פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר תאי גזע טרופובלסטים מושרים או iTSCs מפיברובלסטים של עכברים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע לגבי אופי המחסום המפריד בין השושלת העוברית לשושלת העוברית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהביטוי הטרנסגני מופעל רק באופן זמני, מה שמקל על בחירת תאים שהומרו ביציבות.

במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית שנייה באמצעות ציוד המגן האישי המתאים, מכסים חמש צלחות של 100 מיליליטר בחמישה מיליליטר של תמיסת פולי-L-ליזין, ומנענעים בעדינות את הצלחות כדי לפזר באופן שווה את תמיסת הציפוי. מניחים את הכלים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז שואבים את הפולי-L-ליזין ושוטפים את הכלים פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, צלחת שבע פעמים 10 עד שישית 293 תאי T למנה ב -10 מיליליטר של מדיום תאי T 293, סובב את הכלים כדי לפזר את התאים באופן שווה ולהחזיר את הכלים לחממה.

למחרת בבוקר, החלף את מצע הגידול בחמישה מיליליטר של מדיום טרנספקציה. לאחר מכן טפלו בתרביות בשישה מיקרוליטרים של מלאי 1000X של תמיסת כלורוקווין והחזירו את הצלחות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי להכין את תערובת הטרנספקציה, עבור כל וקטור לנטיויראלי, הוסף 600 מיקרוליטר של תמיסת DNA של לנטיוקטור טיפה חכמה לתוך 600 מיקרוליטר של תמיסת מלח חוצצת 2X HEPES תוך כדי מערבולת ודגירה של תערובת הטרנספקציה בטמפרטורת החדר.

לאחר 15 דקות מוסיפים בזהירות רבה את התערובת בחוכמה טיפה ל -293 תאי ה- T המוכנים, ומחזירים את הכלים לחממה. לאחר חמש עד שש שעות, החלף את המדיום ב -10 מיליליטר של מדיום לייצור וירוסים, והחזיר את הצלחות לחממה. למחרת בבוקר, החלף בזהירות את המדיום בשבעה מיליליטר של מדיום לייצור וירוסים טריים לדגירת לילה נוספת.

לאחר מכן, העבירו את המדיום מכל צלחת לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר והוסיפו שבעה מיליליטר של מדיום לייצור וירוסים טריים על הצלחות לדגירת לילה נוספת. למחרת בבוקר, קצרו את האצווה השנייה של המדיום המכיל את הנגיף, איגדו את הסופרנטנט עם האצווה הראשונה של הנגיף וסננו את המדיום המכיל את הנגיף דרך מסנן קרום אצטט תאית נטול פעילי שטח של 0.45 מיקרון לאחסון ב-500 מיקרוליטר Aliquots במינוס 80. כדי להמיר את הפיברובלסטים לתאי גזע טרופובלסטים מושרים, שטפו את הפיברובלסטים העובריים המומרים או MEFs פעמיים עם שני מיליליטר PBS.

לאחר מכן נתק את התאים עם 0.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש עד ארבע דקות, ודא שהתאים התרוממו מהצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך ואז הפעל את הטריפסין עם מיליליטר אחד של מדיום TS. העבירו את מתלי התאים לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר וצנטריפוגה של התאים.

לאחר מכן השעו מחדש את הכדורים בשני מיליליטר של מדיום TS, וצלחו פעמיים 10 עד החמישי ארבעה גורמים mCherry או שלטו ב-MEFs לא מתמרים לכל צלחת של 100 מיליליטר ב-10 מיליליטר של מדיום TS המכיל גורם גדילה פיברובלסטים ארבע והפרין בתוספת דוקסיציקלין לתרבית לילה. למחרת, תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, השתמש בביטוי החלבון mCherry כדי להעריך את יעילות ההתמרה. אם יעילות ההתמרה היא כ -100% החזר את התרביות לחממה, והחלף את המדיום בכל הכלים כל יומיים עד יום 10.

לאחר מכן, הזינו את התאים במדיום TS טרי המכיל גורם גדילה פיברובלסטים ארבע והפרין ללא דוקסיציקלין באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לנטר את הופעתם של אזורים טרנסדיפרנציאלים בצלחת ארבעת הגורמים למשך שלושה שבועות. זיהוי האזורים הטרנס-דיפרנציאלים הוא קריטי, מכיוון שבשלב זה, MEFs אינם דומים מבחינה מורפולוגית לתאי גזע טרופובלסטים. חפש מושבות שנערמו בצפיפות בסמוך לתאי הענק של הטרופובלסט המזוהים על ידי גודל התא והגרעין הגדול שלהם.

כדי לבודד קווי iTSC בודדים, נגב תחילה את המיקרוסקופ ההפוך עם 70% אתנול כדי למזער את הסיכוי לזיהום חיידקי. לאחר מכן, הוסיפו 40 מיקרוליטר של 05% טריפסין EDTA ל-12 בארות של צלחת באר תחתונה של 96 U, והניחו את הצלחת על קרח. כעת שאפו את המדיום מצלחת הטרנסדיפרנציאציה MEF של ארבעת הגורמים ושטפו את התאים פעם אחת עם 10 מיליליטר PBS.

לאחר הכביסה מוסיפים לתאים 10 מיליליטר PBS טרי ומניחים את הצלחת על שלב המיקרוסקופ ההפוך. בעזרת פיפטה של 100 מיקרוליטר המוגדרת ל-40 מיקרוליטר, הקיפו כל מושבה בנפרד עם קצה הפיפטה ושאבו את המושבה הצפה שהתקבלה. העבירו כל מושבה לבארות בודדות של צלחת 96 הבאר עד שנקטפו 12 מושבות.

לאחר מכן דגרו על המושבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בתום הדגירה, נתקו את התאים עם פיפטינג והעבירו את תרחיפי התאים לבארות בודדות של צלחת 24 בארות המכילה 500 מיקרוליטר של TS שלם בתוספת גורם גדילה פיברובלסטים ומדיום הפרין לתרבית לילה. למחרת, החלף את המדיום ב- TS שלם טרי בתוספת גורם גדילה פיברובלסטים ומדיום הפרין כדי להסיר את התאים המתים ולהחזיר את הצלחת לחממה.

ניטור התרבויות מדי יום להופעת מושבות אפיתל עם גבולות בהירים. כאשר נצפות המושבות, תרבית התאים עד שבוע או עד שהם מתכנסים 70%. בתרביות שבהן מופעל ביטוי הטרנסגנים של ארבעת הגורמים, התאים משנים במהירות את המורפולוגיה.

בסביבות הימים 14 עד 21 מופיעים אזורים מובחנים ומובחנים. מושבות ראשוניות אלה חסרות את המורפולוגיה האופיינית של תאי גזע טרופובלסטים, אולם ברגע שהן עוברות תת-תרבית, נצפית מורפולוגיה אפיתלית אופיינית עם קצוות הדוקים וגבולות בהירים, המזכירה מאוד תאי גזע טרופובלסטים אמיתיים. כאשר תאי הגזע של הטרופובלסט המושרים על ידי ארבעת הגורמים נשארים חיוביים עבור גורם השעתוק של הטרופובלסט, Cdx2 ו-Tfap2c, ניתן להשתמש ברעיון של קווים אלה לניתוחים עוקבים במבחנה או InVivo.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שישה שבועות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הזרקה בסיוע פיצוץ כדי לענות על שאלות נוספות לגבי פוטנציאל הכימריזציה של ה-iTSCs שנוצרו. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום או בהפרדת שושלות מוקדמות לחקור את המרת גורל התאים העובריים לעומת העובריים בעכברים.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להמיר ישירות פיברובלסטים עובריים חדשים לתאי גזע טרופובלסטים מושרים. אל תשכח שעבודה עם וקטורים לנטי-ויראליים עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי יש להקפיד תמיד על אמצעי זהירות כגון שימוש בנהלי עבודה מתאימים ברמת בטיחות ביולוגית שתיים.