זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתרבית תאי אנדותל של וריד טבורי אנושי ולנתח דינמיקה של שלד תאים ונדידת תאים באמצעות הדמיית זמן של תאים חיים. שיטות המתוארות בסרטון זה יכולות לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום התא, המולקולרי והמכנוביולוגיה. לדוגמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות כיצד צורת התא והתנועתיות מווסתות על ידי מעורבות של ECMs שונים.

הדגמה חזותית היא קריטית מכיוון ששלבי הכנת הדגימה קשים לביצוע. הם דורשים טיפול מדויק בתאים בזמן לאורך כל התהליך. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תנועתיות תאי האנדותל במהלך אנגיוגנזה, ניתן ליישם אותה גם על חקירות מיקרוסקופיות של כמעט כל מערכת מודל תאים דבקה.

בעזרת מלקחיים, הרם כיסוי מצנצנת אחסון אתנול של 100% והעביר אותו דרך להבת מבער בונסן כדי לעקר אותו. לאחר מכן מניחים אותו בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר. הכן כיסוי אחד לכל דגימה.

לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר הוסף 10 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר תמיסת מלאי פיברונקטין ו -990 מיקרוליטר PBS. ואז פיפטה 250 מיקרוליטר מהתמיסה על כל כיסוי. מורחים את התמיסה באופן שווה כדי לכסות את פני השטח.

דגרו את הכיסויים למשך שלוש שעות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לפני השימוש יש לשטוף כל כיסוי שלוש פעמים עם שני מיליליטר PBS. באמצעות המוציטומטר, קבע את מספר ה-HUVECs המתורבתים והעביר נפח המכיל 100,000 תאים לכל כיסוי לניסויים שאינם הגירה, או 500,000 תאים לכל כיסוי לניסויי הגירה לצינור מיקרו-צנטריפוגה.

סובב את התאים ב-1, 400 פעמים G במשך ארבע דקות כדי לגלול אותם. לאחר הסיבוב, עבור כל מצב שייבדק, השעו מחדש עד מיליון תאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורציה ושלבו אותם עם מיקרוגרם אחד של cDNA. העבירו את התאים לקוביית אלקטרופורציה.

להעביר את התאים ותערובת ה-DNA באמצעות התוכנה המיועדת לאלקטרופורציה של HUVEC. לאחר מכן, הצל את התאים שעברו טרנספטקט על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מדיום בסיסי אנדותל שלם. לאחר מכן, צלח את נפח התא המתאים על כיסויים מצופים פיברונקטין.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד ארבע שעות כדי לאפשר זמן לביטוי מבני ה-cDNA. כהכנה להדמיה, קח שתי רצועות של סרט דו צדדי בגודל 2.5 ס"מ על 0.65 ס"מ ואבטח אותן אופקית לאורך הקצה העליון והתחתון של מגלשת זכוכית נקייה. שימו לב שחשוב לאפשר לכמות קטנה רווח בין הקלטת לקצה ההחלקה לאיטום החדר.

התקן את צד תא הכיסוי כלפי מטה כך ששני הקצוות של הכיסוי מונחים על הסרט. השתמש במלקחיים כדי ללחוץ בעדינות כלפי מטה כדי לאבטח את הכיסוי. בעזרת מיקרופיפטה, הוסף 40 מיקרוליטר של מדיום הדמיה בין הכיסוי לשקופית.

ודא שהרווח בין החלקת הכיסוי לשקופית מלא לחלוטין במדיום הדמיה. כתם את כל המדיום העודף במגבון נייר במידת הצורך. אטום את כל קצוות המגלשות עם VALAP חם.

בדוק אם יש נזילות על ידי לחיצה עדינה על כיסוי הזכוכית. הנח את הכיסוי המותקן והאטום על מיקרוסקופ stage שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, צלם רצפי תמונות זמן-lapse, תמונות חלבון פלואורסצנטי כחול ותמונות DIC.

לנתח את הדינמיקה של המיקרו-צינורות ואת הלוקליזציה המשותפת כמתואר במסמך הנלווה. כדי לבצע בדיקת נדידת תאים, לאחר שלב האלקטרופורציה, הצל את התאים שעברו טרנספטציה על ידי הוספת 80 מיקרוליטר של מדיום בסיסי אנדותל שלם. לאחר מכן, פיפטה את כל הדגימה של 80 מיקרוליטר כטיפה אחת על מרכז כיסוי מיובש מצופה פיברונקטין.

אין לפזר את הטיפה. ייבוש הכיסוי הכרחי כדי למנוע את היפרדות טיפת ה-80 מיקרוליטר במגע עם הכיסוי. גישה זו מאפשרת לרכז HUVECs בתוך שטח קטן של החלקת הכיסוי ובכך מקדמת היווצרות מהירה של חד-שכבת תאים מתכנסת.

דגרו את הכיסוי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד ארבע שעות כדי לאפשר זמן לתאים להיצמד לשכבה חד-שכבתית מתכנסת. לאחר מכן שטפו את השקופיות פעמיים במדיום בסיסי אנדותל שלם כדי להסיר תאים שלא התחברו. כדי ליצור קצה פצע בשכבת החד-שכבת HUVEC, השתמש במלקחיים כדי להחזיק בעדינות את הכיסוי במקומו וגרור בחוזקה סכין גילוח על פני מרכז שכבת התא החד-שכבתית.

אפשר לתאים להתאושש באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר מכן הרכיבו והרכיבו את הכיסויים להדמיה כמו קודם. רכוש תמונות ניגודיות פאזה במרווחים של 10 דקות למשך 12 שעות באמצעות יעד פאזה של צמצם מספרי 10X 0.45 ומעבה למרחקים ארוכים של צמצם מספרי 0.52.

השתמש בחלונית ND Acquisition של התוכנה לרכישת תמונות. לבסוף, כמת הסתעפות והגירה של HUVEC כמתואר במסמך הנלווה. HUVECs הועברו כדי לבטא את mApple-label-EB3, חלבון קושר קצה של מיקרו-צינוריות ונלכדו תמונות זמן-lapse.

תמונות גולמיות של EB3 מוצגות משמאל. שביטים כחולים EB3 שאחריהם עוקבת תוכנת plusTipTracker מוצגים מימין. שביטים שזוהו בתוך כל מסגרת קושרו על סמך השינוי במיקומם ממסגרת למסגרת כדי ליצור רצועות EB3 ושכבת-על חזותית של מסלול EB3, כפי שמוצג כאן.

גדילה איטית וקצרת מועד של מיקרו-צינוריות מוצגת באדום, צמיחת מיקרו-צינוריות איטית וארוכת חיים מוצגת בירוק, צמיחת מיקרו-צינוריות מהירה וקצרת מועד מוצגת בצהוב, וצמיחה מהירה וארוכת חיים מוצגת בכחול. כדי לנתח הסתעפות של תאי אנדותל, DIC ותמונת פלואורסנט של HUVEC בודד נלכדו בהגדלה של פי 60. גבול שורטט ביד סביב קצה התא בתמונה הפלואורסצנטית.

מקורות הענף הוגדרו אז על ידי ציור קו ישר על פני הענף ודרך זווית העקמומיות הגדולה ביותר משני צידי הענף. נספרו ענפים שהיו ארוכים מרוחבם ואורכם מינימלי 10 מיקרון ונמדד אורך ממקור הענף ועד לקצה הדיסטלי של הענף. כדי להעריך את נדידת קצה הפצע של תאי האנדותל, HUVECs תורבבו בצפיפות גבוהה והדמיית זמן של תאים חיים בוצעה לאחר פציעה כמתואר בסרטון זה.

כפי שמוצג כאן, תאי אנדותל בקצה הפצע נדדו בכיוון לאזור הפצע. תנועה זו נותחה באמצעות הגרעין כסמן נאמנות למעקב אחר מהירות הנדידה, ההתמדה והמרחק. לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לתרבית, להעביר ולהכין HUVECs לניסויי הדמיה של צורת תא ודינמיקה של שלד תאים או למחקרי נדידת תאים בקצה הפצע.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צימוד פוליאקרילאמיד או קולגן על מנת לענות על שאלות נוספות הקשורות למעורבות תאים של ECMs ששונו. תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.