רציף גל תוליום לייזר עבור תאים תאים מתורבת לחקור אפקט תרמי נייד

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור תגובות ביולוגיות של תאים תלויי מינון תרמי במבחנה על ידי חימום תאים מתורבתים עם בקרת טמפרטורה וזמן מדויקת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים החוקרים תגובות תאים או רקמות להיפרתרמיה, כגון חקר טיפול בלייזר רשתית. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא חימום מהיר של תאים ובקרה מדויקת על משך החימום המאפשר חשיפה תרמית גבוהה הניתנת לשחזור במהלך הניסויים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התגובות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית מתורבתים לקרינת לייזר תרמית, ניתן ליישם אותה גם על מודלים אחרים כגון תאים סרטניים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר חיממו תאים המכילים מלנין עם אור לייזר נראה. עם זאת, זה הביא לפרופילי טמפרטורה משתנים עקב שינויים בפיגמנטציה.

כדי להתחיל בהליך, הנח פלטה חמה במעמד מעבדת מתכת מתכוונן על ספסל נקי. הגדר את הפלטה החמה ל -39 מעלות צלזיוס. אבטח סיב NA 0.22 בקוטר ליבה של 365 מיקרומטר לזרוע האופקית של המעמד.

מקם את זרוע המתכת מעל הפלטה החמה והתאם את המעמד כך שקצה הסיבים יהיה 12 סנטימטרים מעל הפלטה החמה. חבר לייזר תוליום 1.94 מיקרומטר 20 וואט עם קרן מכוונת של 365 ננומטר מיליוואט אחד לקצה הסיבים. הניחו צלחת תרבות בקוטר 30 מילימטרים על הפלטה החמה.

עקוב בזהירות אחר היקף המנה על משטח הפלטה החמה ואז הסר את המנה. הפעל את קרן הכוונה והתאם את המעמד עד שמרכז נקודת האלומה על הפלטה החמה יתאים לעיגול המסומן. לאחר מכן כבה את קרן הכוונה.

כדי להתחיל בהליך כיול הטמפרטורה, מחממים את קצה המחט בגודל 20 עם מבער בונסן בעזרת קצה המחט המחוממת, חודרים את צלחת התרבות בקוטר 30 מילימטר קרוב לתחתית בארבע נקודות במרחק של 90 מעלות זו מזו כדי ליצור חורים בקוטר של כ -300 מיקרומטר. הנח סרט חשמלי מעל החורים.

השתמש במחט דקה כדי לנקב חור בקוטר של כ-200 מיקרומטר דרך הסרט המכסה כל חור. בצד התחתון של צלחת התרבות, צייר קו בין כל זוג חורים במרחק של 180 מעלות זה מזה. החל מההצטלבות של הקווים, סמן כל שלושה מילימטרים רדיאלית לאורך כל קו כדי לייעד את 21 נקודות המדידה.

לאחר מכן מניחים בכלי בדיוק 1.2 מיליליטר של מדיום תרבית טרי שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. מכסים את המנה ומניחים את המנה בעיגול המסומן על הצלחת החמה. חבר צמד תרמי בקוטר 200 מיקרומטר למחשב בקרת הלייזר ופתח את פרוטוקול כיול הטמפרטורה.

הכנס את הצמד התרמי לאחד החורים בכלי כך שהקצה יהיה בתחתית המנה באחד ממיקומי הסימן. חשוב מאוד לבדוק אם קצה הצמד התרמי נוגע בתחתית הכלי בדיוק הנמדד מכיוון שהטמפרטורה עשויה להשתנות בהתאם לעומק. המתן עד שמדיום התרבות יתייצב על 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הפעל את לייזר התוליום והגדר את עוצמת הלייזר לרמת ההתחלה הרצויה. ודא שמשכי החימום מראש מוגדרים ל-140 ושמונה שניות ולאחר מכן התחל את רצף הקרנת החימום מראש. לאחר 140 שניות כפי שנרמז על ידי צפצוף נשמע, הסר מיד את מכסה צלחת התרבות.

המתן עד שהחימום המוקדם יסתיים וההקרנה של 10 שניות תתרחש. ואז מכסים מיד את המנה. מדוד את הטמפרטורה ב-21 מיקומי הסימנים בדרך זו.

בצע הליך זה שלוש פעמים כל אחת במרווחי הספק של שלושה וואט המשתרעים על טווח הספק הלייזר. לאחר שתסיים, כבה את לייזר התליום. ייצא ונתח את נתוני הטמפרטורה.

לפני הניסוי, תאי אפיתל פיגמנט שכורים בתרבית בכלי תרבית בקוטר 30. שמור על תרביות התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ובדוק אותן באמצעות מערכת הדמיית תאים חיים. שעה לפני ההקרנה, החלף את מדיום התרבות בכל מנה ב -1.2 מיליליטר בדיוק של מדיום תרבות טרי.

החזירו את התרבויות לחממה. ודא שתחנת ההקרנה מוכנה ושהפלטה החמה מכוונת ל-39 מעלות צלזיוס. כאשר אתה מוכן להתחיל בהקרנה, הפעל את לייזר התוליום בעוצמה הרצויה.

פתח את פרוטוקול הניסוי וודא שמשך החימום המוקדם מוגדר ל-140 ושמונה שניות. הנח תרבית תאי RPE בכלי סגור במיקום המסומן על הפלטה החמה והתחל מיד את רצף ההקרנה של 140 ושמונה שניות לחימום מראש. הסר את מכסה הכלים לאחר 140 שניות של חימום מראש.

המתן עד שהחימום המוקדם יסתיים וההקרנה של 10 שניות תתרחש. מכסים מיד את המנה, ממתינים שבע שניות ואז מחזירים את המנה לחממה. להקרין דגימות נוספות ברמות עוצמת לייזר הולכות וגדלות.

בסיום, כבה את לייזר התליום. כדי להתחיל בהערכת כדאיות התאים, שטפו את התאים המוקרנים עם PBS. השג ערכה המסוגלת להבדיל בין תאים אפופטוטיים ונמקיים חיים.

לאחר מכן, בתאורה חלשה, שלב 500 מיקרוליטר של מאגר קשירה עם 25 מיקרוליטר של אתידיום הומודימר-3, FITC annexin ו-Hoechst 33342. דגרו את התאים בתמיסת מכתים זו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן שטפו את התאים עם מאגר מחייב 1X פעמיים.

החלף את מאגר הקישור ב-PBS והנח את התא על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הכולל מסנני DAPI, FITC ו-TRITC. הגדר את נתיב האור של המיקרוסקופ לעדשת העין ובחר את מסנן ה-DAPI. הפעל את נורית התאורה ומצא את מישור המיקוד עם עדשת אובייקט 4X.

הגדר את נתיב האור למצלמת המיקרוסקופ. השתמש בתוכנת הדמיית המיקרוסקופ כדי למרכז ולמקד את התמונה. הגדר את הפרמטרים לרכישת תמונות באמצעות מסנן DAPI.

חזור על תהליך המיקוד והגדרת רכישת התמונות עם מסנני FITC ו-TRITC. לאחר מכן השתמש בתוכנת ההדמיה כדי להשיג תמונות מרובות עם שלוש ערכות מסננים על פני הצלחת ולשלב אותן לתמונה אחת של צלחת התרבות כולה. השתמש בתוכנה אנליטית כדי לקבוע את סף הטמפרטורה לאפופטוזיס ומוות תאי.

הקשר הפרופורציונלי בין עליית הטמפרטורה המקסימלית במרכז צלחת תרבית תאים לבין עוצמת הלייזר נקבע על ידי הליך הכיול התרמי המתואר. התפלגות הטמפרטורה המקסימלית על פני צלחת תרבית התאים התאימה אז לפונקציה גאוסית. שלושה דפוסי צביעה נצפו לאחר הקרנה.

לא נצפה שינוי בכדאיות בתרביות שהיו נתונות לטמפרטורות של 43 מעלות צלזיוס או מתחת להן. אפופטוזיס נצפה לראשונה שלוש שעות לאחר ההקרנה ב-47 מעלות צלזיוס. מוות תאים נצפה מאוחר יותר משלוש שעות לאחר 51 מעלות צלזיוס ומעלה.

טמפרטורות הסף הממוצעות לאפופטוזיס ומוות תאים נקבעו לאחר מכן על ידי החלת ממוצע הרדיוסים הנמדדים של האזורים המתים והאפופטוטיים על הפונקציה הגאוסית המתארת את התפלגות הטמפרטורה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע הקרנות בתנאים רבים ושונים כגון פרופילי לייזר שונים, גדלי כתמים וזמני הקרנה. זה יכול לעזור להבין ולחקור שאלות הקשורות לגורמים בודדים לטמפרטורה מתוזמנת ברמה התאית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחמם את תרבית התאים עם שליטה טובה על הטמפרטורה והזמן. זה עשוי לרכוב על האפשרויות לחקר תגובות ביולוגיות לתנאי קרינה תרמית שונים. אל תשכח שעבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת מאוד לעיניים ולעור שלך.

הישאר מעודכן לגבי הדרכת בטיחות הקרנת לייזר. הרכיבו תמיד משקפי בטיחות מתאימים, מעיל מעבדה וכפפות בעת ביצוע הליך זה.