדידת תאים כיוונית. כרמזי איתות כזה, מקוטב כבר ידועים עוד גורמי נהיגת מפתח עבור נדידת תאים כיוונית 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. לדוגמא, מולקולות מסיסות איתות כגון VEGF לגרום פילמור יקטין וצמיחת MT כלפי קיו VEGF בסוגי תאי אנדותל 2,82-87. בנוסף, בתגובה אינטראקציות פיזי עם ECM (למשל, ציות ממדיות mechanosensing), HUVECs לווסת הדינמיקה MT שלהם על ידי מקומי ויסות מפות כדי לקדם צמיחה MT בתוך מתארך בליטות הקנים, וזה משמש כדי להנחות הגירה HUVEC בכיוון של קיו 5,31,88. לפיכך, קיטוב בתגובה לאותות איתות תאיים מדגיש את הצורך בהערכה ניסיונית של שינויי נקודות בדינמיקת cytoskeletal. Live- תא הדמיה סימולטני של דינמיקת צמיחת MT (בגישת EB3) ואת נדידת תאי HUVEC קשה מאוד לבצע בגלל MTs לגדול על ציר זמן של שניות, תוך שינויים במורפולוגיה תא והגירה כיוונית להתרחש בקנה מידת זמן של שעות. עם זאת הוא לגבי התהליכים הם אינטימי לינקהד. יתר על כן, רציפה, הדמיה מהירה של EB3 שכותרתו fluorescently על ציר הזמן השני מוביל photobleaching של האות EB3. ניסיונות להתגבר על בעיה זו על ידי ביצוע סדרת הדמיה קצרה EB3 (סדרת רכישה 1-2 דקות) כל 30 דקות הצליחו, אבל יכול להיות מושלם רק במספר קטן של ECS כי היה ביטוי אופטימלי של EB3 וכי לא להציג לרעה אפקטים תאורת לייזר חזר 5. גישה חלופית המאפשרת פרשנויות של איך דינמיקת צמיחת MT לתרום שינויים במורפולוגיה תא והגירה היא אזור plusTipTracker של העניין (ROI) כלי 35 (ראה פרוטוקול 6.6). מתודולוגיה זו מאפשרת לצמיחת MT התא כולו עוקבת להיות תת-מחולק לאזורים המוגדרים על ידי משתמש, שממנו מסלולי צמיחת MT אז יכולים להיות מופקים ונותחו. לדוגמה, השוואות של &quot;מסועפת&quot; לעומת אזורים &quot;הלא-קנים&quot; של התא חשפו כי MTS לגדול יותר שלנחות ועוד בהתמדה בתוך אזורים מסועפים לעומת הפריפריה של התאים הלא-קני 5. בשנת HUVECs פצע קצה מקוטב, השוואות של קצה המובילה ונגררת דינמיקת צמיחת MT הקצה גילו כי פירוק MT-induced MCAK מעוכב במיוחד בתוך הקצה המוביל, אבל לא נגרר לקצה. ערכה אזורית מובילים ונגרר דינמיקת צמיחת MT יתרון HUVECs להביע Rac1 ו / או מוטציות זירחון של MCAK עוד עולה כי הפעלת נגרמת Rac1 של אורורה-קינאז ספציפי מקומי מעכב פעילות MCAK בתוך הקצה המוביל לנהוג קיטוב HUVEC והגירה כיוונית 31. לכן, השילוב של מעקב אוטומטי של דינמיקת צמיחת MT וערכה האזורית של דינמיקת צמיחת MT בתוך בליטות קנים ו / או את הקצה המוביל של פצע קצה HUVECs אפשר לנו לקשר דינמיקת צמיחת MT מורפולוגיה וגירת HUVEC. הפרוטוקולים המתוארים הם designeד לספק מתודולוגיה פשוטה מאוד דיר בדרך כלל לתרבות HUVEC וחקירת ניסיוני. עם זאת, חלק ניכר מן פרטי הפרוטוקול הם מורכבים זמן רב, אשר, בתורו, מספק הזדמנות עבור שגיאות או קשיים בניהול המתודולוגיה הניסיון. למרות שזה היה ניסיון לטפל בבעיות פוטנציאליות ברחבי הפרוטוקול, כאן מסופק ולפתור בעיות נוספות, מפורטות של בעיות פוטנציאליות שניתנות פחות נפוצים או מקוצר אחרת כפי שמציין בתוך פרוטוקול המתודולוגיה. הקשורים coverslips ציפוי עם מצעים polyacrylamide (פרוטוקול 2.2), בעיה נפוצה הנשאלת היא האופי המורכב של הפעלת coverslips זכוכית, צימוד polyacrylamide אל הזכוכית, הפעלת polyacrylamide, ולאחר מכן צימוד ECM אל polyacrylamide. אחת במיוחד צעד קשה ובעייתי פוטנציאלי הוא culturing HUVECs על ג&#39;ל פיברונקטין / polyacrylamide הבא חשיפה של פוליהcoverslips מצופה crylamide עד 2 מ&quot;מ sulfo-SANPAH (שלב 2.2.2.6, לעיל). זה קריטי להצלחת culturing HUVECs על מצעים אלה כי sulfo-SANPAH יוסר לחלוטין ממערכת ניסיוני הבאה נטיית ECM. זה יכול להיות מושג בצורה הטובה ביותר על ידי שטיפה עם DDH 2 O ו דוגרים coverslips DDH 2 O על שייקר לילה. אם תאים בתרבית על ECMS polyacrylamide אינם שורדים, או אם הכדאיות הוא פחות מהצפוי, עלה וחזר לשטיפת sulfo-SANPAH לאחר נטיה כדי פיברונקטין (שלב 2.2.2.9) מומלץ פוטנציאל להקל על בעיה זו. קשור לפרוטוקול 3 (transfection cDNA ותרבות HUVEC על coverslip), השפעה גדולה על ההצלחה של הליך electroporation היא הטיפול של HUVECs היא במהלך trypsinization של התאים כדי להסיר אותם מבקבוק הפלסטיק, ובעקבות הסיום את electroporation (שלבים 3.3-3.4, לעיל). זה קריטי כדי אכפתמלא לפקח על HUVECs בעוד טריפסין, ולא יעלה את הזמן הדרוש עבור התאים &quot;עיגול לטובה&quot; על פני השטח של הבקבוק (בדרך כלל 1-2 דקות). זמן מופרז טריפסין הוא הגורם העיקרי למוות HUVEC, אשר בדרך כלל אינה ממומשת עד תאים מצופה על coverslips מצופה פיברונקטין (שלב 3.4) ולאחר מכן מצליחים לצרף המצע. חשיבות דומה, HUVECs (ורוב סוגי תאים ראשוניים) לא מסתדרים היטב כאשר מושעה • לפרקי זמן ממושכים למאגר electroporation. במהלך ניסויים בקנה מידה גדול יותר, למשל, כאשר המשתמש הינו חמש או יותר תנאים המחייבים electroporation, עדיף לשמור על התאים pelleted ב צינורות בודדים (1 צינור לכל transfection) כדי לערבב אותם, אחד-על-א-זמן , למאגר electroporation מיד לפני electroporation. גישה זו מקטינה זמן הדגירה חיץ electroporation והישרדות HUVEC מוגדל. בנוסף, הצלה מיידית בתקשורת התרבות השלמה היא גם crelectroporation הבא itical. עיכובי הצלת דקה אחת או יותר electroporation הבא יכולים לגרום סף המוות מוחלט HUVEC ובכך יש להימנע. assay נדידת תאים קשור (פרוטוקול 9), הטכניקה של culturing HUVECs בצפיפות גבוהה מאוד תלויה שינוי קריטי (כמתואר בשלב 9.2) של המתודולוגיה תרבית תאים המסורתית HUVEC (המתואר פרוטוקול 3) הדורש ייבוש של coverslip מצופה פיברונקטין על מנת לאפשר תרבות HUVEC לתוך שטח קטן מאוד של coverslip. פעמים רבות, אם coverslip לא יבש לחלוטין או אם ציפוי מראש של coverslip עם פיברונקטין (שלבים 2.1 או 2.2) היה לא יעיל, התאים המכילים התקשורת כי מושם על coverslip תאבד מתח הפנים שלה ולהרחיב את הקצוות של coverslip, ובכך להפחית את הצפיפות של תאים על coverslip. שיטה אחת כדי לפתור בעיה זו פוטנציאל היא לשאוב את התקשורת מן coverslip ולאחר מכןמקום coverslip (עדיין בצלחת 35mm שלה) לחלק האחורי של ארון הבטיחות הביולוגי למשך 5-10 דקות. הסתגלות זו יכולה לסייע כדי לאפשר את זרימת האוויר בתוך ארון לסייע בייבוש המנה. אם כל נוזל גלוי נשאר על coverslip לאחר ייבוש באוויר, לשאוב כתמים נוזליים ושוב ולאפשר לאוויר יבש למשך 5-10 דקות נוספות בקבינט בטיחות ביולוגית. חשוב לציין כי אין דרך למנוע זאת בעיה פוטנציאלית לחלוטין, אבל זה הופך להיות פחות בעיה עם תרגול חוזר של הפרוטוקול. זהו גם המלצה לפתרון בעיות אשר בעת הכנת coverslips עבור assay נדידת תאים (או כל assay, בכלל), כדי להכין coverslips נוסף ויש HUVECs נוסף מוכן ללכת במקרה של בעיות לאורך הדרך. עם שיקולים אלה לפתרון בעיות בחשבון, זה חשוב גם להדגיש את התועלת של פרוטוקולים דנו והשלכותיהם במחקר ביולוגיה של התא בעתיד. תחולת אל polyacrהגישה ylamide הוא רחב יריעה, וכוללת לא רק מחקרים דו מימדי ההתקשרות התא ECM (כמתואר לעיל), אלא גם חקירות תלת מימדי 5. יישום זה הוא קריטי להגדלת הבנתנו כיצד HUVECs להסדיר צורת תא והגירה בסביבות פיסיולוגיות אמורים לספק לחוקרי הבנה בסיסית של איך מורפולוגיים שינויים מתואמים עם שינויי cytoskeletal. בעוד הפרוטוקולים המתואר כאן מתמקדים מדידות של דינמיקת צמיחת MT, רוב הפרוטוקולים יכול וצריך להיות מותאם למדידה מספר רב של היבטים למדידה מיקרוסקופית אחרים של אינטראקציות התא-ECM. עם כל כבוד דינמיקת MT, ישנם רבים מפות, כולל לפחות 14 משפחות של kinesins 89, כל אחד עם תפקיד פוטנציאלי בתרומה הקוטבית HUVEC והגירה מכוונת, וכל אחד מהם יכולים להיחקר באמצעות הפרוטוקולים שהוצגו. חקירות עתידיות במקרה בוסימפוני יכוון אירוסי תא ECM ב רגיל לעומת מדינות חולות. פרוטוקולים HUVEC המוצגים כאן הם החלים על חקירות של תהליכים ההומיאוסטטית וסקולרית נורמלי, כמו גם מדינות מחלה כולל מחלות לב, רטינופתיה, גידולים סרטניים וגרורות, עד כמה שם. Conjugating בעליל מצעי ECMS ו polyacrylamide שקופים ציות נוח עם מחקרים מיקרוסקופים יאפשר ללימודי אירוסי התא ECM כך אנגיוגנזה וסקולרית תא האנדותל יכולה להיות במעקב עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. אלו סוגים של גישות ניסיוניות כבר החלו לחשוף הבדלים חשובים בכושר תא האנדותל, קוטביות, הגירה, ואת ההשפעות של פרוטאינים המווסתים תהליכים אלה 5,31,90. מאמצי עתיד צריכים לשאוף לזהות כיצד השילוב של ציות ECM ו- ממדי mechanosensing עשוי לשמש לחלבונים שליטים מקומית כי למקד ולהסדיר דינמיקת cytoskeletal.

אנגיוגנזה מופעלת על ידי רמזי איתות תאיים המקדמים בתאי האנדותל (EC) לקטב, נודדים עם ייחוד כיוונית, ויוצרים כלי דם חדשים ברקמות הדורשים אספקת דם. גורמים תורמים חשבו לנהוג אנגיוגנזה הם אותות מן מטריקס (ECM). בתגובה רמזים פיזיים, ECS להאריך סניפים חדשים עם ייחוד כיוונית להנחות כיווני תנועה במבנה של 1,2 רשת כלי הדם. הארכיטקטורה של מורפולוגיה הסתעפות EC מוגדרת על ידי רגולציה מקומית של שלד תא microtubule (MT) בצורה מתואמת עם הסדרת contractility acto-שרירן 3. על מנת סניפים EC להיווצר, שרירן-II חייב להיות downregulated מקומית, וכתוצאה מכך בליטות קרום מקומי 4. באותו הזמן באותו המקום בתוך התא, דינמיקת צמיחת MT הופכת שונה וכתוצאה מכך צמיחת MT איטית ומתמשכת לקידום ענף אלוןgation ויציבות 5. תקנה cytoskeletal מתואמת זו מאפשרת ECS לקטב המורפולוגיה שלהם כדי להקל על ההגירה כיוונית. ההתפתחות המינית של מורפולוגיה תא מקוטבת דורשת MT המקוטב הרכבה 6. בעת העברת לתאי האפיתל, MTS לגדול לאט במיוחד בהתמדה בחוד החנית של התא 7-9; בעוד בנוירונים, בייזום ההתארכות של אקסונים או דנדריטים דורשים כי MTS הם לא רק בהווה, אלא כי הם דינמיים עוברים תהליכי ההרכבה ופירוק 10-15. בדרך זו, שליטה מקומית של דינמיקת צמיחת MT מקובעת את הארכיטקטורה של התא ומאפשרת שיפוץ מהיר של מורפולוגיה תאים כמו ECS לנווט ECM שלהם. דינמיקת צמיחת MT מוסדרת על ידי משפחות של חלבוני מנוע מולקולריים וחלבונים לא מנועים, כינת חלבונים הקשורים microtubule או microtubule מתנגש חלבונים (להלן Referred כדי כמפות). מפות ניתן להפעיל באופן מקומי או מומת, בדרך כלל באמצעות איתות מפלי יזם בממשק התא ECM 16,17. ברגע פעיל, מפות פונקציה על ידי קשירה של MT ושינוי קינטיקה של הרכבה ופירוק MT; ובכך תפקוד מקומי להסדיר דינמיקת MT כדי לקדם צורת תא קוטבי 18-20. Mitotic centromere Associated Kinesin (MCAK) היא מפה המשפחה Kinesin-13 הנקשרת הקצוות וזוגות MT הידרוליזה ATP כדי פירוק MT 21-23. תפקיד פונקציונלי זה של MCAK ידוע להיות קריטי בתוך 24-28 ציר mitotic, כמו גם במהלך שלבי 29,30. בתוך השלבים ECS, פירוק MT בתיווך MCAK מוסדר על ידי זרחון המושרה אורורה-A המקומי של MCAK בתגובה לפצוע קצה הפעלה מושרה של GTPase Rac1 הקטן. התוצאה של מפל איתות לכך היא עיכוב של MCAK בחוד החנית של ECS, כשהתוצאה היא צמיחה MT מקוטב כלפי leading קצה ופירוק MT-induced MCAK בקצה המאסף של נודדות 31 ECS. מתודולוגיות מסורתית למדידת הדינמיקה צמיחה MT בדרך כלל השתמשו ביד מעקב של טובולין fluorescently שכותרתו או או, ולאחרונה, שכותרתו fluorescently חלבון מחייב MT סוף 1 או 3 (EB1 או EB3, בהתאמה). הגישה טובולין פלורסנט יש את היתרון של תיוג מערך MT כולו. עם זאת, משום שרוב סוגי תאי mitotic לשמור על מערך רדיאלי של MTS במהלך השלבים 8,32,33, MTS ליד centrosome מאוד צפוף, וכתוצאה מכך, מעקב צמיחת MT ופירוק עם טובולין ניאון בדרך כלל מוגבל לציוד ההיקפי אזורים של התא. המגבלות האלה, ניצול של חלבוני EB-שכותרתו fluorescently (EB1 או EB3) כבר הגישה הנפוצה יותר למדידת דינמיקת MT. בגלל EBS רק התווית הפלוס בסיום הגדילה של MTS, הם מופיעים כמו קטנים (1-3 מיקרומטר), ניאון בהיר לבואts, ובכך לספק סמן להבחין בקלות של פילמור MT עם קרינת רקע מוגבלת מאוד 34-37. בעוד העובדה תווית EBS רק קבוצת משנה של מערך MT מייצגת כוח עיקרי של גישת EB, הוא גם ממחיש מגבלה אחת חשובה, כי MTS שאינו צומח לא מסומן על ידי גישת EB3. עם זאת, היכולת למדוד ולעקוב אחר שביטי EB3 לאורך זמן וכדי להמחיש צמיחת MT בתוך האזורים הסלולר תת לעשות אידיאלי גישה זו עבור יישומים הדורשים ערכה אזורית של ארגון MT. מגבלה קריטית נוספת של מתודולוגיות מסורתית דינמיקת צמיחת MT מדידה כבר ערכות נתונים גדולות מאוד והזמן הדרוש לניתוח נתונים. מגבלה זו נובעת מהצורך למעקב יד של מאה שביטי EB ברזולוציה גבוהה בזמן. יתר על כן, מדידות אלה צריכות להיעשות מספר משמעותי סטטיסטי של תאים וגם בצעו תחת מגוון מלא experimeתנאי פתיחות opening סגירות closures. לאחרונה, האילוצים הללו הוכרעו באמצעות טכניקות ניתוח חישובית מכוונת ספציפית שביטים מעקב EB3 באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות בתאים חיים 35. כאשר נעשה שימוש כראוי, גישה חישובית זה משמש הוא להגביל את הפוטנציאל לטעויות אנושות הקשורים מעקב יד מעבר למתן שיטת תפוקה גבוהה של מדידת פילמור MT. ניתוח חישובית של דינמיקת MT באמצעות חבילת תוכנה מבוססת Matlab, plusTipTracker, מאפשר למדידות של צמיחת MT על ידי מעקב אחר שביטי EB3 שכותרתו fluorescently 5,31,35,38. בנוסף, תוכנת plusTipTracker מאפשרת חישובים של אירועי אסון MT (פירוק aka) מבוסס על העלמות שביטי EB3 בתוך מסלול MT גדל, ומאפשרת משנה הסלולר (aka אזורי) ניתוח של דינמיקת צמיחת MT בתוך אזורים המוגדר על ידי משתמש של עניין . עבור המחקרים שלנו, דינמיקת צמיחת MT הושוותה בתוךאזורים מסועפים לעומת אזורים שאינם קנים, או בתוך מובילים לעומת נגרר קצות תא. פלט נתונים מתוכנת plusTipTracker יכול לשמש גם כדי ליצור שכבות מסלול בצבעים עבור תאים בודדים ואזורי משנה הסלולר. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה ששימשה לחקור את התפקיד של MCAK בויסות הדינמיקה צמיחה MT והתרומה של MT depolymerase זה להסדרת EC הסתעפות מורפולוגיה והגירה כיוונית. הגישה שלנו השתמשה שורת תאים ראשונית אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs), אשר בקלות תרבותית נוחים מאוד, transfection החולף נגרמת electroporation של cDNA פלסמיד. לאחר מכן השתמשו ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות של HUVECs טרנספקציה עם סיום MT חלבון מחייב 3 (EB3) ו mitotic centromere Associated Kinesin (MCAK) cDNA -specific בונה כדי לבדוק את ההשפעות על הדינמיקה MT טרנספקציה HUVECs. PlusTipTracker מבוסס ניתוח תמונה חישובית של EB3MT בתוספת הקצוות -labeled היה למדוד מהירויות צמיחת MT ו גלגולי צמיחת MT בתמונות זמן לשגות, למדוד ולהשוות השפעות של מניפולציות ניסיון על דינמיקת צמיחת MT. מתודולוגיה זו מאפשרת לחקר דינמיקת MT וזיהוי כיצד רגולציה מקומית של דינמיקת MT בתוך אזורי משנה הסלולר תורמת לתהליכי angiogenic של הסתעפות והגירת EC. טכניקות אלו חלות על חקירות של כל MAP כי יכול להיות מתויג fluorescently והביע בתאים חיים.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inhibitor I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת 2% Bis</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% אקרילאמיד</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 ננומטר מודול קומבינר לייזר MLC400 בעוצמה גבוהה</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash; חרוזי משקעים חיסוניים IgG של עכברים</td><td>ריאגנטים TrueBlot; רוקלנד בע"מ</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>אנטי&ndash; ארנב IgG חרוזי משקעים חיסוניים</td><td>TrueBlot ריאגנטים; רוקלנד בע"מ</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, מסנן פליטה DAPI-ET</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פליטה ET525/36m</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פליטה ET605/70m</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פליטה ET700/75m</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700 / 75m</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין שבר V</td><td>RPI מוצרים</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>קלרה מקורר מטען מצמד מכשיר</td><td>מצלמה Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 חמור נגד ארנב</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 עז נגד חולדות</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot אספקה & גורמי גדילה (התוכן מוצג להלן)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי 25 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמצית מוח בקר 2.0 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין סולפט 0.5 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס 0.5 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון 0.5 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחב"ל עט/מ"ל, 10,000 &#181; גרם סטרפטוק/מ"ל)&nbsp; 10.0 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>תריס אלקטרוני</td><td>מכשיר סאטר</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז HALT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP עז אנטי עכבר</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP עז נגד ארנב</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF ממברנה</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>לנולין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>ניקון TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>שלב ממונע</td><td>ASI טכנולוגיות</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-אורורה A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>עכבר anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי טובולין (DM1A)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>לק</td><td>אלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS תוכנת אלמנטים</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>ערכת נוקלאופקטור V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>מכיל את מאגר האלקטרופורציה</td></tr><tr><td>פרפין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יחב"ל Pen/ml, 10,000 &#181; g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>ג'לי נפט</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי&ndash; pT288&ndash; Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti&ndash; &alpha;-tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן בורוהידריד</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>דיסק מסתובב&nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>יוקאגאווה CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo פישר סיינטיפיק</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של dynamics microtubule in living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

התהליך הפיזיולוגי שבו נוצרים כלי דם חדשים מכלי דם קיימים דורש אירועי איתות ספציפיים המעוררים שינויים מורפולוגיים בתוך תאי אנדותל בודדים (ECs). תהליכים אלו קריטיים לתחזוקה הומאוסטטית כגון ריפוי פצעים, והם גם חיוניים בקידום צמיחת גידול וגרורות. מורפולוגיה של EC מוגדרת על ידי ארגון השלד הציטולוגי, מערכת מווסתת היטב של דינמיקת אקטין ומיקרו-צינורות (MT) הידועה כשולטת בהסתעפות EC, קוטביות והגירה כיוונית, מרכיבים חיוניים של אנגיוגנזה. כדי לחקור דינמיקת MT, השתמשנו במיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה יחד עם ניתוח תמונה חישובי של קצוות פלואורסצנטיים של MT כדי לחקור את דינמיקת הצמיחה של MT ואת הוויסות של מורפולוגיה של הסתעפות EC והגירה כיוונית. הדמיית זמן-lapse של תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים חיים (HUVECs) בוצעה לאחר טרנספקציה עם חלבון קושר קצה MT 3 (EB3) עם תווית פלואורסצנטית ומבני cDNA ספציפיים לצנטרומר מיטומר (MCAK) כדי להעריך את ההשפעות על דינמיקת MT. תוכנת PlusTipTracker שימשה למעקב אחר קצוות MT פלוס עם תווית EB3 על מנת למדוד את מהירויות הצמיחה של MT ואת אורך חיי הצמיחה של MT בתמונות זמן-lapse. מתודולוגיה זו מאפשרת לחקור את דינמיקת ה-MT ולזהות כיצד ויסות מקומי של דינמיקת MT באזורים תת-תאיים תורם לתהליכים האנגיוגניים של הסתעפות והגירה של EC.

פרוטוקולים לתרבית תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC), טרנספקציה חולפת של סמנים פלואורסצנטיים של צמיחת מיקרו-צינוריות, הדמיית תאים חיים וניתוח אוטומטי של דינמיקת צמיחת מיקרו-צינורות בין-פאזיים.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתרבת תאי אנדותל של וריד טבילית אנושי ולנתח דינמיקה של השלד התאי ונדידת תאים באמצעות דימוי בזמן אמת (time lapse) של תאים חיים. השיטות המתוארות בסרטון זה יכולות לסייע במענה על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה התאית, המולקולרית והמכנו-ביולוגית. לדוגמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות כיצד צורת התא והניידות שלו מושפעות מהאינטראקציה עם רכיבי ECM שונים.הדגמה חזותית היא קריטית מכיוון ששלבי הכנת הדגימה קשים לביצוע. הם דורשים טיפול מדויק בתאים באופן מהיר לאורך התהליך. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ניידות תאי אנדותל במהלך אנגיוגנזה, ניתן להחילה אותה גם על חקירות מיקרוסקופיות של כמעט כל מערכת מודל של תאים נצמדים.בעזרת פינצטה, הוציאו כיסוי זכוכית (coverslip) מצנצנת אחסון המכילה 100% ethanol והעבירו אותו בלהבת מבער בונסן כדי לעקרו. לאחר מכן, הניחו אותו בתוך פטריה בקוטר 35 מילימטר. הכינו כיסוי זכוכית אחד עבור כל דגימה.אל מבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 milliliters הוסיפו 10 µL של תמיסת סטיק של fibronectin בריכוז של 1 mg/mL ו-990 µL של PBS. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפטה 250 µL מהתמיסה על כל זכוכית כיסוי. פזרו את התמיסה באופן אחיד כדי לכסות את השטח.דגרו את כיסויות הזכוכית למשך שלוש שעות לפחות בטמפרטורה של 37 °C. לפני השימוש, שטפו כל כיסיית זכוכית שלוש פעמים עם 2 mL של PBS. בעזרת המוציטומטר, קבעו את מספר תאי ה-HUVECs שגודלו והעבירו למבחנת מיקרוצנטריפוז' נפח המכיל 100,000 תאים לכיסיית זכוכית עבור ניסויי אי-נדידה, או 500,000 תאים לכיסיית זכוכית עבור ניסויי נדידה.סובב את התאים במהירות של 1,400 ×g למשך ארבע דקות כדי לשקע אותם. לאחר הסבב, עבור כל תנאי שייבדק, השהה עד מיליון תאים ב-100 µL של בופר אלקטרופורציה ושלב אותם עם 1 µg של cDNA. העבר את התאים לקובטת אלקטרופורציה.בצע טרנספקציה לתערובת התאים וה-DNA באמצעות התוכנית המיועדת לאלקטרופורציה של HUVEC. לאחר מכן, הצל את התאים שעברו טרנספקציה על ידי הוספה של 500 microliters של endothelial basal medium מלא. לאחר מכן, זרע את נפח התאים המתאים על לוחות כיסוי מצופים בפיברונקטין.דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות כדי לאפשר זמן לביטוי של מבני ה-cDNA. כהכנה לדימוג, קחו שתי רצועות של סרט דביק דו-צדדי בגודל 2.5 סנטימטר על 0.65 סנטימטר והצמידו אותן אופקית לאורך הקצה העליון והתחתון של זכוכית מיקרוסקופ נקייה. שימו לב כי חשוב להשאיר רווח קטן בין הסרט לדופן הזכוכית לצורך איטום התא.הנח את לביד הכיסוי כאשר צד התאים פונה כלפי מטה, כך ששני קצוות לביד הכיסוי ינוחו על הסרט. השתמש בפינצטה כדי ללחוץ בעדינות ולהבטיח את קיבועה של לביד הכיסוי. באמצעות מיקרופיפט, הוסף 40 µL של מדיום דימוי בין לביד הכיסוי לבין השקופית.וודאו שהרווח בין זכוכית הכיסוי לבין העשייה מלא לחלוטין במדיום דימוי. במידת הצורך, ספגו עודפי מדיום באמצעות נייר סופג. אטמו את כל שולי העשייה בעזרת VALAP חם.בדקו אם ישנן דליפות על ידי לחיצה עדינה על כיסוי הזכוכית. הניחו את כיסוי הזכוכית המורכב והאטום על במה של מיקרוסקופ שחוממה מראש ל-37 °C. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסק מסתובב (spinning disk confocal microscope), צלמו סדרות תמונות בשיטת time lapse, תמונות של חלבון פלואורסצנטי כחול ותמונות DIC.נתח את דינמיקת המיקרוטובוליים ואת הלוקליזציה המשותפת כפי שמתואר במסמך המצורף. לצורך ביצוע בדיקת נדידת תאים, לאחר שלב האלקטרופורציה, הצל את התאים שעברו טרנספקציה על ידי הוספת 80 µl של מצע בסיסי מלא לאנדותל. לאחר מכן, העבר בעזרת פיפט את כל דגימת ה-80 µl כטיפה אחת למרכז של זכוכית כיסוי מיובשת ומצופה בפיברונקטין.אין לפרוס את הטיפה. ייבוש זכוכית המכסה הכרחי כדי למנוע מהטיפה בנפח 80 µL להיפרד בעת המגע עם זכוכית המכסה. גישה זו מאפשרת ריכוז של תאי HUVECs בתוך שטח קטן של זכוכית המכסה, ובכך מקדמת היווצרות מהירה של שכבה אחת רציפה (confluent monolayer) של תאים.דגרו את לביש 유리 (coverslip) בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד ליצירת שכבה אחת רציפה (confluent monolayer). לאחר מכן, שטפו את הפלטיות פעמיים במצע בסיס אנדותליאל מלא כדי להסיר תאים שלא נצמדו. כדי ליצור קצה פצע בשכבת ה-HUVEC, החזיקו בעדינות את הלביש בעזרת פינצטה וגררו בחוזקה להב תער לרוחב מרכז שכבת התאים.אפשרו לתאים להתאושש באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות. לאחר מכן, הרכיבו והניחו את לוחות הכיסוי לצורך דימוי כפי שבוצע קודם לכן. רכשו תמונות בניגוד פאזה במרווחי זמן של 10 דקות למשך 12 שעות, באמצעות עדשת פאזה 10X עם מפתח מספרי 0.45 וקונדנסור בעל מרחק עבודה ארוך עם מפתח מספרי 0.52.השתמשו בלוח ה-ND Acquisition של תוכנת רכישת התמונות. לבסוף, כמתו את הפיצול והנדידה של תאי HUVEC כפי שמתואר במסמך המצורף. תאי HUVEC עברו טרנספקציה לביטוי של mApple-labeled-EB3, חלבון הקשור לקצוות מיקרוטובוליים, ונרכשו תמונות בשיטת time lapse.תמונות גולמיות של EB3 מוצגות משמאל. שביטי EB3 כחולים שעוקבו באמצעות תוכנת plusTipTracker מוצגים מימין. שביטים שזוהו בכל פריים קושרו על בסיס השינוי במיקומם מפריים לפריים כדי ליצור מסלולי EB3 ושכבת חפיפה חזותית של מסלולי EB3, כפי שמוצג כאן.צמיחה איטית וקצרת-מועד של מיקרוטובוליים מוצגת באדום, צמיחה איטית וארוכת-מועד של מיקרוטובוליים מוצגת בירוק, צמיחה מהירה וקצרת-מועד של מיקרוטובוליים מוצגת בצהוב, וצמיחה מהירה וארוכת-מועד של מיקרוטובוליים מוצגת בכחול. כדי לנתח את ההסתעפות של תאי אנדותל, צולמו תמונת DIC ותמונת פלואורסצנציה של תא HUVEC בודד בהגדלה של 60 פעמים. גבול סביב קצה התא סומן ידנית בתמונת הפלואורסצנציה.נקודות המוצא של הענפים הוגדרו לאחר מכן על ידי שרטוט קו ישר לרוחב הענף, העובר דרך זווית הקימור הגדולה ביותר משני צדי הענף. ענפים שהיו ארוכים יותר מרוחבם ובאורך מינימלי של 10 microns נספרו, והאורך נמדד מנקודת המוצא של הענף ועד לקצה הדיסטלי שלו. כדי להעריך את נדידת שולי הפצע של תאי אנדותל, תאי HUVECs תורגדו בצפיפות גבוהה, ובוצעו צילומי time lapse של תאים חיים לאחר פגיעה, כפי שמתואר בסרטון זה.כפי שמוצג כאן, תאי אנדותל מקצות הפצע נדדו באופן כווני אל תוך אזור הפצע. תנועה זו נותחה באמצעות הגוף הגרעיני כסמן ייחוס למעקב אחר מהירות הנדידה, העקביות והמרחק. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לגדל, להעביר טרנספקציה ולהכין HUVECs עבור ניסויי דימוג של צורת תאים ודינמיקה של השלד התאי, או עבור מחקרי נדידת תאים מקצות הפצע.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון צימוד פוליאקרילאמיד או קולגן על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות למעורבות תאים של ECMs שעברו שינוי. תודה לצפייה, ובהצלחה בניסוייכם.

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה פרוטוקול וידאו ממחישה את הבידוד של התרבות האנושית וריד הטבור בתאי האנדותל (HUVEC) מ חבל הטבור האדם. לאחר מבודד את התאים האלה יכול לשמש ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה כמו Assay אופטימליים הפיברין ביד ג'ל הוכיח גם על ידי המעבדה יוז.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

הנה אזור רומן של פרוטוקול ניתוח ריבית המבוססת על מיון אליפסות מיטבית הוקצו לאזורים של אות חיובית בתוך רצפי זמן לשגות תמונה דו ממדי מודגם. אלגוריתם זה עשוי לאפשר לחוקרים לנתח באופן מקיף אותות פיסיולוגיים + Ca 2 עם קלט משתמש מינימאלי ומשוא פנים.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים ראשוניים (HUVECs) גודלו למפגש בתוך מכשיר רשת מיקרופלואידי. צומת תאי האנדותל והתפלגות ה-F-actin הודגמו והשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי וייצור תחמוצת החנקן בתגובה לאדנוזין טריפוספט (ATP) כומתו בזמן אמת ברמות תאים בודדים.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

כדי לכמת את זרימת מיקרונימי הדם ממהירות גבוהה מהירות רצף נימי תמונה, פיתחנו צוות (ניתוח זמני מרחבי של זרימת שפילד) תוכנה. מעבר לשדה התמונה המלא ולאורך הזמן, הצוות מעריך מהירויות זרימה ומייצר רצף של מפות מרחבית בצבע לצורך הדמיה ותפוקה טבלאית עבור ניתוחים כמותיים.

אנליזה מרחבית של תזרים שדות במיקרוvasקובלטורה

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הניתוחיים והטכניים המאפשרים הדמיית פלואורסצנטיות מולטי-פוטונית בזמן אמת של מוח המכרסמים במהלך טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חמיצוץ מחסום הדם - מוח.

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

פרוטוקול זה מוקדש להדמיה של מיקרוטובול פלוס-קצה על ידי טרנספקטציה של חלבון EB3 כדי לחקור את התכונות הדינמיות שלהם בתרבית התאים העיקרית. הפרוטוקול יושם על פיברובלסטים ראשוניים אנושיים שהתקבלו מחולים במחלת הנטינגטון.

הדמיה של מיקרוטובול פלוס-אנד דיינמיקס במודל מחלת הנטינגטון המבוססת על פיברובלסטים של העור העיקרי האנושי

המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לניטור השינויים בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) במהלך זיהום ויראלי באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA).

ניטור שינויים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי בעת זיהום ויראלי באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה

למדו לתרבת תאי אנדותל ורידי טבור אנושיים ולנתח דינמיקת מיקרו-טובולים ונדידת תאים באמצעות הדמיה חיה בזמן אמת. השיטה מאפשרת חקר התנהגות ציטוסקלטית ואנגיוגנזה.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

גלה סרטונים נוספים