הידרופוניקה: מערכה צדדית לחקר תגובות הקצאת צמח מזין לזמינות מזין וחשיפת אלמנטים רעילים
13 ביולי 2016
כאן, אנו מציגים פרוטוקול קל לביצוע להקמת מערכת הידרופונית מוצלחת למחקרי תזונת צמחים. פרוטוקול זה נבדק בהרחבה ב-Arabidopsis וניתן להתאים אותו בקלות למיני צמחים אחרים כדי לחקור דרישות תזונתיות ספציפיות או את ההשפעה של אלמנטים לא חיוניים על צמיחה והתפתחות של צמחים.
הפרוטוקול הבא מספק הוראות שלב אחר שלב להקמת מערכת הידרופונית במעבדה. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה עבור Arabidopsis thaliana. אחד הגורמים העיקריים התורמים להקמה מוצלחת של תרבות הידרופונית הוא בריאות השתילים המשמשים לניסוי.
לכן, עיקור מכשירים, זרעים ואמצעי תרבות ממלאים תפקיד חשוב בהפחתת הסיכון לזיהום ומספקים התחלה טובה לצמחים לפני השתלתם במערכת ההידרופונית. בשלב זה גז הכלור המשתחרר מהתגובה בין אקונומיקה לחומצה הידרוכלורית מעקר את פני הזרעים. לפני העברת זרעים לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, השתמש בעיפרון כדי לתייג את הצינור ולזהות את הזרעים.
עיפרון מועדף מכיוון שהדיו עלול לדהות במהלך העיקור. סמן גם את מכסה הצינור עם Sharpie. סימן זה אמור להיעלם במהלך תהליך העיקור עקב גז הכלור המשתחרר.
נפח הזרעים המומלץ לצינור הוא בסביבות 100 מיקרוליטר. הנח את הצינור המסומן, מכסה פתוח לתוך מייבש הכביסה או תא הוואקום. הנח את חומר הייבוש במכסה אדים כימי פעיל.
שופכים 100 מיליליטר אקונומיקה לכוס של 250 מיליליטר, מניחים אותה במייבש וסוגרים את שסתום המייבש. הוסף במהירות 3 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית 12% לאקונומיקה בעזרת בורט. סגור מיד את המכסה.
אפשר לעיקור להמשיך במשך ארבע שעות. הנה החומר המייבש במכסה זרימה למינרי פעיל לאחר ארבע שעות של עיקור והאקונומיקה הוסרה. הסימן האדום מתפוגג מצביע על כך שנוצרה כמות מספקת של גז כלור.
פתח את מכסה המייבש לרווחה ואוורר את הזרעים המעוקרים למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן ניתן להשתמש בזרעים באופן מיידי או לאחסן במקום יבש. שלב זה עוזר לספק שתילים בריאים לפני שלב ההשתלה.
אלה הפריטים הדרושים להפעלת צלחות הזרעים. זרעים סטריליים, לוחות מדיה 1/4 MS, נייר סינון סטרילי, סרט מיליפור, קיסמים סטריליים, עט טוש, נייר אלומיניום. ראשית העבירו זרעים מצינור הצנטריפוגה לנייר פילטר סטרילי.
הרטיבו מעט קצה אחד של הקיסם והשתמשו בקצה הלח הזה כדי לאסוף את הזרעים מנייר הסינון ולהניח אותם על משטח האגר. מורחים את הזרעים על פני הצלחת בצפיפות של כזרע אחד לסנטימטר מרובע. כאן אנו משתמשים רק בכמה זרעים כדי להדגים את הצעד אך תוכלו להכין צלחת מלאה בזרעים.
כתוב את התאריך על מכסה הצלחת כדי לעקוב אחר גיל הצמח. השתמש בסרט מיקרופור כדי לשמור על מכסה הצלחת מחובר לגוף הצלחת. סרט זה מאפשר גם חילופי לחות בין האוויר למיקרו אקלים בתוך הצלחת.
השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות את הצלחת ולחסום את האור לפני הכנסת הצמח לחדר הקירור למשך יומיים. ניתן להשתמש בזמנים ארוכים יותר כדי לסייע בתהליך הנביטה. כמו 1/4 MS, גם התמיסה ההידרופונית צריכה להיות מעוקרת לאחר ההכנה.
השתמשנו בהצלחה בתמיסת התזונה הבאה לגידול Arabidopsis thaliana, אולם ניתן לשנות אותה כך שתתאים לניסויים ספציפיים או למיני צמחים שונים. מומלץ להכין תמיסת מלאי של כל מקרו-נוטריינט בבקבוקים שונים וכל המיקרו-נוטריינטים בבקבוק אחד, למעט ברזל-EDTA. ניתן להכין תמיסת תזונה פי 10 לפני הניסוי, אך יש לבצע חיטוי ולאחסן אותה בחדר הקירור.
להלן חומרים הדרושים להכנת מחזיקי צמחים. מיכל הידרופוניקה, לוח קצף, סכין נייר, בורר שעם, פקקי צינור קצף סטריליים, פינצטה. ראשית מדוד את גודל המיכל.
ואז חותכים את לוח הקצף לפי המידות הדרושות. סכין נייר מועילה במקרה זה. בדוק את גודל לוח הקצף מתאים היטב למיכל.
השתמש בפינצטה קטנה כדי להחזיק את הלוח. התאם את גודל לוח הקצף במידת הצורך. השתמש בעיפרון כדי לסמן מיקומים שבהם יעוגנו הצמחים.
השתמש בקידוח שעם כדי ליצור חורים בלוח הקצף. צפיפות מומלצת: צמח אחד לכל 10 סנטימטרים מרובעים. לאחר מכן, בצע חתך לאורך כל פקק קצף באמצעות סכין גילוח.
היזהר מאוד בעת שימוש בסכיני גילוח. כל חור יתמלא בתקע קצף. לפיכך, גודל החורים צריך להיות פרופורציונלי לתקעים.
השרו את שני התקעים במים נטולי יונים וחיטוי נוזלי לפני הגדרת ההידרופוניקה. כעת העבירו שתילים והקימו את משאבת האוויר. זהו תמיסה הידרופונית בריכוז עבודה.
אלה תקעי צינור הקצף הסטריליים. ואלה השתילים הבינוניים בני 12 יום. פתח את הצלחת.
השתמש בפינצטה קטנה כדי לשלוף בעדינות שתיל מהצלחת הבינונית ולהניח את השורש לאורך החתך של פקק הקצף. חבר בזהירות את צינור הקצף המחזיק את השתיל ללוח הקצף והנח את הלוח למיכל עם תמיסה הידרופונית. המשך להשתיל כדי לקבל את מספר הצמחים הרצוי.
וודא שתקעי צינור הקצף ספוגים בתמיסה ההידרופונית. בשלב הבא נראה כיצד להגדיר את מערכת האוורור, באמצעות משאבות אוויר קטנות מסוג אקווריום, יש צורך בצינורות פלסטיק, אבני בועות אקווריום, מערכת שסתומים ומשאבת אוויר. ראשית חבר את החלק הקצר והמנותק של צינור קו האוויר לאבני הבועה.
ואז חבר את האבנים למערכת השסתומים. לאחר מכן, חבר את מערכת השסתומים למשאבה. לאחר הפעלת המשאבה, האדם בסצנה מכוון את השסתום כדי לשלוט בקצב זרימת האוויר.
זרימת האוויר צריכה להספיק בדיוק כדי לספק חמצן מבלי לגרום נזק למערכת השורשים. כעת הניחו את לוח הקצף עם השתילים לתוך ההגדרה ההידרופונית. יש לכסות את דפנות המיכל כדי להגביל את האור המגיע לתמיסה ולהגביל את צמיחת האצות.
כסו גם את צמרות המיכל במכסים שקופים כדי למנוע אור עז שעלול לייבש שתילים שהושתלו לאחרונה. ברגע שהצמחים גדלים, הסר את הכובעים. עבור חוקרים המתעניינים בחומרי הזנה צמחיים, ניסויים הידרופוניים מספקים מערכת אידיאלית לבדיקת תגובות הצמח לתנאי תזונה שונים על ידי מניפולציה של ריכוזי היסודות המעניינים.
חוקרים יכולים ליצור תנאים מספיקים, חסרים או רעילים של חומרים מזינים. מדובר בשתילי Arabidopsis הגדלים במערכת ההידרופונית כמתואר בפרוטוקול. צמחים הורשו לגדול במשך שלושה שבועות במערכת ההידרופונית לפני ששינו את הרכב התמיסה ההידרופונית.
האדם בסצנה מחדש את התמיסה ההידרופונית לפני שהוא נותן טיפול לצמחים. נעשה שימוש בתמיסת מלאי של היסוד הרעיל קדמיום כדי להגביר את התמיסה ההידרופונית. ריכוז הקדמיום ששימש בניסוי זה היה 20 מיקרומולר.
לאחר הכנת התמיסה, הצמחים מוחזרים למיכלים שלהם. לאחר שישה ימים של טיפול, מפעלים שנחשפו לקדמיום הראו עיכוב בצמיחה ותסמיני כלורוזיס. נצפתה גם הפחתה בביומסה של יורה וגם בשורש.
איור זה מראה ניסוי שונה עבור צמחי Arabidopsis שגדלו במערכת ההידרופונית וטופלו בריכוזים שונים של אבץ. צמחים שגדלו בריכוזי אבץ גבוהים מ-42 מיקרומולר, הראו עיכוב בצמיחה עקב ריכוזי אבץ גבוהים. בעוד שצמחים ללא תוספת אבץ הראו גם עיכוב בצמיחה עקב מחסור באבץ בהשוואה לצמחים שגדלו עם 7 מיקרו-מולרי של אבץ.
לסיכום, מערכת הידרופונית זו היא גם זולה וגם ניתנת להרחבה. זה מאפשר לנו לבדוק את רגישות הצמח ליסודות רעילים או לחקור את דרישות התזונה של הצמח. ניתן לצפות גם בשורשים וגם בנבטים ולאסוף אותם בנפרד לצורך ניתוח יסודות או ניתוח ביטוי גנים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט להקמת מערכת הידרופונית שעברה אופטימיזציה למחקרי תזונת צמחים, ובמיוחד עבור Arabidopsis thaliana. ניתן להתאים את השיטה למיני צמחים שונים כדי לחקור דרישות תזונתיות ואת השפעותיהם של רכיבים שאינם חיוניים על הצמיחה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של הצומח
- הידרופוניקה
- תזונת צמחים
רקע
- הידרופוניקה מאפשרת ביצוע מחקרים מבוקרים של תזונת צמחים.
- בריאות השתילים היא קריטית להקמה מוצלחת של תרבית הידרופונית.
- עיקור של חומרים מפחית את סיכוני הזיהום.
- Arabidopsis thaliana משמשת כאורגניזם מודל למחקרי צמחים.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מהימן להקמת מערכת הידרופונית.
- סיוע במחקר על צרכים תזונתיים של צמחים.
- בחינת ההשפעה של רכיבים שאינם חיוניים על התפתחות הצמח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- עיקור זרעים באמצעות אקונומיקה וחומצה כלוריסטרית.
- הכנת מצעי גידול סטריליים ותמיסות הידרופוניקה.
- השתלת שתילים למערך הידרופוני.
- הקמת מערכת אוורור לחמצון אופטימלי של השורשים.
תוצאות עיקריות
- ביסוס מוצלח של שתילים בסביבה הידרופונית.
- הדגמת שיטות לשמירה על תנאים סטריליים.
- מתן הנחיות להכנת תמיסת חומרי הזנה.
- פירוט טכניקות אוורור יעילות לצמיחת צמחים.
מסקנות
- הפרוטוקול ניתן להתאמה למגוון מיני צמחים.
- מערכות הידרופוניות יעילות לחקר תזונת צמחים.
- סטריליזציה ואוורור נאותים הם המפתח להצלחה בהידרופוניקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכות הידרופוניקה מספקות סביבה מבוקרת לחקר הקצאת חומרים מזינים בצמחים ותגובות לאלמנטים רעילים, ובכך הן תומכות בתיקוף יעדים (target validation) בשלבים מוקדמים בביוטכנולוגיה חקלאית. השיטה מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד משתני תזונה וכמימות של תפוקים פנוטיפיים, דבר המנחה את זיהוי המועמדים המובילים (lead identification) לתוכניות לשיפור יבולים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לבדיקה הדירה וניתנת להרחבה של התערבויות גנטיות או כימיות תחת תנאי תזונה מוגדרים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולי חישה של חומרי הזנה ותגובות לרעילות במודלים של צמחים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מניפולציה מבוקרת של אלמנטים חיוניים ולא חיוניים לצורך הבהרת תפקוד גנים.
- ערך חיזוי: מסייע במיון פורטפוליו על ידי כימות תגובות גדילה למחסור בחומרי הזנה או לחשיפה לרעלים, ובכך מספק מידע לתעדוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקות המשך על ידי הבטחת שתילים בריאים, נקיים מזיהומים ובעלי שורשים שלמים.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות תמיסות רכיבים מוגדרות ובקרת אוורור.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשרת הערכה אמינה של תרכובות בתנאים של שפע, מחסור או רעילות של רכיבים, לצורך סריקה פנוטיפית בהספק גבוה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת נתוני תגובה לרכיבים תזונתיים משלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית באמצעות נקודות סיום מדידות של ביומסה וכלורוזיס.
- קידום מותאם סיכונים: תומכת בהחלטות go/no-go על ידי קישור מניפולציה של רכיבים תזונתיים לתוצאות פנוטיפיות נצפות במערכות רלוונטיות למחלה.
- סנכרון סממנים ביולוגיים: מאפשרת קורלציה בין חשיפה לאלמנטים לבין ביטוי גנים או אנליזה אלמנטרית לצורך פיתוח סממנים ביולוגיים תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה ההידרופונית משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מולקולות מובילות ועד לבדיקות פרה-קליניות, במיוחד עבור תכונות הקשורות ליעילות ניצול חומרי הזנה ולעמידות למשמרים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מתן שליטה מדויקת בזמינות רכיבי תזונה ובחשיפה לאלמנטים רעילים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות ביסוס סטנדרטי של שתילים והקמה הידרופונית הניתנת לשחזור בין חזרות ניסיוניות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה כמותית של ביומסת הנבט והשורש, תסמיני כלורוזיס וספיגת אלמנטים כתוצרי מדידה להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת פנוטיפים של תגובה לתזונה לרצף פרה-קליני באמצעות פגמי גדילה ניתנים לצפייה ושינויים מולקולריים תחת תנאי טיפול מוגדרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לסריקת וריאנטים גנטיים או סוכנים כימיים תחת תנאי תזונה מרובים ללא צורך בניסוח מחדש של המערכת המרכזית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי איתות של רכיבי תזונה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה באמצעות טכניקה סטרילית והכנה מוגדרת של תמיסות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשכה או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של רגישות לתזונה או בעיות רעילות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים באמצעות כימות תגובות תלויות-מינון לאלמנטים חיוניים ולא חיוניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות סטריליזציה לצמחים, הכנת תמיסות הזנה והרכבת מערכות הידרופוניות.
- תלוי בגישה לאוטוקלאב, מבת כימיים וסביבות גידול מבוקרות לצורך ביסוס השתילים.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הזנה ובקרת זיהומים בין צוותים כדי להבטיח הדירות (reproducibility) בין מעבדות שונות.
- נדרשת התאמה של צפיפות החורים בלוח הספוג ושל נפח התמיסה בעת הרחבה למינים שונים של צמחים או לגדלי מכלים שונים.
- מוגבל בשל הצורך בהשתלה ובניטור ידניים, דבר העשוי להגביל את התפוקה ללא שילוב של אוטומציה.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:34
Vapor-phase Sterilization of Arabidopsis Seeds
2:07
Prepare Seed Plates
3:26
Prepare Hydroponic Solution
3:59
Prepare Plant Holder and Hydroponic Containers
5:07
Transfer Seedlings from Medium Plates and Set up the Air-pump System
7:05
Examples of Plant Nutrient Experiment Using Hydroponic Setup
8:18
Representative Results
8:43
Conclusion
