Name: בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: למדו את שיטת FINA לבידוד DNA גנומי מדגימות דם מורכבות ללא ציוד מעבדתי. שיטת הנייר המהירה מאפשרת הכנת דגימות בפחות משני דקות לזיהוי HIV באמצעות PCR כמותי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פיתוח פרוטוקול זה נתמך על ידי מענק האתגרים הגדולים של קרן ביל ומלינדה גייטס בבריאות גלובלית 37774. ריאגנטים וייעוץ PCR בזמן אמת סופקו על ידי Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. תאי 8E5-LAV סופקו על ידי המעבדה לאבטחת איכות וירולוגיה, Rush Presbyterian; המרכז הרפואי סנט לוק. דם שלילי ל-HIV-1 סופק על ידי Core Lab, NorthShore University HealthSystems, אוונסטון, אילינוי. תודה למארק פישר על העזרה בצילום.

הצהרה אתיקה: דגימות דם כולו נעשה שימוש במחקר זה אינם נחשבים מחקר מעורבים בבני אדם. הדגימות התקבלו למטרות אבחון קליניות, אשר היו מרוצות, ואת החלק הנותר של דגימות אלה סופק עבור assay מחקר FINA. הדגימות קודדו כך שהחוקרים לא הצליחו לברר את זהות אנשים בקלות. 1. הכנת מודול הכנת דוגמאות FINA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן סופג כרית על ידי חיתוך 35 x 35 מ&quot;מ 2 של צמר גפן 2.6 מ&quot;מ עובי 100%. חותכי כרית אחת לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן סרט פרפין פלסטיק עם קלטת גיבוי נייר ידי פיסת חנית של סרט פרפין (25 מ&quot;מ (ח) ב -50 מ&quot;מ (w)) ולאחר מכן ניקוב חור בקוטר 7.14 מ&quot;מ במרכז את הקלטת באמצעות אגרוף חור מונע פטיש. כן קלטת אחת לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין קרום מפריד זכוכית דם כבול (קרום לכיד) דיסק ידי ניקוב עיגול בקוטר 8.35 מ&quot;מבאמצעות אגרוף חור מונע פטיש. פונץ &#39;דיסק אחד לכל דגימה. הדיסק יש יכולת כושר סינון של 2.3 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכיבו את מודול הכנת המדגם FINA ידי הצבת את הדיסק ללכוד במרכז הנייר הסופג באמצעות מלקחיים. מניח את קלטת סרט פרפין על דיסק צילום, כך החור של קלטת פרפין עוזב את המרכז של הדיסק ללכוד חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח מגע מרבי בין דיסק הנייר הסופג על ידי מתיחת קלטת פרפין מעט כדי לכסות את הנייר הסופג ולחיצה על קלטת פרפין בתקיפות לתקוע אותו אל הנייר הסופג סביב כל הקצוות של הדיסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות כמה מודולים כנדרש לצורך הניסוי או לאגור לשימוש עתידי. </li></ol> 2. הכנת Tube qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דיסק הקלטת 5.1 מ&quot;מ אשר לעגן את קרום ללכוד תאים אל הצד של הצינור qPCR כדי למנוע קרום לחסום את גילוי הקרינה על ידי ניקוב מעגל של polye פעמיים מצופהSter סרט אבחון עם אגרוף מונע פטיש מסדין של הקלטת. הכין דיסק קלטת אחת לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צד אחד של אוניית המדבקה של הקלטת. מניחים את קלטת לתוך צינור PCR 200 μl, דבק בו על צד אחד ו לכיוון החלק התחתון של הצינור. הסר את האונייה מדבקה השנייה. הצינור מוכן כעת לקבל דיסק מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר כמה צינורות כנדרש לצורך הניסוי או לאגור לשימוש עתידי. </li></ol> 3. להמציא דם דגימה הערה: אם דגימה במבחן אמיתית שמכינה, המשך לשלב 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי 8e5-LAV הפשרה 15 מחסה עותק יחיד של provirus HIV-1 המתקבל מעבדת אבטחת האיכות וירולוגיה (VQA; Rush Presbyterian / הסנאט במרכז הרפואי של לוק, שיקגו, אילינוי.). הערה: הם מאוחסנים כדורי תא קפוא בריכוז של 4,000 תאים / μl. ספירת תאים אומתה כפי שתואר לעיל 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן serדילול ial מקפיא בינוני (בסרום שור עוברי 90%, sulfoxide דימתיל 10%) לריכוזים בטווח שבין 1 ל 400 תאים / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 10 תאי μl מכל אחד הדילולים סדרו לתוך צינור microcentrifuge. הוספת 100 μl של כל דגימת דם מטופלי EDTA השלילית HIV-1 טריה על צינור אחד כדי ליצור עקומת סטנדרט של מספרי עותק 8e5-LAV 10-4,000. מערבבים על ידי מצליף התחתון בעדינות של הצינור 5 פעמים. </li></ol> 4. בצע הפקת FINA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse דם התאים על ידי הוספת טריטון-X100) לריכוז סופי של 1% (11 μl 10% טריטון-X100 110 μl כולו דם ותאי משלב 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי מצליף התחתון בעדינות של הצינור 5 פעמים. הדם צריך להאדים שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet כל דגימת דם על הדיסק ללכוד. הערה: חותמת מים חזקה בין קלטת פרפין הממברנה ללכוד מבטיחה כי הדם זורם דרך הממברנה, וקשר טוב בין ללכוד מ &#39;embrane והרכבת נייר סופג מבטיחים פתילת מדגם מהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מדגם לספוג דרך המסנן. הערה: פתילות דם lysate לתוך הנייר הסופג בשל פעולה נימי, ללכוד את הדנ&quot;א הגנומי על פני השטח של הדיסק ללכוד. את lysate שספג לתוך הדיסק כאשר הוא מופיע מט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 600-1,000 μl 10 מ&quot;מ NaOH ירידה מבחינת על הדיסק ללכוד. הערה: חיץ לשטוף ניתן להוסיף גם כתוספת עיקר 600 μl. המאגר יהווה אגל בקלטת פרפין הידרופובי פתיל דרך החור אל הדיסק ב כ 20 שניות. המסנן ישתנה מאדום אישור מציין לבן של המוגלובין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הדיסק מן הנייר הסופג עם מלקחיים ולהחיל את הדיסק לקלטת בצינור PCR המוכן. אם יש צבע אדום נשאר על המסנן להוסיף 50-100 μl של חיץ לשטוף כדי להסיר את המסנן לפני הצבת בצינור. הערה: לעתים רחוקות, לחץ עודף מיושם במהלך הכנתמודולי FINA תוצאות החלוקות של השכבות הממברנה במהלך ההיפרדות מן הנייר הסופג. בטל הדיסקים האלה ולהכין מדגם טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסינון ממוקם בצינור PCR, לנתח דגימות מיד. לחלופין, לילה יבש בתוך יבוש סידן גופרתי המכיל תיבת, ולאחר מכן מכסה ומכניסים שקיק רדיד עם יבוש סיליקה ולאחסן עד מוכן לניתוח. </li></ol> 5. התגובה qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 100 μl תערובת אמן qPCR לכל תגובה באמצעות HIV פריימרים ו בדיקות ספציפיים כפי שתואר לעיל 9,11. כלול פקד הגברה פנימי כדי לפקח על הנוכחות של מעכבי הגברה כדי לוודא מדגם שלילי הוא שלילי נכון. הקפד כי מסנן מכוסה כולו תערובת אמן וכי מסנן נשאר קבוע לצד של צינור לאורך כל התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הגברה באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת כפי שתואר לעיל 9. </li></ol>

<ol><li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li>
<li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Paper+Machine%22+for+Molecular+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li>
<li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world%3B+an+example+of+microfluidic+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li>
<li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+molecular+diagnostic+for%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li>
<li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-Based+RNA+Extraction%2C+in+Situ+Isothermal+Amplification%2C+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost%2C+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+%28H1N1%29+from+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li>
<li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+%28STIs%29%3A+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).</li>
<li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+the+developing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li>
<li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li>
<li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li>
<li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).</li>
<li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li>
<li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li>
<li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-PCR+processing%3A+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
<li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).</li>
<li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization%22">World Health Organization</a>. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).</li>
<li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+Med+J%22%5BJournal%5D)">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עיד צמוד גישת טיפול מהירה הודגם להפחית תמותת תינוקות עקב זיהום HIV 16. בגלל ההתמדה של נוגדנים אימהיים בתוך הדם של תינוק, בדיקות נוגדנים מהירות HIV יש שימושיות מוגבלת בקביעת מעמדם של תינוקות שנחשפו HIV. ארגון הבריאות העולמי ממליצה כי כל התינוקות שנולדו ל- HIV-1 אמהות חיוביות צריכים להיבדק בבית 4-6 שבועות של גיל, באמצעות מבחן Virological 17. דיווחנו לפיתוח assay לאיתור לכמת DNA proviral HIV-1 בדגימות דם מלאות כי הוא מסוגל איתור עותק יחיד ברגישות 100% הפגינה וספ...

מספר דיווחים דנו בפיתוח שיטות חילוץ נייר או מבוסס קרום לשימוש Point-of-care (POC) התקנים 1-5 במטרה עושה את הרגישות וסגולית המעודנות של אבחון מולקולרי זמינה לכל. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מחלות המועברות במגע מיני יוזמת אבחון טבע את מונח בטיח (משתלמים, רגישים, ספציפית, ידידותי למשתמש, ראפיד וחזק, ציוד ללא ונמסר מי צריכים את זה) כדי לתאר את המאפיינים האידיאליים של POC מבחן 6. הנחיות אלה, המאפיין ללא ציוד מאתגר במיוחד להשגה לאבחון מולקולרי. עם זאת, כל חידוש בתחום יקדם את המטרה להגיע אלה ברוב הצורך, ויש תקווה לשיפורים לטווח קרוב בביצועי בדיקה על ידי התאמת טכנולוגית 7 קיימים. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לחילוץ דנ&quot;א מהדם כולושאינו דורש מכשור כימיה או מעבדה מורכבת. FINA (בידוד סינון של חומצות גרעין) שיטת הכנת המדגם פותחה במקור כדי לחלץ DNA לויקוציטים מהדם כולו כדי לזהות את provirus HIV-1 כחלק מדגם עד למענה Point-of-care (POC) PCR כמותי (qPCR) מוקדם התינוק אבחון (עיד) פלטפורמה לשימוש הגדרות משאב מוגבל 8-11. מיצוי FINA נבדל שיטות טיהור קונבנציונליות המשתמשות ממברנות סיליקה או חלקיקים פאראמגנטיים מצופית סיליקה לאגד DNA הפיך בנוכחות סוכני chaotropic 12. במקום זאת, FINA משתמש סינון אנכי דרך קרום הפרדה לחלץ DNA התאי מהדם כולו ישירות. קרום המכיל את DNA בפח יכול להיות ממוקם ישירות בתוך שפופרת PCR ואו מיד בשימוש תגובת PCR או מיובש באוויר הגברה מאוחר יותר 9. אין סביבות chaotropic, פנול, או כהלים משמשים החילוץ המדגם, eliminaטינג שלבי הכביסה הנרחבים צורך להסיר מעכבי qPCR חזקים נגזרו תהליך החילוץ 13,14. קרום FINA יכול ללכוד או תאים 9 או הדנ&quot;א הגנומי ששוחררו על ידי תמוגה תא 11 לפני הדגימה מתווספת הממברנה. עבור ללכוד תאים, דם מלא מתווסף ישירות הממברנה. התאים לאחר מכן הם lysed בקרום ידי הוספת 10 מ&quot;מ NaOH. היתרון בשיטה זו הוא שהיא כוללת רק 3 שלבים: 1) בנוסף מדגם; 2) תמוגה תא / לשטוף 3) מיקום הדיסק מסנן בצינור qPCR. החיסרון בשיטה זו הוא כי קרום יכול להכיל רק מספר מוגדר של תאים ביחס ישר לקוטר של הדיסק הממברנה. כדי להגיע לגבול של זיהוי הנדרש עיד, 100 μl של דם מלא נדרש קלט מדגם הכרוך מסנן כי הוא גדול מדי כדי להיות ממוקם בתוך צינור qPCR. Lysing בתאי הדם עם חומר ניקוי לפני הוספת מדגם לאיסוףקרום מוסיף צעד עיבוד, אך מאפשר שימוש במסנן קטן מאותן גודל המדגם. הצלחנו להוכיח שחזור גבוה, זיהוי עותק יחיד, וכימות קטנה כמו 10 עותקים של דנ&quot;א proviral HIV-1 מ 100 μl של דם באמצעות בדיקה זו תצורה 11. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את פרוטוקול FINA כפי שפותח במקור לשימוש במעבדה. הקרום / מסנן הכריך המכונה מודול הכנת מדגם FINA אפשר להכין סדרות המוניות שנאגר לשימוש מאוחר יותר. כאשר דגימות הן להיעקר תהליך זה לוקח 2 דקות והוא יכול להתבצע משתנה קבוצות גודל. QPCR ניתן להפעיל באופן מיידי או מסננים המכילים את ה- DNA מוטבע ניתן לאחסן עד שהוא נוח לבצע qPCR. שיטה זו נוחה מאוד עבור ניתוח שיגרתי של דגימות בשתי הגדרות משאב נמוכות וגבוהות.

<table><tbody><tr><td>Fusion 5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>8151-9915</td><td></td></tr><tr><td>707 כרית ספיגה</td><td>VWR International</td><td>28298-014</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M</td><td>VWR</td><td>INTERNATIONAL 52858-000</td><td></td></tr><tr><td>3M סרט אבחון פוליאסטר מצופה כפול&nbsp;</td><td>3M התמחויות רפואיות</td><td>9965</td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; l צינורות רצועות qPCR</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>מכסי רצועה אופטית</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005p qPCR מערכת</td><td>Agilent</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>221465</td><td>A.C.S. מגיב</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9284</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td>לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך, ממוצא אמריקאי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>ניקוב חור קטן מונע פטיש קוטר חור 3/16 אינץ' (5.1 מ"מ)</td> <td>McMaster Carr</td><td>3424A16</td><td></td></tr><tr><td>ניקוב חור קטן מונע פטיש קוטר חור 1/4 אינץ' (7.14 מ"מ)</td> <td>McMaster Carr</td><td>3424A19</td><td></td></tr><tr><td>ניקוב חור קטן מונע פטיש קוטר חור 5/16 אינץ' (8.35 מ"מ)</td> <td>מקמאסטר קאר</td><td>3424A23</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת dna פשוטה ומהירה

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, סינון בידוד של חומצות גרעין, היא שיטת חילוץ רומן אשר מנצלת סינון אנכי דרך קרום פרדת כרית ספיגה לחלץ DNA תאי מדם כולו בתוך פחות מ -2 דקות. דגימת דם מטופל עם חומר ניקוי, בקצרה מעורבים ויישומים ידי pipet קרום ההפרדה. את lysate פתילות לתוך הנייר הסופג בשל פעולה נימי, ללכוד את הדנ&quot;א הגנומי על פני השטח של קרום ההפרדה. ה- DNA החילוץ נשמר על הממברנה במהלך שלב לשטוף פשוט שבו מעכבי PCR הם רשעים לתוך הנייר הסופג הסופג. הקרום המכיל את DNA בפח הוא הוסיף אז אל תגובת PCR ללא טיהור נוספת. שיטה פשוטה זו אינה דורשת ציוד מעבדה והוא יכול להיות מיושם בקלות עם ציוד מעבדה יקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור זיהוי רגיש מאוד לכמת DNA proviral HIV-1 מ 100 μl כולו דם כמודל מוקדםאבחון פאנט של HIV שיכול להתאים בקלות ליעדים גנטיים אחרים.

זרימת העבודה לחילוץ דנ&quot;א proviral מהדם כולו ומשובץ תאים 8e5-LAV מוצג באיור 1. איור 2 מציג את מודול מדגם FINA והכינו צינור qPCR. שיטה זו מאפשרת הגברה יעילה של provirus HIV-1 מתאי 8e5-LAV במספרי עותק שונים, כפי שמוצגת עקומת התקן של דגימות מאולצות (איור 3). PCR היה יעיל של 103%, כפי שנמדד יעיל = -1 + 10 (-1 / שיפוע). המשוואה של הקו היה y = -3.25x + 27.95, עם מתאם של R² = 0.996. עקומת ת...

אנו מתארים כאן שיטה להפקת DNA פשוטה ומהירה מבוססי נייר של HIV proviral דנ&quot;א שלם דם זוהה על ידי PCR כמותי. פרוטוקול זה יכול להתארך לשימוש באיתור סמנים גנטיים אחרים או בשיטות הגברה חלופיות.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

המטרה הכללית של שיטת FINA, שהיא ראשי תיבות של filtration isolation of nucleic acids (בידוד חומצות גרעיניות באמצעות סינון), היא לבודד DNA גנומי להגברה ב-PCR מדגימות מורכבות באופן מהיר ופשוט, ללא שימוש בציוד מעבדה כגון צנטריפוגה. שיטה מהירה זו להפקת DNA מבוססת נייר עבור DNA פרו-ויראלי של HIV פותחה לצורך שילוב במכשיר אבחוני של PCR כמותי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להכין מראש את מודולי הכנת הדגימה ואת מבחנות ה-PCR, כך שתהליך הפקת ה-DNA ארך פחות משתי דקות.פיתחנו תחילה שיטה זו כדי לשלב אותה בדגימה עבור בדיקה לאבחון מוקדם של HIV-1 בתינוקות באמצעות דם מדגימת עקב. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להיתקל בקשיים, כיוון שהסרת הגב של הסרט ההדבקה הדו-צדדי המחזיק את ממברנת לכידת התאים לדופן מבחנת ה-PCR דורשת תרגול. את הפרוצדורה תדגים ג'ן ריד, טכנאית בכירה מהמעבדה שלי.התחילו את הפרוצדורה בהכנת החומרים הדרושים להרכבת מודול הכנת הדגימות של ה-FINA. הכינו את פד הספיגה על ידי גזירת ריבוע של 35 על 35 מילימטר מפד 100% כותנה בעובי 2.6 מילימטר. הכינו סרט פראפין פלסטי עם סרט גיבוי נייר.גזרו פיסה של 25 על 50 mm של סרט פראפין, ולאחר מכן השתמשו בפטיש כדי להשקיע חור בקוטר 7.14 mm במרכז הסרט. הכינו ממברנת הפרדת דם מזכוכית קשורה או דיסק לכידה באמצעות פטיש להשקעת עיגול בקוטר 8.35 mm. כדי להרכיב את מודול הכנת הדגימה של ה-FINA, השתמשו בפינצטה כדי להניח את דיסק הלכידה במרכז רפידת הבלוטינג.הסר את גב סרט הפרפין והנח אותו על דיסק הלכידה כך שכל סרט הפרפין ישאיר את מרכז דיסק הלכידה חשוף. הבטח מגע מרבי בין הדיסק לבין פד הבלוטינג (blotting pad) על ידי מתיחה קלה של סרט הפרפין כדי שיכסה את פד הבלוטינג, ולחיצה חזקה של סרט הפרפין כדי להדביקו לפד הבלוטינג מסביב לכל קצוות הדיסק. נדרש דיסק סרט של 5.1 mm כדי לעגן את ממברנת הלכידה לדופן מבחנת ה-qPCR, כדי למנוע מהממברנה לחסום את זיהוי הפלואורסצנציה של מכשיר ה-real time PCR.הכינו את דיסקית הסרט באמצעות פטיש כדי להנקיש עיגול של סרט אבחון מפוליאסטר בעל ציפוי כפול מתוך גיליון סרט. הסִירו בעזרת פינצטה צד אחד של שכבת ההדבקה של הסרט. הניחו את הסרט לתוך מבחנה ל-PCR של 200 microliter, והדביקו אותו לדופן אחת לכיוון תחתית המבחנה.הסר את כיסוי המדבקה השני. השפופרת מוכנה כעת לקבלת הדיסק שהוכן. בסרטון זה יודגם זיהוי של DNA פרו-ויראלי מדם מלא שהועשרו ב-8e5 תאי LAV.הפשיתו על קרח את משקעי תאי ה-LAV (בכמות של 8e5) שהוקפאו קודם לכן. הכינו דילול סדרתי של התאים במדיום הקפאה בריכוזים הנעים בין 1 ל-400 תאים למיקרוליטר. העבירו באמצעות פיפטה 10 microliters של תאים מכל אחד מהדילולים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה.הוסף 100 µL של דגימת דם מלאה טרייה, שלילית ל-HIV-1 ומטופלת ב-eDTA, לכל מבחנה כדי ליצור עקום סטנדרטי. ערבב על ידי נקישה עדינה של תחתית המבחנה חמש פעמים. כדי להתחיל את הליך מיצוי ה-DNA, בצע ליזה של תאי הדם על ידי הוספת triton X-100 לריכוז סופי של 1%.ערבבו על ידי נקישה עדינה חמש פעמים בתחתית המבחנה. הדם אמור להפוך לאדום שקוף. העבירו בפיפט את כל דגימת הדם אל דיסקי הלכידה.איטום אטום למים בין סרט הפראפין לממברנת הלכידה מבטיח שהדם יזרום דרך הממברנה. מגע טוב בין ממברנת המגע למכלול פדי הספיגה מבטיח ספיגה מהירה של הדגימה. יש להמתין עד שהדגימה תיספג דרך המסנן.ליזאט הדם נספג בדיסק הלכידה והדיסק נראה מט. הוסיפו בטיפות 600 עד 1,000 µL של 10 mmol סודיום הידרוקסיד על דיסק הלכידה. המסנן ישנה את צבעו מאדום ללבן, מה שמעיד על פינוי ההמוגלובין.כעת הפרידו את הדיסקה מרפידת הבלוטינג והניחו את הדיסקה על הסרט בתוך מבחנת ה-PCR שהוכנה. לאחר הנחת המסנן במבחנת ה-PCR, נתחו את הדגימה באופן מיידי. הכינו את תערובת ה-qPCR master mix כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול, וודאו שהמסנן מכוסה לחלוטין ב-master mix ושנשאר מקובע לדופן המבחנה לאורך כל התגובה.בצעו הגברה באמצעות מכשיר real time PCR כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול. לחלופין, אם לא ניתן לבצע qPCR באופן מיידי, ייבשו את המסנן למשך לילה בקופסה המכילה חומר מייבש מסוג calcium sulfate. למחרת, סגרו את שפופרת ה-PCR במכסה והניחו אותה בשקית אלומיניום עם חומר מייבש מסוג silica, ואחסנו בטמפרטורת החדר עד למועד הניתוח.שיטה זו מאפשרת הגברה יעילה של פרו-וירוס HIV-1 מ-8e5 LAV תאים במספרי עותקים שונים. הקווים הרצופים הם גרפי הגברה שהתקבלו מארבע חזרות של דם מלא שלילי ל-HIV-1 שבו הונוספו 4,000, 400, 40 ו-10 של 8e5 LAV תאים, עם 500 עותקים של הבקרה הפנימית לכל תגובה. הקו המקווקו מציין את סף הגילוי.הגרף הבא מציג עקומות סטנדרט של ערכי מחזור כמות (quantitation cycle values) שחושבו מגרף ההגברה לעומת לוג של מספר עותקים של 8e5 תאי LAV ל-100 microliters של דם מלא. יעילות ה-PCR שחושבה הייתה 103%. החזרות של עקומת הסטנדרט ל-DNA פרו-ויראלי של HIV מראות אף הן הגברה בעלת הדירות גבוהה.בנוסף, נוכחות של בקרת פנימית של 500 עותקים של hydroxy pyruvate reductase מראה כי אין עיכוב של ה-PCR כתוצאה מהפקת דם בשיטה זו, ללא קשר למספר העותקים של HIV-1 provirus הנוכחים. הקווים הרצופים מייצגים את גרפי ההגברה והקו המקווקו מייצג את הסף. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להגביר מטרות PCR מסוגים שונים של דגימות כדי לזהות את הגן המבוקש.לדוגמה, swabs מהלחי לסריקה פרמקוגנטית או דם לטיפוס גנטי (genotyping) מהיר של מודלים של בעלי חיים. זכרו שעבודה עם פתוגנים המועברים בדם עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות אוניברסליים בעת ביצוע הליך זה.

filtration-isolation-nucleic-acids-simple-rapid-dna-extraction

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כלי ו chemistries מתוארים ברצף כדי לבודד חומצות גרעין ואחריו חלבונים ממדגם ללא צורך בחשמל. כלי מורכב sorbent שנערך בתוך פיפטה העברת בעוד chemistries בידוד מבוססים על עקרונות מוצק בשלב החילוץ. מקרומולקולות את בודדים ניתן לנתח על ידי מבחני חיסונית מבוססי PCR מבוסס.

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

אנו מתארים מתודולוגיה לעיבוד דם מלא כדי להשיג מגוון רכיבים להמשך ניתוח. ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול יעיל המאפשר עיבוד מהיר ותפוקה גבוהה בו-זמנית של דגימות דם מלא בסביבה לא קלינית.

פלזמה מהירה ובידוד של מרכיבי דם שלמים בדגימות שהתקבלה מהגדרה מבוססת-קהילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת חומצות גרעין וירוס מהירה מהדם כל וירוס-לא פעיל. החילוץ מתבצע ישירות על צינורות איסוף דם ואינו דורש שום ציוד או חשמל. השיטה אינה תלויה למתקני המעבדה וניתן להשתמש בהם בכל מקום (למשל, בבתי-חולים שדה).

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

בידוד גרעיני בודד מסתמך על חדירות הדיסוציאציה וחומרי הניקוי המבוססים על קרום התא, צעדים הזקוקים לאופטימיזציה ונוטים להציג חפצים טכניים. אנו מדגימים כביסה ופרוטוקול ללא אנזים לבידוד מהיר של גרעינים שלמים ישירות מרקמות שלמות, מניב גרעינים מתאים לגרעין בודד RNA-seq (snRNA-Seq) או ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

המחקר מתאר פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים איכותיים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף RNA של גרעינים בודדים במורד הזרם.

פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים בודדים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף גרעין יחיד

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית 

פרוטוקול זה מתאר שיטה חסכונית להאצת חילוץ DNA מפלסמיד. באמצעות מדפי תלת-ממד מותאמים אישית התואמים לרוטורים סטנדרטיים עם פלטות דלי מתנדנדות, חוקרים יכולים לעבד עד 48 עמודי סיבוב עם פקקים או עד 116 עמודות סיבוב ללא פקקים בו-זמנית, מה שמקצר משמעותית את זמן הטיפול בהשוואה לשיטות מיקרוצנטריפוגה ידניות.

חילוץ DNA בעמודה בקצב בינוני באמצעות מדפי 24 בארות

השימוש במערכות NanoDrop microvolume כחלופות מעשי ויעיל המסורתית מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation מתוארת באמצעות הדגמה של שני פרוטוקולים microvolume quantitation חומצת גרעין.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

תקשורת זה מובאים נתונים על דיוק ועל שחזור של ספקטרופוטומטר UV-VIS BioSpec ננו עבור dsDNA ו quantitation חלבון. אפילו עם כמויות קטנות במיוחד (1 עד 2 ליטר), שחזור מצוין, בעוד פונקציה מנגב אוטומטי משפר את התפוקה ואת התוצאות שריד מינימלי תוצאות מדויקות יותר.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

וידאו זה מדגים את פרוטוקול להפקת דנ"א החומר פורמלין קבוע, פרפין, מוטבע. זהו הליך רב היום שבו חלקים רקמה deparaffinized עם קסילן, rehydrated עם אתנול שטופלו proteinase K לטהר לבודד DNA לצורך ניתוח גנטי ספציפי או הגנום כולו שלאחר מכן.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

למדו את שיטת FINA לבידוד DNA גנומי מדגימות דם מורכבות ללא ציוד מעבדתי. שיטת הנייר המהירה מאפשרת הכנת דגימות בפחות משני דקות לזיהוי HIV באמצעות PCR כמותי.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

גלה סרטונים נוספים