מדידה במבחנה פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לכימות פעילות ATPase במבחנה. ניתן לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה על סמך רמת הפעילות והדרישות עבור ATPase מטוהר נתון.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את פעילות ה-ATPase במבחנה של חלבונים מטוהרים לאפיון פונקציונלי. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לאפיין ATPases משוערים חדשים, להעריך את המפעילים או המעכבים הפוטנציאליים היעילים ולקבוע את התרומה של תחומים או שאריות מסוימים לפעילות ATPase. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה פשוטה ורגישה למדידת פעילות ATPase במבחנה וניתנת לאופטימיזציה בקלות.

הכן מלאי של כל הריאגנטים הדרושים לדגירה עם חלבון מטוהר לפי ההוראות בפרוטוקול הטקסט. יש לערבב מראש 100 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד ו-100 מילי-מולרי ATP ביחס של אחד לאחד רגע לפני הגדרת תגובת ההידרוליזה של ATP. הכן ותייג צינורות של 1.5 מיליליטר לאיסוף דגימות במרווחי זמן קבועים לאורך כל התגובה.

הכן צינורות לאיסוף דגימות בזמנים אפס וכן בזמנים של 15, 30, 45 ו-60 דקות. הוסף 245 מיקרוליטר של מאגר HNG 1x לכל צינור כדי לדלל את הדגימות שנאספו מתגובות ההידרוליזה של ATP בדילול של 1 עד 50. לאחר מכן, הכינו אמבט של קרח יבש ואתנול להקפאה מהירה של דגימות כדי לעצור את התגובה.

בדלי קרח גומי או במיכל בטוח אחר, הוסיפו כמה חתיכות קרח יבש ושפכו בזהירות מספיק אתנול של 70% עד 100% כדי לכסות את הקרח היבש. מדללים את החלבון המטוהר במאגר 1X HNG ושומרים אותו על קרח. הגדר את תגובות ההידרוליזה של ATP בצינורות המוכנים של 0.5 מיליליטר על ידי הוספת נפח מים מחושב מראש כדי להגיע לנפח תגובה סופי של 30 מיקרוליטר.

ואחריהם שישה מיקרוליטרים של 5X HNG או בופר אחר, שלושה מיקרוליטרים של תערובת ATP מגנזיום כלוריד 100 מילי-מולרית ו-0.25 עד חמישה חלבון מיקרומולרי. לדגור מצב בקרה שלילי בלבד שבו לא מוסיפים חלבון. לאחר מכן, הסר חמישה מיקרוליטר מהתגובה לפעמים אפס.

לאחר מכן יש לדלל את האליקוט אחד ל-50 בשפופרת המוכנה של 1.5 מיליליטר המכילה 245 מיקרוליטר של מאגר HNG. הקפיאו מיד את הדגימה באמבט אתנול קרח יבש. דגירה של תגובות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר להידרוליזה של ATP להתרחש למשך שעה.

בכל מרווח הסר חמישה ליטרים מהתגובה והוסף לצינורות הדגימה המסומנים המכילים מאגר HNG כמו קודם. בתום תגובת ההידרוליזה של ATP, העבירו דגימות מדוללות למקפיא של 80 מעלות צלזיוס לאחסון. כדי להבטיח שכל הדגימות קפואות לחלוטין, המתן לפחות 10 דקות לפני שתמשיך.

הפשירו את הדגימות המדוללות המכילות תגובת הידרוליזה של ATP מכל נקודת זמן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו צלחת של 96 בארות המכילה דגימות ותקני פוספט. בשפופרת של 0.5 מיליליטר יש לדלל את תקן הפוספט מ-800 מיקרו-מולארי ל-40 מיקרו-מולאר על ידי הוספת 5.5 מיקרוליטר מהתקן ל-104.5 מיקרוליטר של מאגר HNG.

מערבבים היטב ומוסיפים 100 מיקרוליטר מתקן פוספט מיקרו-מולרי זה לבאר A1 של צלחת 96 הבארות. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר HNG לבארות B1 עד H1 לדילול סדרתי אחד לאחד של תקן הפוספט. הסר 50 מיקרוליטר של 40 מיקרו-מולרי פוספט מבאר A1, הוסף אותו ל-50 מיקרוליטר של מאגר הבדיקה בבאר B1 וערבב.

לאחר מכן הסר 50 מיקרוליטר מבאר B1 והוסף אותו לבאר C1, והמשך דילול דרך באר G1. השלך 50 מיקרוליטר מבאר G1 לאחר הערבוב כדי להבטיח שלכל באר יהיה אותו נפח. ובכן H1 צריך להכיל רק חיץ כדי ליצור תקן פוספט מ-40 לאפס מיקרומולר. לאחר מכן, הוסף לצלחת 50 מיקרוליטר מכל דגימה בשכפול

הוסף דוגמאות מאותה נקודת זמן בעמודות אנכית ומנקודות זמן שונות אופקית. זה מאפשר עד שמונה דגימות וחמש נקודות זמן לכל צלחת. השתמש בפיפטה סטרילית כדי להסיר מספיק מגיב לזיהוי פוספט מליפטט ירוק מלכיט כדי להוסיף 100 מיקרוליטר לכל אחת מהבארות המכילות דגימות ותקנים.

הוסף את מגיב הזיהוי לצלחת לפיפטינג קל באמצעות פיפטה רב-ערוצית. אין לשפוך את מגיב הזיהוי ישירות לתוך הכלי מכיוון שעלול להתרחש זיהום פוספט. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב זיהוי הפוספט לכל באר וערבב בזהירות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר קבוע של פעמים מבלי להכניס בועות, תוך עבודה לפי הסדר מנקודת הזמן האחרונה לנקודת הזמן הראשונה.

השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות או לפי הוראות היצרן. כדי לכמת את התוצאות, קרא את ספיגת הדגימות ב-650 ננומטר באמצעות קורא מיקרו לוחות ספיגה. מוצגות תוצאות מייצגות של ATPases קינטיים ונקודות קצה, בהן הפעילות של צורות פראיות ומוטנטיות של הפרשה מסוג 2 ATPase/EPSE נקבעת בנוכחות ובהיעדר קרדיוליפין ממריץ.

מוצגות כאן התוצאות של ATPase קינטי מגורה קרדיוליפין, המדגים את שחרור הפוספט הליניארי לאורך זמן עבור EPSE מסוג בר ומוטציה כפולה של ליזין, כאשר אלבומין בסרום בקר משמש כבקרה שלילית. ניתן לייצג נתונים אלה ככמות הפוספט המשתחררת לדקה חלקי ריכוז החלבון על מנת לכמת ולהשוות את פעילות ה-ATPase של כל חלבון. הנתונים מצביעים על כך ששתי שאריות ליזין, K417 ו-K419, תורמות לפעילות ה-ATPase המעוררת קרדיוליפין של EPSE.

השוואה של פעילות ה-ATPase של אותם חלבונים ללא גירוי קרדיוליפין מראה ששני שאריות ליזין אלה אינן תורמות לפעילות הבסיסית הנמוכה של EPSE, אלא ליכולת של החלבון להיות מגורה על ידי קרדיוליפין. לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לכם הבנה טובה כיצד לכמת במהירות ובדייקנות את פעילות ה-ATPase של חלבונים מטוהרים. בעת ניסיון הליך זה חשוב לקחת בחשבון את הרגישות של מגיב זיהוי הפוספט.

כדי למנוע זיהום פוספט, אנו ממליצים להשתמש בכלי פלסטיק חד פעמיים ובמים טהורים במיוחד ולבצע אי הכללת גודל או כרומטוגרפיה של חילופי יונים לאחר טיהור החלבון.