בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

המטרה הכללית של שיטת FINA, שהיא ראשי תיבות של filtration isolation of nucleic acids (בידוד חומצות גרעיניות באמצעות סינון), היא לבודד DNA גנומי להגברה ב-PCR מדגימות מורכבות באופן מהיר ופשוט, ללא שימוש בציוד מעבדה כגון צנטריפוגה. שיטה מהירה זו להפקת DNA מבוססת נייר עבור DNA פרו-ויראלי של HIV פותחה לצורך שילוב במכשיר אבחוני של PCR כמותי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להכין מראש את מודולי הכנת הדגימה ואת מבחנות ה-PCR, כך שתהליך הפקת ה-DNA ארך פחות משתי דקות.

פיתחנו תחילה שיטה זו כדי לשלב אותה בדגימה עבור בדיקה לאבחון מוקדם של HIV-1 בתינוקות באמצעות דם מדגימת עקב. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להיתקל בקשיים, כיוון שהסרת הגב של הסרט ההדבקה הדו-צדדי המחזיק את ממברנת לכידת התאים לדופן מבחנת ה-PCR דורשת תרגול. את הפרוצדורה תדגים ג'ן ריד, טכנאית בכירה מהמעבדה שלי.

התחילו את הפרוצדורה בהכנת החומרים הדרושים להרכבת מודול הכנת הדגימות של ה-FINA. הכינו את פד הספיגה על ידי גזירת ריבוע של 35 על 35 מילימטר מפד 100% כותנה בעובי 2.6 מילימטר. הכינו סרט פראפין פלסטי עם סרט גיבוי נייר.

גזרו פיסה של 25 על 50 mm של סרט פראפין, ולאחר מכן השתמשו בפטיש כדי להשקיע חור בקוטר 7.14 mm במרכז הסרט. הכינו ממברנת הפרדת דם מזכוכית קשורה או דיסק לכידה באמצעות פטיש להשקעת עיגול בקוטר 8.35 mm. כדי להרכיב את מודול הכנת הדגימה של ה-FINA, השתמשו בפינצטה כדי להניח את דיסק הלכידה במרכז רפידת הבלוטינג.

הסר את גב סרט הפרפין והנח אותו על דיסק הלכידה כך שכל סרט הפרפין ישאיר את מרכז דיסק הלכידה חשוף. הבטח מגע מרבי בין הדיסק לבין פד הבלוטינג (blotting pad) על ידי מתיחה קלה של סרט הפרפין כדי שיכסה את פד הבלוטינג, ולחיצה חזקה של סרט הפרפין כדי להדביקו לפד הבלוטינג מסביב לכל קצוות הדיסק. נדרש דיסק סרט של 5.1 mm כדי לעגן את ממברנת הלכידה לדופן מבחנת ה-qPCR, כדי למנוע מהממברנה לחסום את זיהוי הפלואורסצנציה של מכשיר ה-real time PCR.

הכינו את דיסקית הסרט באמצעות פטיש כדי להנקיש עיגול של סרט אבחון מפוליאסטר בעל ציפוי כפול מתוך גיליון סרט. הסִירו בעזרת פינצטה צד אחד של שכבת ההדבקה של הסרט. הניחו את הסרט לתוך מבחנה ל-PCR של 200 microliter, והדביקו אותו לדופן אחת לכיוון תחתית המבחנה.

הסר את כיסוי המדבקה השני. השפופרת מוכנה כעת לקבלת הדיסק שהוכן. בסרטון זה יודגם זיהוי של DNA פרו-ויראלי מדם מלא שהועשרו ב-8e5 תאי LAV.

הפשיתו על קרח את משקעי תאי ה-LAV (בכמות של 8e5) שהוקפאו קודם לכן. הכינו דילול סדרתי של התאים במדיום הקפאה בריכוזים הנעים בין 1 ל-400 תאים למיקרוליטר. העבירו באמצעות פיפטה 10 microliters של תאים מכל אחד מהדילולים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה.

הוסף 100 µL של דגימת דם מלאה טרייה, שלילית ל-HIV-1 ומטופלת ב-eDTA, לכל מבחנה כדי ליצור עקום סטנדרטי. ערבב על ידי נקישה עדינה של תחתית המבחנה חמש פעמים. כדי להתחיל את הליך מיצוי ה-DNA, בצע ליזה של תאי הדם על ידי הוספת triton X-100 לריכוז סופי של 1%.

ערבבו על ידי נקישה עדינה חמש פעמים בתחתית המבחנה. הדם אמור להפוך לאדום שקוף. העבירו בפיפט את כל דגימת הדם אל דיסקי הלכידה.

איטום אטום למים בין סרט הפראפין לממברנת הלכידה מבטיח שהדם יזרום דרך הממברנה. מגע טוב בין ממברנת המגע למכלול פדי הספיגה מבטיח ספיגה מהירה של הדגימה. יש להמתין עד שהדגימה תיספג דרך המסנן.

ליזאט הדם נספג בדיסק הלכידה והדיסק נראה מט. הוסיפו בטיפות 600 עד 1,000 µL של 10 mmol סודיום הידרוקסיד על דיסק הלכידה. המסנן ישנה את צבעו מאדום ללבן, מה שמעיד על פינוי ההמוגלובין.

כעת הפרידו את הדיסקה מרפידת הבלוטינג והניחו את הדיסקה על הסרט בתוך מבחנת ה-PCR שהוכנה. לאחר הנחת המסנן במבחנת ה-PCR, נתחו את הדגימה באופן מיידי. הכינו את תערובת ה-qPCR master mix כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול, וודאו שהמסנן מכוסה לחלוטין ב-master mix ושנשאר מקובע לדופן המבחנה לאורך כל התגובה.

בצעו הגברה באמצעות מכשיר real time PCR כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול. לחלופין, אם לא ניתן לבצע qPCR באופן מיידי, ייבשו את המסנן למשך לילה בקופסה המכילה חומר מייבש מסוג calcium sulfate. למחרת, סגרו את שפופרת ה-PCR במכסה והניחו אותה בשקית אלומיניום עם חומר מייבש מסוג silica, ואחסנו בטמפרטורת החדר עד למועד הניתוח.

שיטה זו מאפשרת הגברה יעילה של פרו-וירוס HIV-1 מ-8e5 LAV תאים במספרי עותקים שונים. הקווים הרצופים הם גרפי הגברה שהתקבלו מארבע חזרות של דם מלא שלילי ל-HIV-1 שבו הונוספו 4,000, 400, 40 ו-10 של 8e5 LAV תאים, עם 500 עותקים של הבקרה הפנימית לכל תגובה. הקו המקווקו מציין את סף הגילוי.

הגרף הבא מציג עקומות סטנדרט של ערכי מחזור כמות (quantitation cycle values) שחושבו מגרף ההגברה לעומת לוג של מספר עותקים של 8e5 תאי LAV ל-100 microliters של דם מלא. יעילות ה-PCR שחושבה הייתה 103%. החזרות של עקומת הסטנדרט ל-DNA פרו-ויראלי של HIV מראות אף הן הגברה בעלת הדירות גבוהה.

בנוסף, נוכחות של בקרת פנימית של 500 עותקים של hydroxy pyruvate reductase מראה כי אין עיכוב של ה-PCR כתוצאה מהפקת דם בשיטה זו, ללא קשר למספר העותקים של HIV-1 provirus הנוכחים. הקווים הרצופים מייצגים את גרפי ההגברה והקו המקווקו מייצג את הסף. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להגביר מטרות PCR מסוגים שונים של דגימות כדי לזהות את הגן המבוקש.

לדוגמה, swabs מהלחי לסריקה פרמקוגנטית או דם לטיפוס גנטי (genotyping) מהיר של מודלים של בעלי חיים. זכרו שעבודה עם פתוגנים המועברים בדם עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות אוניברסליים בעת ביצוע הליך זה.