Name: מדידה במבחנה פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: למדו לכמת פעילות ATPase במבחנה לאפיון אנזימטי של חלבונים מטוהרים. שיטה זו מאפשרת הערכת מפעילים או מעכבים פוטנציאליים ומסייעת בפיתוח תרופות ובהבנת תפקידים מטבוליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להכיר במימון ממענק של המכונים הלאומיים לבריאות RO1AI049294 (למ.ס.).

1. בצע תגובת ATP הידרוליזה עם חלבונים מטוהרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מניות של כל ריאגנטים נדרשים דגירה עם חלבונים מטוהרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5x HEPES / NaCl / גליצרול (HNG) מאגר המכיל 100 מ&quot;מ HEPES pH 8.5, 65 mM NaCl, ו -5% גליצרול (או חיץ assay אחרים על פי הצורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 100 מ&quot;מ MgCl 2 (או מתכת אחרת, אם ATPase הוא תלוי מתכת) במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי 100 מ&quot;מ ATP ב 200 מ&quot;מ טריס הבסיס (לא להתאים את pH נוספת) באמצעות ATP טוהר גבוהה. Aliquot ולאחסן את המניה ATP ב -20 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מכמה שבועות, כמו ATP יהיה לשבור לאורך זמן, ולהימנע הקפאה להפשרה מניית ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Premix MgCl 2 ו- ATP ביחס של 1: 1 רק לפני הגדרת התגובה הידרוליזה ATP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תווית 1.5 מ&quot;ל צינורות לאיסוף דגימות במרווחים קבועים לאורך התגובה. הכן צינורות לאיסוף דגימות בשלב 0 ו בשלב 15, 30,45, ו 60 דקות. הערה: כחלופה, לאסוף דגימות רק בזמן 0 ואת נקודת הסיום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ HNG 1x 245 μl על צינור אחד כדי לדלל דגימות שנאספו התגובות הידרוליזה ATP 1:50. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן אמבט קרח אתנול יבשים להקפאת דגימות במהירות כדי לעצור את התגובה. בתוך דלי קרח גומי או בטוחים אחרים (לא פלסטיק) מיכל, להוסיף כמה חתיכות של קרח יבש ובזהירות לשפוך מספיק 70-100% אתנול לכיסוי קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל חלבונים מטוהרים במאגר HNG 1x, על פי הצורך (בדרך כלל 5-10 מיקרומטר), ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התגובות הידרוליזה ATP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 0.5 מ&quot;ל צינורות נפרדים עבור כל דגימה, מוסיפים את ריאגנטים הבאים (לפי הסדר): H 2 O (עד לנפח סופי של 30 μl), 6 μl 5x HNG או חיץ אחר, 3 μl 100 מ&quot;מ MgCl 2 תערובת -ATP, ו 0.25-5 חלבון מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלול תנאי בקרה שלילי חיץ-היחידה שבה אין חלבון הוא הוסיף.</li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 5 μl מן התגובה בזמן 0, לדלל 01:50 בצינור 1.5 מ&quot;ל מוכן המכיל חיץ 245 μl HNG, ומיד להקפיא את הדוגמה באמבט קרח / אתנול יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תגובות ב 37 ° C כדי לאפשר הידרוליזה ATP להתרחש במשך שעה 1. בכל מרווח (15, 30, 45, ו -60 דק &#39;), להסיר 5 aliquots μl מן התגובה ולהוסיף דוגמיות שכותרתו המכיל HNG חיץ כמו בשלב 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף תגובת הידרוליזה ATP, להעביר בדילול דגימות במקפיא -80 מעלות צלזיוס לאחסון. כדי להבטיח את כל דגימות קפואות לחלוטין, להמתין לפחות 10 דקות לפני שתמשיך. </li></ol> 2. דוגמאות דגירה המכילים Pi חינם עם איתור מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה בדילול דגימות המכילות aliquots תגובת הידרוליזה ATP בכל נקודת זמן (המתקבלות צעדים 1.6 ו 1.7) בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת צלחת 96-היטב המכילה דגימות וסטנדרטים פוספט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 0.5 מ&quot;ל tuלהיות, לדלל את רמת פוספט (מסופק עם מגיב זיהוי Pi) מ 800 מיקרומטר עד 40 מיקרומטר על ידי הוספת 5.5 μl של למאגר HNG 800 מיקרומטר רגיל 104.5 μl. מערבבים היטב, ולהוסיף 100 μl של 40 מיקרומטר זה Pi סטנדרטי היטב A1 של צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl HNG חיץ לבארות B1-H1 טוב 1: 1 דילולים סידוריים של תקן Pi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 50 μl של 40 מיקרומטר Pi מבאר A1 ולהוסיף למאגר assay 50 μl ב B1 היטב, לערבב, ולהסיר 50 μl מבאר B1 ולהוסיף גם C1, דילולים ועד ל G1 היטב. מחק 50 μl מבאר G1 לאחר ערבוב כדי להבטיח היטב כל יש את אותו נפח. ובכן H1 צריך להכיל חיץ רק ליצור תקן Pi מן 40 עד 0 מיקרומטר. הערה: אם גורם נוסף (כגון מעכבים) נוסף הדגימות, ליצור עקומת סטנדרט המכילה גורמים לשלוט על שינויים במהדורה פוספט או ספיג בתנאים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של כל sample בשני עותקים לצלחת. להוסיף דוגמאות מאותה נקודת זמן בטורים אנכית (זמן מדגם 1 0 = A2, A3; מדגם 2 זמן 0 = B2, B3) ו בנקודות זמן שונות אופקית. זה מאפשר עד 8 דגימות ו -5 נקודות זמן לכל צלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet סטרילי להסיר מספיק מלכיט מגיב זיהוי Pi ירוק / molybdate להוסיף 100 μl לכל אחד בארות המכיל דגימות ותקנים (מגיב הצורך (מ&quot;ל) = 0.1 x מספר דוגמאות וסטנדרטים) ולהוסיף לצלחת עבור pipetting קל באמצעות pipet הרב ערוצית. אין לשפוך מגיב זיהוי ישירות לתוך התבשיל, כמו זיהום Pi צפוי להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet רב ערוצית, להוסיף 100 μl של מגיב זיהוי Pi היטב כל ומערבבים ידי pipetting למעלה בזהירות למטה מספר עקבי של פעמים ללא בועות מציגות, רצוי בסדר עדיפות מהנקודות בפעם האחרונות לנקודות לראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחת במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר, או על פי maכיוונים של nufacturer. </li></ol> 3. תוצאות לכמת באמצעות קורא microplate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הספיגה של הדגימות ב 650 ננומטר באמצעות קורא microplate ספיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך עקומת סטנדרט Pi. באמצעות תוכנת גרפים, גרף את הערכים הספיגים עבור דגימות תקן Pi לעומת ריכוז כדי למצוא משוואה להשתמש כדי לפתור את כמות הפוספט מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את פעילות ATPase עבור כל דגימה על ידי כיול עם תקן פוספט. פוספט שוחרר = (OD 650 - ליירט Y) / המדרון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע לצרכן הכולל כפילויות של כל דגימה. הפחת את הקריאה הספיגה של שליטת החיץ בלבד ממספר זה. הכפל זאת על ידי גורם לדילול (50 בדוגמה שלנו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את Pi nmol שוחרר לכל חלבון μmol. Graphing ערכים אלה עבור כל נקודת זמן ב assay הקינטית אמור להניב מתאים ליניארי של לפחות R = 0.99 (איור 1); אם not, assay יכול להיות מותאם עם יותר או פחות חלבון או זמן דגירה ארוך או קצר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייצגים את התוצאות כפי nmol Pi / μmol חלבון / min (איורים 2, 3), או כפי nmol Pi / מיקרוגרם חלבון / min אם תרצה בכך. </li></ol>

<ol><li>Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%2B+proteins%3A+have+engine%2C+will+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AAA+ proteins: have engine, will work.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).</li>
<li>Baker, T. A., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP%2C+an+ATP-powered+unfolding+and+protein-degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).</li>
<li>Maxson, M. E., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vacuolar-type+H%2B-ATPase+at+a+glance+-+more+than+a+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump.</a> J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).</li>
<li>Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+genes+for+secretion+NTPases%3A+Identification+of+the+widespread+tadA+subfamily+and+development+of+a+diagnostic+key+for+gene+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).</li>
<li>Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Extracellular+Protein+Secretion+NTPase+EpsE+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae.</a> J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).</li>
<li>Camberg, J. L., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+Vibrio+cholerae+type+II+secretion+ATPase+EpsE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE.</a> J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).</li>
<li>Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+secretion+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Type II secretion and pathogenesis.</a> Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+Real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+An+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation.</a> J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+kinetic+analysis+of+the+intracellular+domain+of+human+protein+tyrosine+phosphatase+%CE%B2+%28HPTP+%CE%B2%29+using+synthetic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides.</a> Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).</li>
<li>Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+stimulation+of+EpsE+ATP+hydrolysis+by+EpsL+and+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids.</a> EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).</li>
<li>McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+weak+ATPase+activity+of+human+Hsp90+by+a+client+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein.</a> J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).</li>
<li>Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XpsE+oligomerization+triggered+by+ATP+binding%2C+not+hydrolysis%2C+leads+to+its+association+with+XpsL%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL.</a> EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).</li>
<li>Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+flagellar+ATPase+motor+shows+ATP-dependent+hexameric+assembly+and+activity+stimulation+by+specific+lipid+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding.</a> Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Savvides, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirB11+ATPases+are+dynamic+hexameric+assemblies%3A+new+insights+into+bacterial+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion.</a> EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).</li>
<li>Sanghera, J., Li, R., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+luminescent+ADP-Glo+assay+to+a+standard+radiometric+assay+for+measurement+of+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Techn%22%5BJournal%5D)">Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity.</a> Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).</li>
<li>Sherman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+catalytic+activity+from+biological+function+of+the+ATPase+that+powers+lipopolysaccharide+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cofactor+regulation+with+disease-associated+p97%2FVCP+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).</li>
<li>Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

זהו פרוטוקול כללי למדידת בפעילות ATPase במבחנה של חלבונים מטוהרים לאפיון ביוכימיים. שיטה זו מותאמת במיוחד בקלות; למשל, התאמת כמות חלבון, חיץ ויצירות מלח, טמפרטורה, וגיוון האורך ומרווחי assay (כולל הגדלת המספר הכולל של מרווחים) יכול לשפר quantitation פעילות. זמין מסחרי ריאגנטים ירוק מבוססת מלכיט רגיש מאוד, והוא יכול לזהות כמויות קטנות של פוספט חינם (~ 50 pmol ב 100 μl). בשל הרגישות של assay זה, חשוב להשתמש כלי פלסטיק חד פעמיים, מי ultrapure, מאגרים, ריאגנטים נטולי...

ATPases הם אנזימים אינטגרליים בתהליכים רבים בכל ממלכות החיים. ATPases פועלים כמנועים מולקולריים המשתמשים באנרגיה של הידרוליזה של ATP כדי להניע תגובות מגוונות כמו סחר בחלבונים, התפתחות והרכבה; שכפול ושעתוק; חילוף חומרים תאי; תנועת שרירים; תנועתיות תאים; ושאיבת יונים1-3. חלק מה-ATPases הם חלבונים טרנסממברניים המעורבים בהובלת מומסים על פני ממברנות, אחרים הם ציטופלזמיים ועשויים להיות קשורים לממברנה ביולוגית כגון קרום הפלזמה או אלה של אברונים.
AAA+ ATPases (ATPases הקשורים לפעילויות תאיות שונות) מהווים קבוצה גדולה של ATPases החולקים רצף ושימור מבני מסוים. חלבונים אלה מכילים מוטיבים משומרים של קשירת נוקלאוטידים כגון קופסאות Walker-A ו-B ויוצרים אוליגומרים (בדרך כלל הקסמרים) במצבםהפעיל 1. שינויים קונפורמטיביים גדולים בחלבונים אלה בעת קשירת נוקלאוטידים אופיינו בקרב חברים מגוונים במשפחת AAA+. EpsE הוא AAA+ ATPase וחבר בתת-משפחת הפרשת החיידקים מסוג II/IV של NTPases4-6. EpsE מפעיל הפרשה מסוג II (T2S) ב-Vibrio cholerae, הגורם לכולרה. מערכת T2S אחראית להפרשת מגוון רחב של חלבונים, כגון רעלן כולרה גורם האלימות הגורם לשלשול מימי רב כאשר V. cholerae מתיישב במעי הדק האנושי7. 
טכניקות לכימות פעילות ATPase במבחנה מגוונות, אך בדרך כלל מודדים שחרור פוספט באמצעות מצעים קולורימטריים, פלואורסצנטיים או רדיואקטיביים8-11. אנו מתארים שיטה בסיסית לקביעת פעילות ATPase במבחנה של חלבונים מטוהרים באמצעות בדיקה קולורימטרית המבוססת על מצע ירוק מלכיט זמין מסחרית המודד פוספט אנאורגני משוחרר (Pi). ב-pH נמוך, מוליבדט ירוק מלכיט יוצר קומפלקס עם Pi וניתן למדוד את רמת היווצרות הקומפלקס ב-650 ננומטר. בדיקה פשוטה ורגישה זו עשויה לשמש לאפיון פונקציונלי של ATPases חדשים ולהערכת התפקידים של מפעילים או מעכבים פוטנציאליים, כדי לקבוע את החשיבות של תחומים ו/או שאריות ספציפיות, או כדי להעריך את ההשפעה של טיפולים מסוימים על פעילות אנזימטית.

<table><tbody><tr><td>מאגר HEPES</td><td>פישר</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>פישר</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין טריפוספט (ATP)</td> <td>פישר</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות (שקופות, תחתית שטוחה)</td> <td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life מדעים</td><td>BML-AK111</td><td>מגיב מועדף לזיהוי פוספט. אזהרה: גורם לגירוי.</td></tr><tr><td>קורא</td><td></td><td></td> Microplate <td>BioTek Synergy או</td></tr><tr><td>תוכנת</td><td></td><td></td> <td>Prism 5</td> GraphPad</tr> מקבילה</tbody></table>

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות atpase עבור אנזימתי אפיון

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

אנזימים אדנוזין hydrolyzing-אדנוזין, או ATPases, לשחק תפקיד קריטי במגוון תחומי פעילות התאים. חלבונים דינמיים אלה יכולים לייצר אנרגיה לעבודה מכאנית, כגון סחר חלבון ושפלה, תחבורה מומסת, ותנועות הסלולר. הפרוטוקול המתואר כאן הוא assay בסיסי למדידת הפעילות חוץ גופייה של ATPases המטוהר עבור אפיון פונקציונלי. חלבונים hydrolyze ATP בתגובה כי התוצאות שחרור פוספטים אנאורגניים, ואת כמות פוספט שוחררה לאחר מכן ונרשמת באמצעות assay colorimetric. ניתן להתאים מאוד זה פרוטוקול להתאמה כדי למדוד את פעילות ATPase מבחני קינטית או נקודת הסיום. פרוטוקול נציג מסופק כאן מבוסס על פעילות ודרישות של EpsE אא&quot;א + ATPase מעורב Type II הפרשת ב החיידק Vibrio cholerae. כמות החלבון מטוהר צורך למדוד פעילות, האורך של assay ואת העיתוי מספר saבמרווחי mpling, חיץ רכב מלח, טמפרטורה, שיתוף גורמים, ממריצים (אם בכלל), וכו &#39;עשוי להשתנות מאלו המתוארים כאן, וכך כמה אופטימיזציה עשוי להיות נחוץ. פרוטוקול זה מספק מסגרת בסיסית ATPases המאפיינת וניתן לבצעו במהירות להתאים בקלות במידת הצורך.

פעילות חוץ גופית של EpsE T2S ATPase יכול להיות מגורה על ידי copurification של EpsE עם תחום cytoplasmic של EpsL (EpsE-cytoEpsL) ותוספת של cardiolipin פוספוליפידים חומצי 12. כמו כן ניתן לקבוע את התפקיד של שאריות EpsE מסוימות הידרוליזה ATP על ידי השוואת פעילות של סוג בר (WT) כדי הגירסות שונות של החלבון באמצעות assay. הנה, את ההשפעה של החלפת שתי שאריות ליזין בתחום אבץ מחייב EpsE נמדדת על ידי השוואת פעילות ATPase של מטוהרים WT EpsE-c...

אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לכימות פעילות ATPase במבחנה. ניתן לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה על סמך רמת הפעילות והדרישות עבור ATPase מטוהר נתון.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת את פעילות ה-ATPase in vitro של חלבונים מופקים לצורך אפיון תפקודי. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לאפיין ATPases משוערים חדשים, להעריך אקטיבטורים או מעכבים פוטנציאליים יעילים, ולקבוע את תרומתם של דומיינים או שאריות ספציפיות לפעילות ה-ATPase. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה שיטה פשוטה ורגישה למדידת פעילות ATPase in vitro וניתנת לאופטימיזציה בקלות.הכינו תמיסות סטוק של כל הריאגנטים הדרושים לדגירה עם חלבון מומצא, כפי שהודרך בפרוטוקול הכתוב. ערבב מראש 100 millimolar magnesium chloride ו-100 millimolar ATP ביחס של אחד לאחד רגע לפני הקמת תגובת ה-ATP hydrolysis. הכינו וסמנו מבחנות של 1.5 milliliter לאיסוף דגימות במרווחי זמן קבועים לאורך התגובה.הכינו מבחנות לאיסוף דגימות בזמן אפס וכן בזמנים של 15, 30, 45 ו-60 דקות. הוסיפו 245 µL של 1x HNG buffer לכל מבחנה כדי לדלל את הדגימות שנאספו מתגובות הידרוליזת ATP בדילול של 1 ל-50. לאחר מכן, הכינו אמבטיה של קרח יבש ואתנול להקפאה מהירה של הדגימות כדי לעצור את התגובה.בתוך דלי קרח מגומי או במכל בטוח אחר, הוסיפו מספר חתיכות של קרח יבש ושפכו בזהירות כמות מספיקה של אתנול בריכוז 70% עד 100% כדי לכסות את הקרח היבש. דללו את החלבון המטוהר בבופר 1X HNG ושמרו אותו על קרח. הכינו את תגובות הידרוליזת ה-ATP בתוך מבחנות של 0.5 מיליליטר שהוכנו מראש, על ידי הוספת נפח מחושב של מים כדי להגיע לנפח תגובה סופי של 30 microliters.לאחר מכן, הוסיפו 6 µL של 5X HNG או באפר אחר, 3 µL של תערובת magnesium chloride ATP בריכוז 100 mM ו-0.25 עד 5 µM חלבון. דגרו ביקורת שלילית עם באפר בלבד, שבה לא מתווסף חלבון. לאחר מכן, הסירו 5 µL מהתגובה בזמן אפס.לאחר מכן, דללו את המדגם ביחס של 1 ל-50 בתוך מבחנה של 1.5 מ"ל שהוכנה ומכילה 245 µL של HNG buffer. הקפיאו מיד את המדגם באמבטיית אתנול בקרח יבש. דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת כדי לאפשר את הידרוליזת ה-ATP.בכל מרווח זמן, הוצאו מנות של 5 µL מהתגובה והוסיפו אותן לשפורי דגימה מסומנים המכילים HNG buffer, כפי שבוצע קודם לכן. בסיום תגובת הידרוליזת ה-ATP, העבירו את הדגימות המדוללות למקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לאחסון. כדי להבטיח שכל הדגימות קפואות לחלוטין, המתינו לפחות 10 דקות לפני ההמשך.הפשיר בטמפרטורת החדר את הדגימות המדוללות המכילות מנות (aliquots) של תגובת הידרוליזה של ATP מכל נקודת זמן. לאחר מכן, הכן פלטת 96 בארות המכילה דגימות ותקני פוספט. בשפופרת של 0.5 milliliter דלל את תקן הפוספט מ-800 micromolar ל-40 micromolar על ידי הוספת 5.5 microliters של התקן ל-104.5 microliters של HNG buffer.ערבבו היטב והוסיפו 100 µL של סטנדרט פוספט זה בריכוז 40 µM לבאר A1 של לוחית 96 הבארים. הוסיפו 50 µL של HNG buffer לבארים B1 עד H1 לצורך ביצוע מהלולי דילולים של סטנדרט הפוספט ביחס של 1:1. העבירו 50 µL של פוספט בריכוז 40 µM מבאר A1, הוסיפו אותם ל-50 µL של assay buffer שבבאר B1 וערבבו.לאחר מכן, העבירו 50 µL מבאר B1 לבאר C1, והמשיכו בביצוע הדילול עד לבאר G1. השליכו 50 µL מבאר G1 לאחר הערבוב כדי להבטיח שבכל באר יהיה נפח זהה. באר H1 צריכה להכיל רק בופר כדי ליצור סטנדרט פוספט מ-40 ועד אפס µM. לאחר מכן, הוסיפו לפלטה 50 µL מכל דגימה בשניחולים.הוסיפו דגימות מאותה נקודת זמן בעמודות בצורה אנכית, ודגימות מנקודות זמן שונות בצורה אופקית. הדבר מאפשר עד שמונה דגימות וחמש נקודות זמן לכל פלטה. השתמשו בפיפטה סטרילית כדי להוציא כמות מספקת של ריאגנט גילוי malachite green meliptate phosphate ולהוסיף 100 µL לכל אחד מהבארים המכילים דגימות ותקנים.הוסיפו את ריאגנט הגילוי לצלוחית כדי לאפשר שאיבה נוחה באמצעות פיפט רב-ערוצי. אין למזוג את ריאגנט הגילוי ישירות אל הצלוחית, שכן הדבר עלול להוביל לזיהום בפוספטים. באמצעות פיפט רב-ערוצי, הוסיפו 100 µL של ריאגנט גילוי הפוספט לכל באר וערבבו בזהירות על ידי שאיבה ושחרור חוזר מספר פעמים קבוע ללא יצירת בועות, תוך עבודה לפי הסדר מהנקודת זמן האחרונה לנקודת הזמן הראשונה.השאירו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות או בהתאם להוראות היצרן. כדי לכמת את התוצאות, קראו את הבליעה של הדגימות ב-650 nanometers באמצעות קורא מיקרו-פלטות לבליעה. מוצגות תוצאות מייצגות של ATPases קינטיות ושל נקודת סוף, שבהן נקבעה הפעילות של צורות הפרא (wild type) וצורות מוטנטיות של ה-ATPase/EPSE של הפרשה מסוג שני, בנוכחות ובהיעדר קארדיולפין מעורר.כאן מוצגות התוצאות של ATPase מואץ על ידי קרדיולפין בקינטיקה, המדגימות שחרור ליניארי של פוספט לאורך זמן עבור EPSE מסוג פראי (wild type) ומוטציה כפולה של ליזין, כאשר albumin של סרום בקר משמש כביקורת שלילית. נתונים אלה ניתן להציג ככמות הפוספט ששוחררה לדקה חלקי ריכוז החלבון, במטרה לכמת ולהשוות את פעילות ה-ATPase של כל חלבון. הנתונים מעידים כי שתי שארי ליזין, K417 ו-K419, תורמות לפעילות ה-ATPase של EPSE המואצת על ידי קרדיולפין.השוואה של פעילות ה-ATPase של אותם חלבונים ללא גרייה של קרדיולפין מראה כי שני שאריות הליזין הללו אינן תורמות לפעילות הבסיסית הנמוכה של EPSE, אלא ליכולתו של החלבון להיות מגורה על ידי קרדיולפין. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת במהירות ובדיוק את פעילות ה-ATPase של חלבונים מופרדים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להתחשב ברגישות של ריאגנט גילוי הפוספט.כדי למנוע זיהום פוספט, אנו ממליצים להשתמש בכלי פלסטיק חד-פעמיים ובמים אולטרה-טהורים, ולבצע כרומטוגרפיית החרגה לפי גודל (size exclusion chromatography) או כרומטוגרפיית חילוף יונים לאחר טיהור החלבון.

measuring-in-vitro-atpase-activity-for-enzymatic-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה להגדרה של פעילות קינאז אצטט מתואר. Assay זה מנצל תגובה ישירה לקביעת פעילות האנזים ועל קינטיקה של קינאז אצטט בכיוון אצטט יוצרי עם acceptors phosphoryl שונים. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מנוצל עבור assaying פוספט אצטיל אחרים או אצטיל-CoA אנזימים ניצול.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

את ההשפעות של הפעלה של קינאז isozymes חלבון C (PKC) על תפקוד המיטוכונדריה קשורים בנשימה וזרחון חמצונים ועל כדאיויות תא מתוארות. הגישה מסתגלת טכניקת adenoviral סלקטיבי overexpress isozymes PKC בתרבית תאים ראשוניים ומגוון של מבחנים כדי לקבוע פונקציות המיטוכונדריה ומצב אנרגיה של התא.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

סרטון זה מדגים בדיקת אנזים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה כדי לקבוע את פעילות פירופוספוקינאז באמצעות נוקלאוטידים בעלי תווית רדיו. השיטה מספקת תובנות לגבי סינתזת נוקלאוטידים ותגובות פוספוטרנספורט.

בדיקת פעילות אנזימים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה: טכניקה לקביעת פעילות פירופוספוקינאז במבחנה באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה

סרטון זה מדגים מדידה חוץ גופית של פעילות אנזימים עבור α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז בדגימות באמצעות מצעים סינתטיים 4-Methylumbelliferyl.

מדידה חוץ גופית של פעילות האנזים α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז

אנו מתארים שיטה לכימות הפעילות של ATPases מסוג P-countertransport K+ על ידי ביטוי הטרולוגי של האנזימים בביציות Xenopus ומדידת קליטת Rb+ או Li+ לתאים בודדים על ידי ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. השיטה מהווה אלטרנטיבה רגישה ובטוחה לניסויי שטף רדיואיזוטופים המאפשרים מחקרים קינטיים מורכבים.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

כאן אנו מתארים מבחנים ביוכימיים שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין אנזימים לעיצוב מחדש של כרומטין תלויי ATP על יכולותיהם 1) לזרז החלקה של נוקלאוזום תלוי ATP, 2) לעסוק במצעי נוקלאוזום, ו-3) הידרוליזה של ATP באופן תלוי נוקלאוזום או DNA.

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

הדו"ח הנוכחי מתאר בדיקה אנזימטית במבחנה למדידת פעילות פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז באמצעות תמציות תאי לישמניה. בדיקה זו מבוססת על העברה של קבוצת מתיל רדיואקטיבית מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine על פוספטידיל-אתנולמין אנדוגני.

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

יש דרישה לעשות ניסויים פרה-קליניים של בדיקות עבור מחלקה הרומן של תרופות היתום"בשם מלווים תרופתי לשחזור, מהיר ויעיל. פיתחנו assay המבוסס על תרבות של תאים פשוטים מאוד מתוקננת, תכליתי למסך המטופלים זכאים, כמו גם רומן המלווה תרופתי סמים.

במבחנה אנזים המדידה לנקודת מבחן תגובתיות המלווה תרופתי פאברי, מחלת הפומפה

כאן, אנו מתארים שיטה לטיהור מתויג היסטידין pyrophosphokinase אנזימים וניצול כרומטוגרפיה שכבה דקה של סובסטרטים radiolabelled ומוצרים כדי assay עבור פעילות אנזימטי בתוך חוץ גופית. וזמינותו פעילות האנזים ישימה בהרחבה על כל קינאז, נוקלאוטיד cyclase או התגובה פוספור-העברת מנגנון אשר כולל נוקלאוטיד טריפוספט הידרוליזה.

ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

למדו לכמת פעילות ATPase במבחנה לאפיון אנזימטי של חלבונים מטוהרים. שיטה זו מאפשרת הערכת מפעילים או מעכבים פוטנציאליים ומסייעת בפיתוח תרופות ובהבנת תפקידים מטבוליים.

מדידה

גלה סרטונים נוספים