בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

המטרה הכוללת של שיטת FINA זו, המייצגת בידוד סינון של חומצות גרעין, היא לבודד DNA גנומי להגברת PCR מדגימות מורכבות במהירות ובפשטות ללא שימוש במכשור מעבדתי כגון צנטריפוגה. שיטת מיצוי DNA מהירה זו מבוססת נייר עבור DNA פרו-ויראלי HIV פותחה לשילוב במכשיר אבחון PCR כמותי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להכין מראש את מודולי הכנת הדגימה וצינורות ה-PCR, כך שמיצוי ה-DNA אורך פחות משתי דקות.

פיתחנו לראשונה שיטה זו כדי לשלב אותה בדגימה כדי לענות על בדיקת אבחון מוקדמת לתינוקות ל-HIV-1 מדם עקב. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהסרת הגיבוי של הסרט הדו-צדדי המחזיק את קרום לכידת התאים לצד צינור ה-PCR דורש תרגול. מי שתדגים את ההליך תהיה ג'ן ריד, טכנאית בכירה מהמעבדה שלי.

התחל הליך זה על ידי הכנת החומרים הדרושים להרכבת מודול הכנת הדגימה של FINA. הכן את כרית הספיגה על ידי חיתוך ריבוע בגודל 35 על 35 מילימטר של כרית כותנה בעובי 2.6 מילימטר. הכן סרט פרפין מפלסטיק עם סרט גיבוי נייר.

חותכים חתיכת סרט פרפין בגודל 25 על 50 מ"מ ולאחר מכן משתמשים בפטיש כדי לנקב חור בקוטר 7.14 מ"מ במרכז הסרט. הכן קרום מפריד דם מזכוכית כרוך או דיסק לכידה באמצעות פטיש כדי לנקב עיגול בקוטר 8.35 מ"מ. כדי להרכיב את מודול הכנת הדגימה של FINA השתמש במלקחיים כדי למקם את דיסק הלכידה במרכז כרית הספיגה.

הסר את הגב של סרט סרט הפרפין והנח אותו מעל דיסק הלכידה כך שכל סרט הפרפין ישאיר את מרכז דיסק הלכידה חשוף. הקפידו על מגע מקסימלי בין הדיסק לכרית הספיגה על ידי מתיחת סרט הפרפין מעט כדי לכסות את כרית הספיגה ולחיצה חזקה על סרט הפרפין כדי להדביק אותו לכרית הספיגה סביב כל קצוות הדיסק. נדרש דיסק סרט 5.1 מ"מ כדי לעגן את קרום הלכידה לצד צינור ה-qPCR כדי למנוע מהממברנה לחסום את זיהוי הקרינה של מכשיר ה-PCR בזמן אמת.

הכן דיסק קלטת זה באמצעות פטיש כדי לנקב עיגול של סרט אבחון פוליאסטר מצופה כפול מגיליון של הסרט. בעזרת מלקחיים יש להסיר צד אחד של תוחם המדבקה. הנח את הסרט לתוך צינור PCR של 200 מיקרוליטר, והדביק אותו על צד אחד ולכיוון תחתית הצינור.

הסר את תוחם המדבקה השני. הצינור מוכן כעת לקבל את הדיסק המוכן. זיהוי DNA פרו-ויראלי מדם מלא עם תאי 8e5 LAV יודגם בסרטון זה.

הפשירו את כדורי תאי 8e5 LAV שהוקפאו בעבר על קרח. הכן דילול סדרתי של התאים במדיום הקפאה בריכוזים הנעים בין 1 ל -400 תאים למיקרוליטר. פיפטה 10 מיקרוליטר תאים מכל אחד מהדילולים לצינור מיקרו צנטריפוגה.

הוסף 100 מיקרוליטר של דגימת דם מלאה שטופלה ב-HIV-1 שלילי לכל צינור כדי ליצור עקומה סטנדרטית. מערבבים על ידי לחיצה עדינה על תחתית הצינור חמש פעמים. כדי להתחיל בהליך מיצוי ה-DNA, יש לבזבז את תאי הדם על ידי הוספת טריטון X-100 לריכוז סופי של אחוז אחד.

מערבבים על ידי לחיצה עדינה על תחתית הצינור חמש פעמים. הדם צריך להפוך לאדום שקוף. העבירו את כל דגימת הדם על דיסק הלכידה.

אטימה אטומה למים בין סרט הפרפין לקרום הלכידה מבטיחה שהדם יזרום דרך הממברנה. ומגע טוב בין קרום המגע למכלול כרית הספיגה מבטיח פתילת דגימה מהירה. הניחו לדגימה להיספג דרך המסנן.

ליזאט הדם נספג לתוך דיסק הלכידה והדיסק נראה מחצלת. הוסף 600 עד 1,000 מיקרוליטר של 10 מילימול נתרן הידרוקסיד טיפה על דיסק הלכידה. המסנן ישתנה מאדום ללבן, מה שמעיד על פינוי המוגלובין.

לאחר מכן, הפרד את הדיסק מכרית הספיגה והחל את הדיסק על הסרט בצינור ה-PCR המוכן. לאחר הנחת המסנן בצינור ה-PCR, נתח את הדגימה מיד. הכן את תערובת המאסטר qPCR כמתואר בטקסט הפרוטוקול וודא שהמסנן מכוסה לחלוטין בתערובת המאסטר ונשאר קבוע לצד הצינור לאורך כל התגובה.

בצע הגברה באמצעות התקן PCR בזמן אמת כמתואר בטקסט הפרוטוקול. לחלופין, אם לא ניתן לבצע qPCR, יש לייבש את המסנן למשך הלילה בקופסה המכילה חומר ייבוש סידן גופרתי. למחרת, יש לכסות ולהניח את צינור ה-PCR בשקית מסוכלת עם חומר ייבוש סיליקה ולאחסן בטמפרטורת החדר עד שיהיה מוכן לניתוח.

שיטה זו מאפשרת הגברה יעילה של פרו-וירוס HIV-1 מתאי 8e5 LAV במספרי עותקים שונים. הקווים המוצקים הם עלילות הגברה המתקבלות מארבעה שכפולים של דם מלא שלילי HIV-1 עם 4, 000, 400, 40 ו-10 תאי 8e5 LAV עם 500 עותקים לכל תגובה של הבקרה הפנימית. הקו המקווקו מציין את הסף.

הגרף הבא מציג עקומות סטנדרטיות של ערכי מחזור כימות המחושבים מתרשים ההגברה vs. log מספר עותק של 8e5 תאי LAV לכל 100 מיקרוליטר דם מלא. יעילות ה-PCR המחושבת הייתה 103%לשכפולי העקומה הסטנדרטית של ה-DNA הפרו-ויראלי של HIV יש גם הגברה הניתנת לשחזור.

בנוסף, נוכחות של בקרה פנימית של 500 עותקים של הידרוקסי פירובט רדוקטאז מראה כי אין עיכוב PCR הנובע משאיבת דם בשיטה זו ללא תלות במספר העותקים של פרו-וירוס HIV-1 הקיימים. הקווים המלאים מייצגים את עלילות ההגברה והקו המקווקו מייצג את הסף. בעקבות הליך זה ניתן להגביר יעדי PCR מסוגי דגימות שונים כדי לזהות את הגן המעניין שלך.

לדוגמה, ספוגיות לחיים לבדיקה פרמקוגנטית או דם לגנוטיפ מהיר של מודלים של בעלי חיים. אל תשכח שעבודה עם פתוגנים הנישאים בדם עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות אוניברסליים בעת ביצוע הליך זה.