פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק תאי גזע טרופובלסטים מושראים (iTSCs) אמיתיים מפיברובלסטים של עכברים. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום תאי הגזע הנוגעות לטבעו של המחסום המפריד בין השושלה העוברית לשושלה שאינה עוברית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהביטוי הטרנסגני מופעל באופן זמני בלבד, דבר המקל על בחירת תאים שהומרו באופן יציב.

במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), תוך שימוש בציוד המיגון האישי המתאים, כסו חמש צלחות של 100 מיליליטר בחמישה מיליליטר של תמיסת Poly-L-lysine, תוך ניעור עדין של הצלחות כדי להפיץ את תמיסת הציפוי באופן שווה. הניחו את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לאחר מכן שאבו את ה-Poly-L-lysine ושטפו את הצלחות פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, זרעו 7×10⁶ תאי 293 T לכל צלחת ב-10 מיליליטר של מדיום תאי 293 T, סובבו את הצלחות כדי להפיץ את התאים באופן שווה והחזירו את הצלחות לאינקובטור.

בבוקר למחרת, החליפו את מצע הגידול ב-5 milliliters של מצע טרנספקציה. לאחר מכן, טפלו בתרביות ב-6 microliters של תמיסת מלאי 1000X של Chloroquine והחזירו את הצלחות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. להכנת תערובת הטרנספקציה, עבור כל וקטור Lentiviral, הוסיפו בטיפות 600 microliters של תמיסת Lentivector DNA לתוך 600 microliters של 2X HEPES buffered saline תוך כדי ערבוב ב-vortex, והדגירו את תערובת הטרנספקציה בטמפרטורת החדר.

לאחר 15 דקות, הוסיפו בזהירות רבה את התערובת בטפטוף לתאי 293 T שהוכנו, והחזירו את הצלחות לאינקובטור. לאחר חמש עד שש שעות, החליפו את המצע ב-10 milliliters של מצע להפקת נגיפים, והחזירו את הצלחות לאינקובטור. למחרת בבוקר, החליפו בזהירות את המצע בשבעה milliliters של מצע טרי להפקת נגיפים לדגירה נוספת של לילה.

בשלב הבא, העבירו את המצע מכל צלחת למבחנות קוניות של 15 milliliter והוסיפו שבעה milliliters של מצע טרי לייצור נגיפים לצלחות לדגירה נוספת למשך לילה. למחרת בבוקר, אספו את המנה השנייה של המצע המכיל נגיפים, איחדו את העל-נוזל (supernatant) עם המנה הראשונה של הנגיפים, וסננו את המצע המכיל נגיפים דרך מסנן ממברנה של cellulose acetate נטול חומר פעיל שטח בסינון של 0.45 micron, לצורך אחסון באליקוטים (Aliquots) של 500 microliter בטמפרטורה של minus 80. כדי להמיר את הפיברובלסטים לתאי גזע של טרופובלסט מושראים, שטפו את הפיברובלסטים העובריים מהמסה שעברו טרנסדוקציה, או MEFs, פעמיים עם שני milliliters של PBS.

לאחר מכן, נתקו את התאים באמצעות 0.5 milliliters של תמיסת Trypsin EDTA בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שלוש עד ארבע דקות, ודאו תחת מיקרוסקופ הפוך כי התאים התנתקו מהפלטה, ולאחר מכן בטלו את פעולת ה-Trypsin באמצעות 1 milliliter של מצע TS. העבירו את תרחיפי התאים למבחנות קוניות נפרדות של 15 milliliters וסבבו את התאים בצנטריפוגה.

לאחר מכן, השביו את המשקעים (pellets) בשני מיליליטר של מצע TS, וזרעו $2 \times 10^5$ תאי MEFs שטרנסדוקציה להם mCherry או תאי ביקורת שאינם טרנסדוקטביים, לכל צלחת בנפח 100 מיליליטר, ב-10 מיליליטר של מצע TS המכיל גורם גדילה של פיברובלסטים 4 (FGF4) והפרין (Heparin) בתוספת דוקסיציקלין (Doxycycline) לתרבית לילה. למחרת, תחת מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה, העריכו את יעילות הטרנסדוקציה באמצעות ביטוי חלבון mCherry. אם יעילות הטרנסדוקציה היא כ-100%, החזירו את התרביות לאינקובטור, והחליפו את המצע בכל הצלחות מדי יומיים עד ליום ה-10.

לאחר מכן, האכילו את התאים במצע TS טרי המכיל fibroblast growth factor four ו-Heparin ללא Doxycycline, תוך שימוש במיקרוסקופ הפוך כדי לעקוב אחר הופעת אזורים שעברו בידול חוזר (transdifferentiated) בצלחת עם ארבעת הגורמים למשך עד שלושה שבועות. זיהוי האזורים שעברו בידול חוזר הוא קריטי, מכיוון שבנקודה זו, תאי MEFs אינם דומים מורפולוגית לתאי גזע של טרופובלסט. חפשו מושבות צפופות הסמוכות לתאי ענק של טרופובלסט, המזוהים לפי גודל התא והגרעין הגדול שלהם.

כדי לבודד קווי iTSC בודדים, ראשית נגבו את המיקרוסקופ ההפוך ב-70% ethanol כדי למזער את הסיכוי לזיהום חיידקי. לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של 0.5% Trypsin EDTA ל-12 בארות של פלטת 96 בארות בעלת תחתית U, והניחו את הפלטה על קרח. כעת שאבו את המצע מכלי הטרנס-דיפרנציאציה של MEF בעל ארבעת הגורמים ושטפו את התאים פעם אחת עם 10 mL של PBS.

לאחר השטיפה, הוסיפו 10 milliliters של PBS רענן לתאים והניחו את הפלטה על במה של מיקרוסקופ הפוך. בעזרת פיפט של 100 microliter המכוון ל-40 microliters, הקיפו כל מושבה בודדת עם קצה הפיפט ושאבו את המושבה הצפה שנוצרה. העבירו כל מושבה לבארים בודדות בפלטת 96 בארות, עד לבחירת 12 מושבות.

לאחר מכן, דגרו את המושבות בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות. בסיום הדגירה, הפרידו את התאים באמצעות פיפטינג והעבירו את תרחיפי התאים לבארים בודדות בלוח 24 בארות המכיל 500 µL של מצע TS מלא בתוספת fibroblast growth factor ו-Heparin לתרבית לילה.

יש לנטר את התרביות מדי יום כדי לזהות הופעתם של מושבות אפיתליאליות בעלות גבולות בהירים. כאשר נצפות מושבות, יש לתרבת את התאים עד לשבוע או עד להגעה ל-70% confluent. בתרביות שבהן פועל ביטוי הגן של ארבעת הגורמים, התאים משנים את המורפולוגיה במהירות.

בסביב הימים 14 עד 21, מופיעים אזורים מובחנים של טרנס-דיפרנציאציה. מושבות ראשוניות אלו אינן בעלות המורפולוגיה האופיינית לתאי גזע של טרופובלסט, אולם לאחר תרבית משנית (subculture), נצפית מורפולוגיה אפיתליאלית מאפיינת עם קצוות צפופים וגבולות בהירים, המזכירה מאוד תאי גזע של טרופובלסט אמיתיים. כאשר תאי גזע של טרופובלסט שהשרו ב ארבעת הגורמים נשארים חיוביים לגורמי השעתוק של הטרופובלסט, Cdx2 ו-Tfap2c, ניתן להשתמש בקווים אלו לניתוחים עוקבים In vitro או In Vivo.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלימה בתוך שש שבועות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הזרקה בסיוע פעימה (blast assisted injection), כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לפוטנציאל הכימריזציה של ה-iTSCs שנוצרו. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ההפרדה המוקדמת של שורות תאים (lineage segregation) לחקור את המרת גורל התאים העוברי לעומת התאים חוץ-עובריים בעכברים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי הדרך להמרה ישירה של פיברובלאסטים עובריים לתאי גזע טרופובלסט מושריים. זכרו כי עבודה עם וקטורים לנטיביריים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להקפיד תמיד על נקיטת אמצעי זהירות, כגון שימוש בנהלי עבודה המתאימים לרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2).