Name: פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: למדו להמיר פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסט מושרים (iTSCs) באמצעות הבעה זמנית של גורמי שעתוק. שיטה זו מאפשרת חקר מסלולי התמיינות ופיתוח השליה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+commun%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538(2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li>
<li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+S+%22Science%22">Science</a>. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li>
<li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta%2Factivin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li>
<li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550(2007).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

גורם 4 (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) פרוטוקול transdifferentiation המבוסס שהוצג כאן מציע שיטה אמינה לייצר המרת בנאמנות iTSCs מ פיברובלסטים עובריים בעכבר. יתר על כן, השיטה היא גם ישימה עבור פיברובלסטים זנב שלאחר לידה, אם כי עם ירידה יעילה לעומת פיברובלסטים עובריים 3. באופן כללי, איכות פיברובלסטים העיקרי היא גורם קריטי של תוצאת transdifferentiation וטיפול יש לנקוט כדי להשתמש בתאים מעבר מוקדם (מעבר שני כדי שלוש). <p class="jove_content" style=";text-align:right;directio...

לאחרונה, במחקר שהשווה כמה גישות של תאי גזע עוברי בעכבר כדי Trophoblast המר גזע תאים גילה כי בכל המערכות המנותחות, מרת שושלת נשארת שלמה. במקום תאי גזע trophoblast המושרה (iTSCs) שנקראים גזע trophoblast תאים דמויי תאים נוצרו שמירה על זיכרון של תא גורל ממוצא 1. כאן פעלנו ע&quot;פ גישה שונה של דור iTSC. בדומה האינדוקציה הישירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מ פיברובלסטים עובריים בעכברים (MEFs) 2, iTSCs הומר ישירות מרקמת סומטיים מובחנת. ראשית, זיהינו 12 גורמי מועמד התרמת גורל TSC כאשר ביתר MEFs. בהמשך, הגורמים Tfap2c, Gata3, Eomes ו Ets2 זוהו להיות הכרחי ומספיק אינדוקציה iTSC 3. במקביל, קבוצה נוספת באופן עצמאי מצאו Tfap2c, Gata3 ו Eomes להיות בהן כדי להפוך את MEFs לתוך iTSCs. עם זאת, באותהמחקר, הזמן הנדרש ביטוי transgene מושווה הרבה יותר זמן במחקר שלנו, המציין קינטיקה מרה שונה, כאשר Ets2 תיאור מקוקטייל transdifferentiation 4. בסרום שור עובר קונבנציונלי (FBS) המכיל תרבות של מושרה בתאי גזע trophoblast נגזר הבלסטוציסט מסתמך על הנוכחות של גורמים המופרשים MEFs מומת צמיחה 5,6. במהלך אינדוקצית iTSC, הגורמים הללו ניתנים על ידי MEFs, אשר חסרים את השילוב המלא של transgenes ואינם עובר transdifferentiation. עם זאת, ברגע הפרט מושבות iTSC הם תת תרבות, הם דורשים מדיה, אשר כבר preconditioned ידי MEFs צמיחה מומת. משם ואילך, iTSCs יכול להיות מתורבת ומטופל כמו TSCs הבלסטוציסט נגזר על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. מן הראוי לציין כי, בניגוד טנקה et al. 5, אנו שגרתי תרבות TSCs ו iTSCs ללא gelatinizing מנות תרבית תאים.

<table><tbody><tr><td>דוקסיציקלין היקלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9891-10G</td><td>ממיסים ב-PBS סטרילי, מכינים תמיסת מלאי של 2 מ"ג/מ"ל. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>מלח כלורוקווין דיפוספט&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>הכן תמיסת מלאי של 25 מ"מ במים סטריליים בדרגת תרבית תאים. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>פוליברן (Hexadimethrine bromide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>הכן תמיסת מלאי של 8 מ"ג/מ"ל במים בדרגת תרבית תאים סטרילית. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים רקומביננטי אנושי 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>מתמוסס בסטרילי 0.1% BSA ב-PBS, הכן 25 ומיקרו; פתרון מלאי g/ml. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -80 מעלות; C</td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>הכן תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסה ב-PBS סטרילי. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -80&deg; C</td></tr><tr><td>ProFection מערכת טרנספיקציה של יונקים</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, ללא גלוטמין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>פולי-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תאית אצטט ללא פעילי שטח</td><td>קורנינג</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>חומצות</td> <td>אמינו לא חיוניותThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO), כיתה תרבית תאים</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>עכברים B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7</td><td>JAX עכברים</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע trophoblast

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

תאי גזע Trophoblast (TSCs) העולות אגב החלטת גורל התא הראשונה בפיתוח יונק. הם יכולים להיות מתורבת במבחנה, שמירה על היכולת העצמית לחדש להתמיין בכל תתי הסוגים של השושלת trophoblast, שווה ערך ל vivo ב גזע עלייה נותן אוכלוסיית תאים לחלק העוברי של השליה. לכן, TSCs מציע מודל ייחודי ללמוד פיתוח שליה עוברי לעומת החלטת גורל תא חוץ עוברית במבחנה. משלב הבלסטוציסט ואילך, מחסום אפיגנטיים מובחן המורכב שינויים מתילציה דנ&quot;א היסטון בחוזקה מפריד הוא שושלות. כאן אנו מתארים פרוטוקול להתגבר על זה המכשול השושלת באופן מלא על ידי חולף ביטוי יתר של רגולטורים מרכזיים trophoblast Tfap2c, Gata3, Eomes ו Ets2 ב פיברובלסטים עובריים בעכברים. תאי גזע trophoblast המושרה מסוגלים עצמי לחדש והם כמעט זהים הבלסטוציסט תא גזע trophoblast נגזר iבמונחי n של מורפולוגיה, ביטוי גנים סמנו דפוס מתילציה. תפקודי במבחנת מבחני vivo לאשר כי התאים האלה מסוגלים להבחין לאורך שושלת trophoblast יוצרת תאים ענקים trophoblast polyploid ו chimerizing השליה כאשר מזריקה blastocysts. האינדוקציה של תאי גזע trophoblast מרקמות סומטיים פותחת אפיקים חדשים ללמוד את מאפיינים גנטיים אפיגנטיים של שושלת חוץ עוברית זה, ומציעה את האפשרות ליצור שורות תאי גזע trophoblast מבלי להרוס את העובר בהתאמה.

על הצלחת שבו ביטוי transgene של 4F מופעל, תאים לשנות מורפולוגיה במהירות (השווה איור 2 א &#39;וב&#39;). בסביבות יום 14 - 21 אזורים transdifferentiated ברורים לצוץ (שתי דוגמאות ניתנות באיור 2B ו- C). מושבות העיקריות אלה חסרי מורפולוגיה TSC טיפוסית; אולם ברגע שהם תת תרבות, מורפולוגיה אפיתל מאפיין עם קצוות הדוקים וגבולות בהירים מאוד מזכירים TSCs בתום לב עולה (איור 2 ד). 4F-iTSCs כתם חיובי עבור שעתוק tr...

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק תאי גזע טרופובלסטים מושראים (iTSCs) אמיתיים מפיברובלסטים של עכברים. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום תאי הגזע הנוגעות לטבעו של המחסום המפריד בין השושלה העוברית לשושלה שאינה עוברית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהביטוי הטרנסגני מופעל באופן זמני בלבד, דבר המקל על בחירת תאים שהומרו באופן יציב.במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), תוך שימוש בציוד המיגון האישי המתאים, כסו חמש צלחות של 100 מיליליטר בחמישה מיליליטר של תמיסת Poly-L-lysine, תוך ניעור עדין של הצלחות כדי להפיץ את תמיסת הציפוי באופן שווה. הניחו את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לאחר מכן שאבו את ה-Poly-L-lysine ושטפו את הצלחות פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, זרעו 7×10⁶ תאי 293 T לכל צלחת ב-10 מיליליטר של מדיום תאי 293 T, סובבו את הצלחות כדי להפיץ את התאים באופן שווה והחזירו את הצלחות לאינקובטור.בבוקר למחרת, החליפו את מצע הגידול ב-5 milliliters של מצע טרנספקציה. לאחר מכן, טפלו בתרביות ב-6 microliters של תמיסת מלאי 1000X של Chloroquine והחזירו את הצלחות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. להכנת תערובת הטרנספקציה, עבור כל וקטור Lentiviral, הוסיפו בטיפות 600 microliters של תמיסת Lentivector DNA לתוך 600 microliters של 2X HEPES buffered saline תוך כד

protocol-for-direct-conversion-murine-embryonic-fibroblasts-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את בידודה של blastocysts העכבר ואת הגזירה של בתאי גזע trophoblast מ blastocysts. אנחנו גם לתאר את תנאי תחזוקה של הנכס בתאי גזע, כמו גם גיוס של בידול בתרבות.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס"מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מתוכנתים מחדש ומאופיינים ללא גורמים והמרה למצבים קליניים משוערים.

גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של קבוצה מינימלית של גורמי שעתוק. טכנולוגיה זו עשויה להיות מתורגמת למערכת האנושית כדי לספק פלטפורמות למחקר עתידי של המטופואיזה, מחלות המטולוגיות והשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

במחקר זה, אנו מייצרים תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מתאי מי שפיר של עכברים, באמצעות מערכת טרנספוזון שאינה מבוססת ויראלית.

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של תאים טרופובלסטיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חלבון מורפוגני בעצם 4 ומעכבים של מסלולי האקטיבין/צמתים. שיטה זו מתאימה להתמיינות יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ויכולה לייצר כמויות גדולות של תאים למניפולציה גנטית.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירה וכימות של תת-סוגים לבביים מגוונים שתוכנתו מחדש באמצעות אספקה מתווכת רטרו-וירוס של Gata4, Hand2, Mef2c ו-Tbx5.

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

כאן אנו מציגים שלנו פרוטוקול עבור הפקת המושרה אבות erythroid (iEPs) מן העכבר fibroblasts למבוגרים באמצעות מונחי-פקטור שעתוק ישיר לשושלת התכנות (DLR).

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להערכת שינויים בכלי הדם האימהיים במהלך ההריון בעכברים. באמצעות שיטות סטריאולוגיות, שיפוץ העורקים הספירליים העשרוניים מוערך כמותית והתוצאות מאושרות איכותית באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

למדו להמיר פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסט מושרים (iTSCs) באמצעות הבעה זמנית של גורמי שעתוק. שיטה זו מאפשרת חקר מסלולי התמיינות ופיתוח השליה.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

גלה סרטונים נוספים