Name: גישות גנטיות ביוכימיים עבור In vivo ו במבחנה הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: חקור שיטות גנטיות-ביוכימיות להערכת אוליגומריזציה של קולטן Ryanodine בתאי HEK293. טכניקות אלו מסייעות בחקר מנגנוני הפרעות קצב לב ומחלות קרדיווסקולריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הבריטים Heart Foundation מלגות כדי SZ (FS / 08/063 ו FS / 15/30/31494).

<ol><li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-terminus+oligomerisation+is+conserved+in+intracellular+calcium+release+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels.</a> Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).</li>
<li>Zissimopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminus+oligomerization+regulates+the+function+of+cardiac+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).</li>
<li>Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+aberrant+N-terminus+inter-subunit+interactions+in+mutant+pro-arrhythmic+cardiac+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors.</a> Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).</li>
<li>Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail.</a> Biochem J. 376, 795-799 (2003).</li>
<li>Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interactions%3A+two+methods+for+assessment+of+the+reliability+of+high+throughput+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).</li>
<li>Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continued+evolution+of+two-hybrid+screening+approaches+in+yeast%3A+how+to+outwit+different+preys+with+different+baits%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits.</a> Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).</li>
<li>Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+genetic+in+vivo+methods+for+protein-protein+interaction+studies%3A+from+the+yeast+two-hybrid+system+to+the+mammalian+split-luciferase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).</li>
<li>Yang, M., Wu, Z., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-peptide+interactions+analyzed+with+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system.</a> Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).</li>
<li>Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElion%2C+EA+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2007).</li>
<li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKingston%2C+RE+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22">Curr Protoc Mol Biol</a>. , (2003).</li>
<li>Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hax-1+identified+as+a+two-pore+channel+%28TPC%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein.</a> FEBS letters. , (2013).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+FKBP12.6+with+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain.</a> J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+binding+of+ryanodine+receptors+carrying+mutations+associated+with+arrhythmogenic+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease.</a> Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).</li>
<li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li>
<li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+approaches+to+the+analysis+of+multiprotein+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes.</a> Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).</li>
<li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaraldehyde%3A+behavior+in+aqueous+solution%2C+reaction+with+proteins%2C+and+application+to+enzyme+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).</li>
<li>Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+mechanism+and+end+products+of+glutaraldehyde+crosslinking+reaction+by+X-ray+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis.</a> Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+domain+of+the+human+cardiac+muscle+ryanodine+receptor+does+not+mediate+interaction+with+FKBP12.6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6.</a> Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).</li>
<li>Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+interaction+with+the+SNARE-associated+protein+snapin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin.</a> J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+sensitivity+of+the+ryanodine+receptor+interaction+with+FK506-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein.</a> J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparities+in+the+association+of+the+ryanodine+receptor+and+the+FK506-binding+proteins+in+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+125%22%5BJournal%5D)">Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart.</a> J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).</li>
<li>Ali, M. H., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+oligomerization%3A+how+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein oligomerization: how and why.</a> Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).</li>
<li>Hashimoto, K., Panchenko, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+oligomerization%2C+the+critical+role+of+insertions+and+deletions+in+maintaining+different+oligomeric+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).</li>
<li>Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+stability+of+proteins+in+aqueous+solution%3A+mechanism+and+driving+forces+in+nonnative+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation.</a> Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).</li>
<li>Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+and+quantitation+of+protein+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The detection and quantitation of protein oligomerization.</a> Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).</li>
<li>Kaczor, A. A., Selent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+G+protein-coupled+receptors%3A+biochemical+and+biophysical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods.</a> Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).</li>
</ol>

החוקרים אין להכריז.

ההיווצרות של הומו-oligomers חלבון היא תהליך ביולוגי בסיסי המסדיר את פעילותם של גורמי שעתוק, אנזימים, יון ערוצים קולטני 25,26. חשוב לציין, oligomerization חלבון יש גם השלכות פתולוגיות כולל ניוון מוחיים ומחלות לב arrhythmogenic 4,27. מתודולוגיות המתוארים במאמר זה משמשים לזיהוי אינטראקציות תחום-תחום בתיווך חלבון-שיוך עצמי oligomerization. להלן נבקש להצביע על שלבים קריטיים בתוך כל פרוטוקול, ואנחנו דנים שיקולים, מגבלות חשובות של פתרון בעיות. המערכת Y2H יכול להיות מועסק הראשון למסך שותפים חלבון אינטראקציה פוטנציאל בגלל הקרנת תפוקה גבוהה יחסית, קלות שימוש ותוצאות לשחזור מאוד. נהלי Y2H מתבצעים במעבדה למיקרוביולוגיה עם תקן (צלחת או שתייקרו) חממות ומתקני בלימת חדר. שימוש freshly מוכן תאים מוסמכים (שלב 1.1.8) הם קריטי עבור טרנספורמציה שמרים יעילות גבוהה, ואילו עבור התוצאות הטובות ביותר ב מבחני β-גל, טרי גדלו מושבות שמרים (עד 5 ימים) אמור לשמש (שלב 1.2.3). מערכות מבוססות על גורמי שעתוק מלבד GAL4 ו / או נוספים / גני כתב תחליפיים זמינות, ולכן פיתיון פלסמידים טרף צריך להיות בהתאמה עם זן Y2H המתאים. כמה זנים צריכים להיות תרבותיים בנוכחות 3-אמינו-1,2,4-triazole, מעכב תחרותי של חלבון HIS3, על מנת להרוות את כל ביטוי מכונן של גן כתב HIS3 7,8. ביטוי של חלבוני היתוך פיתיון היעד צריך להיות מאומת על ידי immunoblotting 17. במקרה פיתיון / חלבוני היתוך טרף רעילים שמרים, רמות חלבון נסבלות נמוך יכולות להיות מושגת על ידי שיבוט וקטורים שונים שבם פיתיון / ביטוי טרף הוא מונע על ידי אמרגן שונה. כמו כן, הוא חיוני כדי להבטיח tחלבוני כובע היתוך פיתיון / טרף אינם מציגי פעילות גן הכתב אוטונומי. הפעלת גן כתב אוטונומית יכולה להינצל על ידי שינוי המבנה להסיר באזור האחראי, או על ידי החלפת GAL4 DNA-BD ו התכה לספירה לשני החלבונים נבדקים. יתר על כן, תחומים הטרנסממברני מושמטים טובים יותר מן מבני פיתיון / טרף, כיוון שהם עלולים לגרום misfolding או mislocalization של חלבוני היתוך בתאי קרום תאיים. ואכן, החיסרון העיקרי של מערכת Y2H היא כי חלבונים הפיתיון היעד הם נקודתיים בגרעין שמרים הרחק מיקום subcellular פיזיולוגיים שלהם ואפשרות חסר שלאחר translational שינויים ספציפיים, וכתוצאה מכך אינטראקציות חיוביות שגויות או false-negative 6-9 . מערכות ביטוי Heterologous יונק מתאימות יותר לחקר חלבונים בממברנה אינטגרלי יונקים מבחינת שינויי קונפורמציה, שלאחר translational ולוקליזציה subcellular.אחת השיטות transfection התא הנפוץ ביותר הוא משקעים סידן פוספט, בעיקר בגלל הציוד המינימלי ריאגנטים הנדרש 11,15. שיטות חלופיות, כלומר electroporation, ליפוזומים, שומנים ופולימרים קטיוני, עשויות להניב יעילות transfection גבוהה בהתאם לקו התא לבנות משומש. באופן כללי, הגורמים העיקריים המשפיעים יעיל transfection הם באיכות פלסמיד דנ&quot;א כדאיויות תא בריאות /. התוצאות הטובות ביותר מושגות כאשר פלסמיד דנ&quot;א של הטוהר הגבוה ביותר (יחס ספיגת 260nm / 280nm של ~ 1.8) התאים המתחלקים באופן פעיל משמש. תאים ולכן יש transfected על לא יותר מ 60 - 70% מפגש (שלב 2.1.2), כי את היכולת לקחת את דנ&quot;א זר קשורה שטח הפנים של התא נחשף המדיום 11. בנוסף, הכללת האנטיביוטיקה במדיום התרבות במהלך transfection (שלב 2.1.3) לא מומלצת בשל מוות של תא מוגבר 15. Fאו משקע סידן פוספט בהכנה מסוימת, זהירה וכוונון pH (כדי 7.05 בדיוק) של פתרון 2x HBS (שלב 2.1.1), היווצרות נכונה של DNA פלסמיד / סידן / מתחמי פוספט על ידי ערבוב נמרץ (שלב 2.1.5) הם שלבים קריטיים עבור transfection היעילות גבוהה. בדרך כלל, ביטוי החלבון על ידי פסגות transfection חולף בתוך 24 - 72 שעות. לאחר תאים נקצרים, נהלים עקב חייבים להתבצע ב 4 ° C כדי למזער פעילות הפרוטאז, והוספת מעכבי פרוטאז מומלצת. המגון Cell צריך להיות מלווה צעד צנטריפוגה להסיר גרעינים כי כרומוזומליות DNA עשויה להגדיל את צמיגות פתרון ולשפר את הלא ספציפי מחייב. לפיכך, המגון באמצעים מכניים ב חיץ iso-האוסמוטי הוא העדיף, בדרך כלל (0.3 M) סוכרוז או (150 מ&quot;מ) NaCl. באופן כללי, מאגרים מבוססים סוכרוז ידועים כדי לשפר את יציבות חלבון ולהקטין צבירת חלבון פוטנציאל שאינה ילידי ארץ, אך בשל pהידרציה קשרים על פני החלבון, אינטראקציות חלבון-חלבון אלקטרוסטטית הם העדיפו. לעומת זאת, מאגרים מבוססי מלח להשפיע על מטען נטו של קבוצות צד חומצת אמינו מחויבות על פני החלבון, ובכך שיש הטיה לכיוון יותר אינטראקציות הידרופוביות מבוסס 28. Co-IP הוא assay ביוכימיים המועסק השכיח ביותר להערכת אינטראקציות חלבון-חלבון במיוחד מרקמות ילידים. החיסרון העיקרי שלה הוא הדרישה נוגדנים ספציפיים מאוד תוקף לשימוש IP ו immunoblotting 10,16,18. לפיכך, חלבונים רקומביננטיים לעתים קרובות מתויגים עם epitope הפפטיד, למשל., Hemagglutinin השפעת (YPYDVPDYA) או cMyc אדם (EQKLISEEDL), עבורו נוגדנים ספציפיים גבוהה זיקה זמינות מסחרי. אם תרצה, הנוגדן immunoprecipitating ניתן מצומדות כימית על חלבון-שרף להימנע elution וזיהוי שלה בשלב immunoblotting כי עלול לטשטש את שיתוף זירז protein 16; כדי להשיג זאת, השתמשנו 24 צולבות מקשר כימי בהצלחה 3,3&#39;-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate). זה הכרחי כי חומר ניקוי מתאים כלול למאגר IP ואת החומר המסיס של תאי הומוגני הוסר על ידי צנטריפוגה כדי למזער מחייב ספציפי שאינו (שלב 3.1.3). הבחירה וריכוז חומר הניקוי הם שיקולים חשובים: דטרגנטים חזקים ו / או ריכוזים גבוהים יותר תפחית באופן משמעותי שאינו ספציפי מחייבים אך ייתכן גם לבטל X: אינטראקצית חלבון Y, בעוד ריכוזים נמוכים או דטרגנטים מתונים עשויות לאפשר אינטראקציה חלשה להיות שנצפתה אך רשאית לגרום מחייב מוגזם שאינו ספציפי. דטרגנטים כוח ביניים עדיפים, למשל, טריטון X-100 ב 0.5 -. ריכוז 1%. כדי לצמצם עוד יותר את הלא ספציפית מחייב, חלבון נייטרלי (למשל, אלבומין בסרום שור ב 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) יכול להיכלל במאגר IP, ו / או lysate התא ניתן מראש cleareד עם הדגירה מראש עם שרף חלבון-A לבד. מספר השוטף צריך להיות מותאם עבור X: נבדק זוג Y, בדרך כלל שלושה שוטף של 10 דק &#39;עם חיץ IP (שלב 3.1.9). בכל מקרה, מדגם שיתוף IP עם IgG הלא חיסוני כמו נוגדן immunoprecipitating תמיד צריך להיות מעובד במקביל לשרת מלא שלילי (צעד 3.1.6). היתרון העיקרי של cross-linking כימי הוא שזה מודיע על רכב stoichiometric של-oligomer הומו החלבון. Glutaraldehyde הוא מקשר צולב נפוץ כי זה לא דורש ציוד מיוחד שהוא מייצר תרמית וכימי צולבות קישורים יציבים בין חלבוני אינטראקצית 19,20. תרכובות עם קבוצות אמינו חופשיות להשמיטם מ מאגרי assay (שלב 3.2.1) כי הם להרוות את התגובה הכימית. ריכוז Glutaraldehyde ותגובה הזמן (שלב 3.2.4) צריך להיות מותאם מורכב החלבון oligomeric של עניין. החיסרון העיקרי של שיטה זו, especiברית כאשר היא מבוצעת על הכנות תא כולו, הוא-הסגולי אי התגובה הכימית שיכול להניב אגרגטים חלבון מלאכותיים חסרי משמעות ביולוגית. אלטרנטיבי in vivo (למשל., תהודה העברת אנרגיה פלואורסצנטי, דו-מולקולרי פלואורסצנטי או השלמה הארה) ו בטכניקות חוץ גופית (למשל., כרומטוגרפיה הדרה גודל, ultracentrifugation אנליטית, calorimetry טיטרציה בידוד תרמי) זמינים לאפיון ההתאגדות עצמית חלבון והערכה של oligomerization והרכב 29,30. לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות משלה, והוא עשוי להיות מתאים יותר ללימוד חלבון מסוים תלוי טיהור חלבונים / יציבות וזמינה ציוד / מגיב. שלוש השיטות משלימות שתואר כאן בהרחבה, כלומר Y2H, שיתוף IP ו- cross-linking, שימשו בשילוב לספק הוכחות משכנעות RyR2 הומו-oligomeהיווצרות r בבידוד בתוך תא חי.

התכווצות שרירי השלד ואת הלב מופעלת על ידי הרטיקולום sarcoplasmic Ca 2 + שחרור בתיווך RyR. ישנם שלושה isoforms RyR יונק עם הערוץ הפונקציונלי מורכב מארבעה תת יחידות זהות. כל למקטע RyR מורכב חלק N-terminal רגולטוריות ציטופלסמית גדול חלק C- מסוף קטן המכיל את התחומים הטרנסממברני יוצרים נקבוביים מוליכות גבוהות Ca 2+. תוך חריג ואינטראקציות-למקטע היתר בבסיס תפקוד ערוץ RyR ולגרום תוקפת והפרעות לב 1. זיהוי והאפיון של תחומים ספציפיים המעורבים במבנה RyR: יחסי פונקציה חשוב אם כן להבנת הפתופיזיולוגיה RyR. טכניקות אינטראקציה בין חלבוני ביוכימיים מסורתיות דורשות כמויות ניכרות של חלבונים מטוהרים, לעתים קרובות מיוצרות חיידקים. זה לא ריאלי במקרה של RyR, עמ &#39;קרום גדול מאודrotein מורכב ~ 5000 חומצות אמינו, בעוד שברי רקומביננטי שלה לא מקובל בקלות ביטוי חיידקים וטיהור. לפיכך, מערכות ביטוי חלופיות שמקורם בתאי דם מארח איקריוטיים נדרשות עבור חלבונים בממברנה אינטגרליים יונקים. השתמשנו בעבר Y2H, שיתוף IP מבחני cross-linking להפגין באופן קולקטיבי כי tetramerization N- הסופית היא תכונה מבנית כי נשמרת על פני שלושה יונקים RyR isoforms 2,3. חשוב לציין, מצאנו כי מוטציה נקודתית אחת קשורה למחלות לב arrhythmogenic משבש N הסופית--שיוך עצמי ותוצאות ערוץ RyR מתפקדת 4. גם יש לנו ליישם טכניקות אלה ללימודי oligomerization של זנב C- מסוף ציטופלסמית RyR 5, כמו גם את N- הסופית של ערוץ הגירסות התאי Ca 2 + ההומולוגי, הקולטן אינוזיטול טריפוספט 1,4,5 2. ב assay Y2H, את interactiעל בין שני חלבונים (X ו- Y) נמדדו על ידי הכינון מחדש של גורם שעתוק תפקודי (GAL4) ואת ההפעלה שהתפתחה של גני כתב 6-9. שני וקטורי שיבוט שונים משמשים ליצירת תערובות של שני החלבונים נבדקו עם שני להפרדה פיזית, התחומים העצמאיים של GAL4: DNA מחייבת דומיין (DNA-BD) / חלבון X היתוך (פיתיון) ושם תחום ההפעלה (AD) / חלבון Y היתוך (יעד). Y2H ניתן להשתמש כדי לבדוק אם חלבון אינטראקציה עם עצמו על ידי יצירת GAL4 DNA-BD ו התכה לספירה של אותו חלבון. מהונדסים גנטיים זני Y2H הם GAL4 ו GAL80 לקויים (חלבון GAL80 הוא מדכא של GAL4), כמו גם TRP1 ו LEU2 הלקוי (כדי לספק מבחר תזונתי עבור פלסמידים פיתיון טרף, בהתאמה). בגרעין השמרים, רקומביננטי פפטידים DNA-BD ו AD מובאים לתוך קרבה פיזית קרובה לייצר גורם שעתוק GAL4 היברידי רק דרך &#39;X בשילובים שלהם: int Yeraction. גישה זו מאפשרת סריקה גנטית מהירה לגילוי אינטראקציות בין חלבונים באמצעות הפעלת תעתיק המקבילה של prototrophic (קידוד HIS3 עבור אנזים הכרחי ביוסינתזה היסטידין) ו chromogenic (קידוד LacZ עבור β-galactosidase (β-גל)) גני כתב. היתרון העיקרי של Y2H הוא כי מדובר assay in vivo מאתר אפילו חלשות או חולפות אינטראקציות חלבון-חלבון. יתר על כן, זיהוי כרוך בשימוש הפשוט של מבחר צמיחה (ב היסטידין חסר מדיה) או של colorimetric (β-גל) assay ללא צורך טיהור של חלבוני פיתיון היעד או הדור של נוגדנים ספציפיים. בנוסף, Y2H יכול לשמש מסך אוסף של שיבוטים ידועים אקראיים (שיבוטי ספריית cDNA התמזגו לספירת GAL4) שותפי מחייב רומן של חלבון פיתיון, גם מתן גישה ישירה אל cDNA של חלבון הספרייה. כדי להאריך את התצפיות Y2H, independיכולות להיות מועסקות טכניקות ביוכימיות אף אוזן גרון. Co-IP מבחני cross-linking בשילוב עם immunoblotting שיטות המשמשות לאיתור עמותות חלבון תערובות מדגם מורכבים, למשל., Lysates תא כולו 10. היתרון העיקרי שלהם הוא שהם לדווח על אינטראקציות בין חלבונים מרקמות ילידים, בניגוד לשיטות אחרות שדורשות שימוש חלבונים רקומביננטיים. חלבוני רקומביננטי יכולים לשמש גם, בדרך כלל לידי ביטוי קו תאים יונק, שם הם צפויים להיות שינויי קונפורמציה ופוסט translational הנכונים שלהם, כמו גם לוקליזציה subcellular. עם זאת, מאז שיתוף IP ו- cross-linking נמצאים מבחני חוץ גופית עושה שימוש בתאי הומוגני, יש צורך לאשר אם שני השותפים חלבון שותף מקומי בתא ללא פגע 11. אנו משתמשים באופן שגרתי transfection של HEK293 תאים יונקים להביע קרום נפרד יונקים זמני וחלבונים cytosolic בשיטת משקעים סידן פוספט 2-4,12-14, שתואר כאן בהרחבה. זוהי דרך זולה כדי לספק את ה- DNA פלסמיד ביעילות בתוך התאים אבל זה תלוי בקו תא מסוים בשימוש מפגש התא, כמו גם על טוהר פלסמיד דנ&quot;א 11,15. את assay שיתוף IP כרוך את בידודה של חלבון היליד או רקומביננטי של עניין מ lysates תא בתנאים שאינם denaturing המאפשרים שיתוף הטיהור של שותפי אינטראקציה משוערים 10,16. זה מחייב שימוש של שני נוגדנים עצמאיים, נוגדן immunoprecipitating לבידוד תרמי של החלבון X, ואת נוגדן immunoblotting לגילוי של י &#39;חלבון שותף זה יכול לשמש כדי לבדוק אם חלבון אינטראקציה עם עצמו על ידי יצירת שני בשילובים שונים עם שתי epitope שונה תגים (למשל., HA ו- cMyc). נוגדן immunoprecipitating מאוגד דרך אזור Fc שלה על-חלבון (או חלבון-G, בהתאם למין החיה, כאשר הנוגדן הועלה), אשרהוא מצומדות כדי agarose (או sepharose) שרף. X חלבון הוא זרז ידי הנוגדן: חלבון-שרף הבא דגירה עם lysate התא, כלומר השבר מסיס חומר הניקוי של תאים הומוגני. חיסוני קומפלקסי חלבונים הם eluted עם SDS המכיל חיץ ובהמשך ונותח על ידי SDS-PAGE ו immunoblotting באמצעות נוגדן כדי לזהות הנוכחות של חלבון Y 17. Co-IP צריך להתבצע עם חלבונים מסיסים חומר ניקוי כדי למנוע מחייב הלא ספציפית מוגזם. הבחירה של חומר ניקוי ריכוזו, כמו גם את המספר השוטף, צריכה להיות מותאם לכל X: זוג Y 10,16,18. Cross-linking מועסק כדי לקבוע את stoichiometry של מתחם חלבון oligomeric. היא מבוססת על תגובה כימית כדי ליצור קשרים קוולנטיים בין protomers אינטראקציה הסמוך, ולכן, היא מאפשרת בשימור מצב oligomeric של החלבון במהלך הפרדת SDS-PAGE. ישנם cross-linking רב reagents באורכים וכימיה שונים מיקוד קבוצות תגובתי שונה על חלבונים, בדרך כלל אמינים ראשוניים, קרבוקסיליות או קבוצות תיאול. כאן, אנו מתארים את השימוש של glutaraldehyde (OHC (CH 2) 3 CHO), גידול הומו-דו-תפקודי צולב מקשר עם שתי קבוצות אלדהיד משני לשם כך להגיב עם קבוצות אמינו חופשיות נוכחות שאריות ליזין 19,20. Cross-linking הוא המיושמת באופן הריכוז או שהזמן גרמן וכתוצאה מכך היווצרות adduct. תגובת Glutaraldehyde מופסקת עם הידרזין (H 2 NNH 2) דגימות חלבון מנותחים מכן על ידי SDS-PAGE ו immunoblotting 17 להעריך מדינת oligomerization שלהם. נציין כי cross-linking לא לגרום oligomerization אלא רק יוצר גשרים יציבים בין קומפלקסי חלבונים קיימים. שיקולים חשובים בעת ביצוע ניסויים cross-linking כוללים את הבחירה של מקשר צלב, זמן הריכוז והתגובה שלה 19,20.

<table><tbody><tr><td><חזק>חלק 1 חממת שמרים דו-היברידית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>בשימוש ב-30 מעלות; C</td></tr><tr><td>חממת שייקר אורביטלית</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק</td><td>INNOVA 4300</td><td>בשימוש ב-30 מעלות; C עם טלטול ב-230 - 250 סל"ד</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>למדידת OD600 של תרבית שמרים; למדידת ספיגה ב-420 ננומטר בבדיקת b-Gal נוזלית</td></tr> ערכת <tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Takara</td><td>Clontech</td><td>K1604-1</td><td>מכילה וקטור פיתיון pGBKT7, וקטור טרף pACT2&nbsp; וזן שמרים Y190&nbsp;</td></tr><tr><td>בסיס חנקן שמרים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Y0626</td><td>להכנת מדיום גידול SD מינימלי&nbsp;</td></tr><tr><td>תוסף נשירה חסר לאוצין וטריפטופן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Y0750</td><td>להכנת מדיום גידול SD מינימלי&nbsp;</td></tr><tr><td>תוסף נשירה חסר לאוצין, טריפטופן, היסטידין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Y2001</td><td>להכנת מדיום גידול מינימלי SD&nbsp;</td></tr><tr><td>אשכי הרינג נשא DNA&nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>לטרנספורמציה של שמרים</td></tr><tr><td>נייר סינון Whatman כיתה 5&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>לשימוש בנייר סינון מושבה-הרמה b-Gal מבחן</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>לשימוש בנייר סינון מושבה-הרמה b-Gal מבחן</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>לשימוש בבדיקת</td></tr> <tr><td>b-Gal נוזלית<חזק>חלק 2. ביטוי חלבון בקו תאים של יונקים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קו תאים HEK293</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; &nbsp; CRL-1573 ומסחר;</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור לח (5% CO2, 37 &deg; C)</td> <td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>לתרבית תאי יונקים</td></tr><tr><td>DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>להכנת מצע גידול לתאי יונקים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>להכנת מצע גידול לתאי יונקים</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>להומוגניזציה של תאים</td></tr><tr><td>מחט 23 גרם (0.6 x 30 מ"מ)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>להומוגניזציה של תאים</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז (שלם)&nbsp;</td><td>רוש</td><td>11873508001</td><td>למניעת פרוטאוליזה</td></tr><tr><td><חזקה>חלק 3. שיטות ביוכימיות במבחנה&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (מערכת SDS-PAGE)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&nbsp;</td><td>לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (מערכת העברה חצי יבשה)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>להעברה אלקטרופורטית</td></tr><tr><td>מעבד סרטי רנטגן קומפקטי</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>לשימוש באימונובלוטינג</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>לשימוש בחרוזי ספרוז חלבון-A צולבים כימיים</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>GE Healthcare מדעי החיים</td><td>17-5280-01&nbsp;</td><td>לשימוש בבדיקת Co-IP</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 ארנב פוליקלונלי IgG)</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-805</td><td>לשימוש בבדיקת co-IP ארנב</td></tr><tr><td>לא חיסוני IgG</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה&nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>לשימוש בבדיקת co-IP</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 עכבר חד שבטי IgG)</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה&nbsp;</td><td>sc-40</td><td>לשימוש באימונובלוטינג</td></tr><tr><td>אנטי-HA (16B12 עכבר חד-שבטי IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>לשימוש באימונובלטינג</td></tr><tr><td>נגד עכבר IgG-HRP</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-2005</td><td>לשימוש באימונובלטינג</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>לשימוש ב-immunoblotting</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce ( ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>לשימוש ב-immunoblotting</td></tr></tbody></table>

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; in vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן ryanodine

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

אוליגומריזציה היא לעתים קרובות דרישה מבנית לחלבונים כדי לבצע את התפקוד התאי הספציפי שלהם. לדוגמה, טטרמריזציה של קולטן הריאנודין (RyR) נחוצה ליצירת נקבוביות תעלת שחרור Ca2+ פונקציונלית. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים להערכת הקשר העצמי של חלבונים, כולל שמרים דו-היברידיים (Y2H), קו-אימונו-משקעים (co-IP) ומבחני קישור צולבים כימיים. במערכת Y2H, אינטראקציה עצמית של חלבון מזוהה על ידי בדיקת β-galactosidase בפיתיון GAL4 המבטא שמרים והיתוך מטרה של חלבון הבדיקה. אינטראקציה עצמית של חלבון מוערכת עוד יותר על ידי co-IP באמצעות היתוך מתויג HA ו-cMyc של חלבון הבדיקה המתבטא בתאי HEK293 של יונקים. הסטוכיומטריה המדויקת של החלבון הומו-אוליגומר נבדקת על ידי קישור צולב וניתוח SDS-PAGE לאחר ביטוי בתאי HEK293. באמצעות טכניקות שונות אך משלימות אלה, צפינו בעקביות באסוציאציה העצמית של תחום ה-RyR N-terminal והדגמנו את יכולתו הפנימית ליצור טטרמרים. ניתן ליישם שיטות אלה על אינטראקציה בין חלבון לחלבון ומחקרי הומו-אוליגומריזציה של חלבוני ממברנה אינטגרליים אחרים של יונקים.

במערכת Y2H, הפיתיון: האינטראקציה טרף נבחנת בתחילה על ידי בחירת צמיחת שמרים במדיום חסר (טריפטופן, לאוצין ו) היסטידין ובהמשך הוערך על ידי מבחני הפעילות האנזימטית β-גל (איור 1). שמרים בתרבית היסטידין בינוני חסר יש שיעור צמיחה איטי כי תלוי בחוזק של פיתיון: אינטראקצית חלבון טרף. את assay β-הגל מתבצע בשמרים (בתרבית בינונית חסרה רק טריפטופן לאוצין) או גובר על תמיכה מוצקה (צלחות אגרו) או בתרבות הנוזלת, עם תוצאות כמותיות המניבים האחרונות. השתמשנו בהצלחה את Y2H לזהות אינטראקציות תחום-תחום בתוך RyR2 כמו גם שותפי חלבון רומן 2-4,12,21,22. לדוגמא, אנחנו הקרנו סדרת חופפי בונה פורשת את אורכו של רצף הפפטיד RyR2 לאינטראקציה עם שבר N- מסוף (AD4L: שאריות RyR2 1 - 906 התמזג עם AD GAL4). 3 מבחני מושבה מתיח מסנן נייר β-גל פיק מושבות שמרים כחולים בצבע חד יחיד עבור BT4L: זוג AD4L (איור 2 א), מראים כי AD4L אינטראקציה עם עצמו, כלומר BT4L לבנות (שאריות RyR2 1 - 906 התמזגה עם GAL4 DNA-BD). מושבות כחולות לבנבן אותרו עבור BT8: זוג AD4L דבר המצביע על עמותה משנית חלשה עם התחום בטרמינל C-הקיצוני (BT8), בעוד שמרים שיתוף הפך עם כל מבנה אחר נשארו לבן ולכן שלילי עבור פיתיון: אינטראקצית חלבון טרף. תוצאות כמותיות, מתקבלות על ידי מבחני β-גל נוזלי (איור 2 ב), מצביעים BT4L החזק: שווה ערך אינטראקצית AD4L בחוזק להתאחדות הידועה בין חלבון p53 (pVA3) ו אנטיגן T הגדול SV40 (pTD1), ואילו BT8: אינטראקצית AD4L ניכר היה חלש (&lt;10% לעומת קבוצת ביקורת). אנו שגרתי לבצע ניסויים-IP שיתוף (איור 3) וollowing ביטוי חולף בקו תא יונק (HEK293), בתור שחקן assay ביוכימיים עצמאי לחזק את ממצאי Y2H 2-4,12-14,21-24. כדי לוודא RyR2 N הסופית- אינטראקציה עצמית, שני פלסמידים נפרדים קידוד עבור שאריות RyR2 1 - 906 מתויגים עם או את epitope הפפטיד cMyc או HA (BT4L ו AD4L, בהתאמה), היה שיתוף transfected בתאי HEK293 בשיטה משקע סידן פוספט 3. השבר שלאחר הגרעין של תאים הומוגני היה solubilized עם בחורים חומרי ניקוי, ואת החומר מסיס הוסר על ידי צנטריפוגה לייצר lysate התא. Lysate התא, שטופלו dithiothreitol סוכן צמצום, הודגר אז עם Ab HA וחלבון-A חרוזים sepharose כדי immunoprecipitate HA-tagged AD4L. דגימות Co-IP, eluted עם SDS המכילים חיץ, הועמסו על שני ג&#39;לים SDS-PAGE נפרד (1/10 וה 9/10 פיצול ה) ונותחו על ידי immunoblotting עם Ab HA וא.ב. cMyc, respectively. IP הישיר המוצלח של AD4L (~ 100 KDA) על ידי Ab HA אומת על ידי immunoblotting, אך לא השליטה שהלילית באמצעות IgG ארנב הלא חיסוני (איור 4 א). חשוב לציין, cMyc מתויג BT4L (~ 100 KDA) נמצאה רק IP Ab HA, ולא בבקרה שלילית בהיעדר AD4L immunoprecipitated (איור 4B). Y2H מבחני שיתוף IP ספקו הוכחות עקביות עבור RyR2 N הסופית- אינטראקציה עצמית, אבל הם לא הודיעו על מצב oligomerization של תחום N-terminal, כלומר אם הוא יוצר דימרים בלבד או מתחמים גבוהים. יצוין כי מתחמי יהיה לנתק ורק יחידות משנה המהווים יזוהו על ידי SDS-PAGE בגלל SDS- ו denaturation חלבון חום הנגרמת ביטול אינטראקציות חלבון-חלבון. כדי להתגבר על זה, אנו משתמשים cross-linking (איור 5) כי כימי ביציבות conjoins protei קייםoligomers n, מסה מולקולרית אשר יכול אז להיבדק על ידי הפרדה גודל SDS-PAGE 2-5. לדוגמא, homogenate תא HEK293 להביע cMyc-BT4L, שטופל dithiothreitol סוכן הצמצום, היה הגיב glutaraldehyde ונותח על ידי SDS-PAGE ו immunoblotting באמצעות Ab cMyc (איור 6). בנוסף מונומר (~ 100 KDA), להקת חלבון מסה מולקולרית גבוהה של ~ 400 kDa זוהתה באופן תלוי זמן, המציין היווצרות tetramer RyR2 N הסופית- 3. יש לציין, tetramer היה מינים oligomeric השולט, עם דימר מינימלי ולהקות trimer ציין. כדי לקבוע מסה מולקולרית לכאורה שלה, oligomer BT4L הופרד עד 4 - 15% שיפוע SDS-PAGE ג&#39;לים 3. הפקנו עקומת סטנדרט מולקולרי מסה / ג&#39;ל פיגור באמצעות סטנדרטים חלבון עם מגוון של 30 - 460 kDa, ו חישבנו את oligomer להיות 358 kDa 15 (n = 4). מסה מולקולרית לכאורה זו עולה בקנה אחד עם tetramer BT4L מסודרבצורה מעגלית סגורה ולא בצורה ליניארית, כצפוי מן הסידור של ארבע יחידות משנה בתוך ערוץ RyR2 ילידים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה Y2H. שמרים, שיתוף הפך עם פלסמידים הפיתיון היעד, נבחרה לצמיחה במדיום חסר היסטידין ו / או assayed עבור β-גל הפעילות האנזימטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> איור 2. Y2H ממליץ RyR2 N הסופית- דומיין עצמית אינטראקציה. (א) סכמטי המתאר את (הפיתיון) סדרת שברי חלבון חופפים האדם RyR2 נבדק במערכת Y2H עבור<html> אינטראקציה עם מבנה RyR2 N-terminal AD4L (טרף). לתוצאות בדיקות איכותיות מתקבלות על ידי מבחני מושבה מתיח מסנן נייר β-גל מסומנות ב &quot;+&quot; בכפולות או &quot;-&quot; לאינטראקציה שלילית (ב) מבחני כמותי נוזלי β-גל מנורמל נגד הבקרה החיובית (pVA3 מקודד עבור GAL4 DNA-BD. היתוך עם חלבון p53; pTD1 מקודד עבור היתוך לספירה GAL4 עם אנטיגן T גדול SV40). שונה מ 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> איור 3. Co-IP תרשים זרימה. בתאי יונקים, שיתוף transfected עם פלסמידים X ו- Y, הם הומוגני-solubilized דטרגנט לייצר lysate התא בשימוש assay שיתוף IP, ואחריו SDS-PAGE ו immunoblotting.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> איור 4. Co-IP מציין RyR2 N הסופית- דומיין עצמית אינטראקציה בתאי יונקים. HEK293 התאים היו שיתוף transfected עבור שיתוף ביטוי חולף של cMyc מתויג (BT4L) ו HA-tagged (AD4L) RyR2 N הסופית- מושלם ( שאריות 1 - 906). AD4L היה immunoprecipitated עם Ab HA מ בחורים-solubilized ו lysate HEK293 שטופל dithiothreitol, ואילו שליטה שלילי, מבחנים-IP שיתוף בוצעו עם IgG הארנב הלא חיסוני. חלבוני immunoprecipitated חוממו על 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחליטו על 20 מילים-אמפר עבור 3 שעות באמצעות ג&#39;לים 6% SDS-PAGE נפרד עמוס 1/10 ה או 9/10 ה של דגימות ה- IP. העברת חלבון לאחר ב 80 V עבור שעה 2 על polyvinyקרום lidene difluoride, ניתוח immunoblotting בוצע באמצעות (1: 1,000 דילול) Ab HA (A) או Ab cMyc (B), בהתאמה, ואחריו IgG עכבר אנטי peroxidase מצומדות חזרת (1: 10,000 דילול) וזיהוי chemiluminescence משופרת (1 חשיפה דקה). Aliquot של lysate תא, 1/50 ה מנפח מעובד בדגימות IP, נכלל גם לשרת רגיל מסה מולקולרית כמו. שונה מ 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> איור 5. Cross-linking תרשים זרימה. בתאי יונקים, טרנספקציה עם פלסמיד X, הם הומוגני נתון התגובה עם glutaraldehyde ב assay cross-linking, ואחריו SDS-PAGE ו immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> איור 6. Cross-linking מציין RyR2 N הסופית- דומיין tetramer גיבוש HEK293 התאים היו transfected עבור ביטוי חולף של מתויג cMyc (BT4L) RyR2 N הסופית- מושלם (שאריות 1 - 906).. homogenate הסלולרי, שטופל dithiothreitol סוכן הצמצום, הודגר עם glutaraldehyde עבור נקודות זמן המצוינות. דוגמאות היו מחוממות על 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחליטו על ידי SDS-PAGE (6% ג&#39;ל) ב 20 mA עבור 3 שעות. בעקבות העברת חלבון ב 80 V עבור שעה 2 על קרום difluoride polyvinylidene, ניתוח immunoblotting בוצע באמצעות (1: 1,000 דילול) Ab cMyc, ואחריו IgG עכבר אנטי peroxidase מצומדות חזרת (1:10,000 דילול) וזיהוי chemiluminescence משופרת (1 חשיפה דקה). Monomeric (M: ~ 100 KDA) ו tetrameric (T) צורות מסומנות על ידי החצים. שונה מ 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

המטרה הכללית של שלוש טכניקות ניסיוניות משלימות אלו, כלומר, yeast two-hybrid, Co-immunoprecipitation וקישור צולב כימי (chemical cross linking), היא להעריך אינטראקציות בין חלבונים, ובפרט שיוך עצמי (self-association), ולקבוע את ההרכב הסטוכיומטרי של הומו-אוליגומרים של חלבונים. שיטות אלו יכולות לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הקרדיופתיה, כגון אוליגומריזציה של קולטנים (receptors), העומדת בבסיס הפרעות קצב לבביות ומוות פתאומי. היתרונות העיקריים של טכניקות אלו הם תפוקת סינון גבוהה יחסית, קלות שימוש ותוצאות הניתנות לשחזור רב, תוך דרישה למינימום של ציוד וריאגנטים.להשלכות של טכניקות אלו יש השפעה על הטיפול במחלות לב אריתמוגניות, שכן הן מסייעות בביסוס המנגנון המולקולרי של פעולתם של תרופות אנטי-אריתמיות. בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטת Co-immunoprecipitation יתקלו בקשיים בשל סיכון להשלכת חרוזי האגרוז של החלבון, שהם קטנים מאוד, במהלך שאיבת הנוזל העליון (supernatant) בשלבי הצנטריפוגציה. במבחן yeast two-hybrid זה, נעשה שימוש בתאי שמרים בשלב mid-log לצורך טרנספורמציה.אספו את התאים באמצעות צנטריפוגציה, השעיקו מחדש כל משקע בחמישה מיליליטר של מים סטריליים, ואחדו את תללי התאים. בצעו צנטריפוגציה לתליי התאים. לאחר השלכת הנוזל העליון, השעיקו מחדש את משקע השמרים במיליליטר אחד של תמיסת lithium acetate ו-TE סטרילית בריכוז one-x שהוכנה טרי. יש להשתמש בתאי השמרים הקומפטנטיים בתוך שעה מההכנה.הכינו דגימות פלסמיד על ידי ערבוב DNA של פלסמיד פיתיון (bait) ומטרה (target) עם 100 micrograms של DNA נשא מביושי חריש. לכל מבחנה של 1.5 milliliter, הוסיפו 100 microliters של תרחיף שמרים כשירים ו-600 microliters של תמיסת lithium acetate ו-PEG בריכוז one-X, וערבבו במכשיר vortex למשך כ-30 שניות. דגרו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך 30 דקות, תוך써 ניעור.הוסיפו 80 µL של dimethyl sulfoxide וערבבו היטב על ידי היפוך עדין. בצעו הלם תרמי למשך 15 דקות באמבט מים של 42 °C, תוך ערבוב מדי שתיים עד שלוש דקות. קררו את תרחיף התאים על קרח למשך שתי דקות, ולאחר מכן סבבו במסננת (centrifuge) כדי להשיב את השמרים.שחזר כל משקע תאים ב-100 µL של 1X TE. פזור את התאים על מצעי SD מינימליים מתאימים כדי לשמור על לחץ סלקטיבי עבור הפלסמידים של הפיתיון (bait) והמטרה (target). דגור את הצלחות הפטריות כשהן הפוכות בטמפרטורה של 30 °C למשך ארבעה עד חמישה ימים. מושבות השמרים מוכנות לבדיקה זו כאשר קוטרן מגיע לכ-2 mm.העבירו בעזרת פיפטה 2.5 milliliters של תמיסת Z buffer ו-X-gal שהוכן טרי לצלחת נקייה בקוטר 100-millimeter, והניחו בצלחת נייר סינון תאית. הניחו נייר סינון חדש מעל פני השטח של הצלחת המכילה את מושבות השמרים לבדיקה. השתמשו בפינצטה כדי לשפשף בעדינות את נייר הסינון על הצלחת, והמתינו כחמש דקות עד שמושבות השמרים ייצמדו.תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים, הרם בזהירות את נייר המסנן ושקע אותו בתוך מאגר של חנקן נוזלי למשך 30 שניות. הנח לנייר המסנן הקפוא להפשיר בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. הנח את נייר המסנן, כאשר צד המושבות פונה כלפי מעלה, מעל לנייר המסנן שהספג מראש בתוך פיתח של 100 מילימטר, והדגר ב-30 degrees Celsius עד להופעת מושבות כחולות.יום אחד לפני הטרנספקציה, האכילו תאי HEK293 בצלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר, כדי שהתאים יגיעו ל-60 עד 70 אחוזי התמסכות (confluency) למחרת. תרבתו במשך 16 עד 18 שעות באינקובטור לח. ביום הטרנספקציה, דללו 24 micrograms של פלסמיד DNA עם 60 microliters של calcium chloride בריכוז 2.5 molar ומים סטריליים דה-יוניים כדי להגיע לנפח כולל של 600 microliters.ערבבו בעזרת וורטקס. הוסיפו את תמיסת ה-DNA מהפלסמה בתוספת סידן בטפטוף למבחנה של 50 מיליליטר המכילה 600 µL של 2X HEPES-buffered saline, תוךما ערבוב קבוע ונמרץ בעזרת וורטקס. דגרו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסים של DNA מהפלסמה עם סידן פוספט.לאחר דגירה של 20 דקות, ערבלו קצרה במערבל (vortex), והוסיפו את התמיסה בטפטוף על תאי HEK293 כך שתכסה את כל שטח הפנים של פטריית המערכת (petri dish). דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% פחמן דו-חמצני (CO2). לאחר כשישה שעות, החליפו את מצע הגידול והחזירו את התאים לאינקובטור.24 שעות לאחר הטרנספקציה, קצרו את התאים כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול. השעיקו מחדש את משק תאי התאים ב-500 microliters של בופר הומוגניזציה קר (בטמפרטורת קרח) והעבירו את תרחיף התאים לשפופרת של 1.5 milliliter המכילה גלגלוlets זכוכית. השתמשו במחט דקה המחוברת למזרק של one-millimeter כדי לבצע הומוגניזציה לתאים על קרח.כאשר מכסה הפסולה סגור, דקרו את המכסה עם המחט ופזרו בעוצמה את תרחיף התאים דרך פיתי הזכוכית. סובבו בצנטריפוגה ב-1500 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי להסיר גרעינים ותאים שלא נשברו. שמרו את הנוזל העליון, המהווה את הפракציה הפוסט-גרעינית, לשימוש בניסויי co-immunoprecipitation או cross linking.כדי להתחיל בהליך זה, המיסו את הפракציה התת-תאית הפוסט-גרעינית עם 0.5% chaps והדגרימו למשך שעתיים לפחות בטמפרטורה של 4°C עם ערבוב קבוע. ביצעו סנטריפוגה ב-20,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לשקע את החומר הבלתי ממיס. שמרו את העילוי.זהו נקרא ליסאט התאים. הכין חרוזי אגרוז עם Protein-A בבופר immunoprecipitation כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול. הוסף מיקרוגרם אחד של הנוגדן המשקיע (immunoprecipitating antibody) לשפופרת אחת המכילה Protein-A.כביקורת שלילית, הוסף מיקרוגרם אחד של IGG לאימוןי למבחנה השנייה המכילה protein-A. דגרי למשך שעתיים לפחות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, תוך ערבוב קבוע. השג את החרוזים באמצעות סנטריפוגציה והסר בזהירות את העילוי באמצעות פיפטור.העבירו 200 µL של ליסאט התאים לכל אחד משני המבחנות המכילות נוגדן וחרוזי protein-A. דגרו למשך שעותיים לפחות בטמפרטורה של 4 °C תוך ערבוב קבוע כדי לאפשר קישור בין האנטיגן לנוגדן. אספו את החרוזים ושטפו אותם עם 200 µL של בופר immunoprecipitation.דגרו למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב. לאחר שלושה שטיפות, השילו בזהירות את העלה באמצעות פיפטה. הוסיפו 30 µL של בופר לטעינת חלבונים אל החרוזים וסובבו בצנטריפוגה ב-1500 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.שמרו את תמיסת העילאית המכילה את דגימת ה-co-IP שהוזכרה עבור SDS page ו-immunoblotting בהמשך. לצורך ביצוע קשירה כימית (cross-linking), סובבו בצנטריפוגה את הפракציה התת-גרעינית לאחר הפרדת הגרעין כדי לשקיע אגרגטים של חלבונים. שמרו את תמיסת העילאית וחלקו אותה לשמונה מנות של 20 µL כל אחת.הוסף גלוטראלדהיד בריכוז של 0.0025 אחוז נפח-נפח לדגימה אחת בלבד. הפעל את הטיימר והשאר את הגלוטראלדהיד להגיב בטמפרטורת החדר למשך הזמן המצוין. עצור את תגובת הגלוטראלדהיד בזמן המוגדר באמצעות הידראזין בריכוז של שני אחוז נפח-נפח, והוסף חמישה µL של תחליל טעינה לחלבונים (protein loading buffer) בריכוז 5X כדי לדנטורציה של החלבונים.שיטת השמרים דו-היברידית (Yeast two-hybrid) שימשה לסריקת מבנים חופפים המכסים את כל אורך רצף הפפטיד של קולטן הריינודין, כדי לבחון אינטראקציה עם AD4L ומקטע קצה סופי. בדיקות beta-gal על נייר מסנן בשיטת Colony-lift הניבו מושבות בצבע כחול עז רק עבור הזוג BT4L/AD4L, מה שמעיד על כך ש-AD4L מקיימת אינטראקציה עם עצמה. מושבות בצבע כחול חיוור זוהו עבור הזוג BT8/AD4L, דבר המרמז על קשר משני וחלש יותר עם תחום הקצה ה-C הקיצוני.תוצאות כמותיות מבדיקות beta-gal נוזליות הצביעו על אינטראקציה חזקה בין BT4L ל-AD4L, בעוצמה השקפה לאסוציאציה הידועה בין חלבון P53, pVA3, לבין האנטיגן T הגדול של SV40, pTD1. האינטראקציה בין BT8 ל-AD4L הייתה חלשה באופן משמעותי. ממצאי מערכת ה-yeast two-hybrid תומכים בתוצאות ניסויי co-immunoprecipitation שנערכו לאחר ביטוי זמני של AD4L מתויג ב-HA ושל BT4L מתויג ב-cMyc בקו תאים של יונקים.נצפתה אימונו-שיקוע ישיר של AD4L מתויג ב-HA באמצעות נוגדן 2 HA, ו-BT4L מתויג ב-cMyc שוחזר רק באימונו-שיקוע אנטי-HA. קישור צולב כימי בוצע על הומוגנאט תאים המבטאים cMyc BT4L, ולאחריו בוצעו SDS page ואימונו-בלאוטינג, תוך שימוש בנוגדן ל-cMyc. בנוסף למונומר של 100 kilodalton, זוהה פס חלבון בעל מסה מולקולרית גבוהה של כ-400 kilodaltons באופן תלוי-זמן, מה שמעיד על היווצרות טטראמר של קולטן ריאנודין וטרמינוס.בעת ניסיון ביצוע טרנספקציה של תאי יונקים באמצעות שיקוע סידן פוספט, חשוב לזכור לערבל (vortex) את בופר הפוספט באופן קבוע ועוצמתי בתוך מבחנה גדולה כדי להבטיח אוורור יעיל, תוך כדי הוספה איטית מאוד של תמיסת ה-plasma DNA. לאחר ביצוע הליכים אלו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית בדימוי סידן. טכניקות אלו אמורות לסייע במענה על שאלות נוספות, כגון הלוקליזציה ותכונות שחרור הסידן של תעלות קולטן הריאנודין בתאים חיים.לאחר פיתוחן, סללו טכניקות אלו את הדרך עבור חוקרים בתחומים מגוונים של העברה תאית (cell signaling) להערכת הומו-אוליגומריזציה של חלבונים, תהליך ביולוגי בסיסי המווסת את פעילותם של גורמי שעתוק, אנזימים, תעלות יונים וקולטנים.

genetic-biochemical-approaches-for-vivo-vitro-assessment-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את הבדיקה הדו-היברידית של שמרים כדי לזהות אינטראקציות עצמיות ספציפיות של חלבונים. בבדיקה זו, החלבון המעניין מתויג לשני תחומים של גורם שעתוק המקודד את האנזים β-גלקטוזידאז. כאשר שני החלבונים מתקשרים זה עם זה, הדבר גורם לשעתוק ולתרגום ליצירת האנזים, אשר מזוהה לאחר מכן באמצעות בדיקה ביוכימית.

בדיקת שמרים דו-היברידית לקביעת הקשר העצמי של חלבונים בתאי שמרים

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש...

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

מאמר זה מתאר שיטות ספציפיות כדי לקבל כמויות הביוכימי של solubilized-חומרי ניקוי TRPV1 לניתוח spectroscopic. הפרוטוקולים המשולב לספק כלים הביוכימי biophysical זה ניתן להתאים להקל פונקציונלי מבניים ללימודי תעלות היונים בתרבית של סביבה מבוקרת ממברנה.

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים של נחישות ביטוי, טיהור, התגבשות ומבנה חלבון של התחום N-מסוף של קולטן ryanodine מ- diamondback עש (Plutella xylostella).

מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella

כאן, אנחנו תיאר שיטה הדמיה גבוהה-תוכן לכמת התעבורה של מוטציות אופסין # רודופסין הקשורים עם רטיניטיס פיגמנטוזה. ניתוח התוצאות מרובות באורך הגל שימש לכמת אופסין # רודופסין החלבון על פני התא או את כל התא.

וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין על ידי ניתוח גבוהה-תוכן הדמיה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לגילוי ולוקליזציה של חלבון עובר Drosophila ו- RNA מאוסף להטבעה והטבעה מראש, אימונוסטיור ו- mRNA בהכלאה במקום .

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

אזורים לא מסודרים מהותיים (IDR) הם תחומי חלבון גמישים המשנים את הקונפורמציה שלהם בתגובה לשינויים סביבתיים. Ensemble Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) יכול להעריך את ממדי החלבונים בתנאים שונים. אנו מציגים גישת FRET להערכת רגישות מבנית IDR בתאי Saccharomyces cerevisiae חיים תחת לחץ היפראוסמוטי.

הערכת רגישות מבנית של אזורים לא מסודרים במהותם בתגובה לעקה היפראוסמוטית בתאים חיים באמצעות FRET

בדיקת רגישות חזותית לטאות באמצעות פרדיגמה התניה אופרנטית המעסיקה וידאו השמעה אקראית של נקודה kinematograms ו ממוחשבת חסרי חוליות.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

חקור שיטות גנטיות-ביוכימיות להערכת אוליגומריזציה של קולטן Ryanodine בתאי HEK293. טכניקות אלו מסייעות בחקר מנגנוני הפרעות קצב לב ומחלות קרדיווסקולריות.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור

גלה סרטונים נוספים