דיכוי מערכת החיסון קביעת לעומת להגנת CNS להתערבויות פרמקולוגיים demyelination אוטואימוניות

המטרה הכוללת של שיטה מושגית זו היא לקבוע אם טיפולים תרופתיים לדלקת מוח אוטואימונית ניסיונית מדגימים את ההגנה שלהם על מערכת העצבים המרכזית במהלך מתקפה של חדירת תאי חיסון או כתוצאה מדיכוי חדירת תאי חיסון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגי העצבי. כגון, כיצד מניפולציה של זמני הטיפול ב-EAE מבדילה בין ההשפעות על חדירת תאי חיסון לעומת הגנה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות גם על טיפול בטרשת נפוצה, מכיוון שאין כיום טיפולי הגנה עצביים למחלה זו. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשגילינו שטיפול בעכברי EAE עם מעכב של מערכת Xc-transporter היה גם נוירו-פרוטקטיבי וגם אימונומודולטורי. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו לחקר טיפולים תרופתיים, ניתן ליישם אותה גם במחקרים המשתמשים בעכברי נוקאאוט גנטיים שנחשפו ל-EAE או מניפולציות אחרות.

התחל בשימוש במספריים סטריליים כדי לטחון את המוח וחוט השדרה מבעלי חיים בודדים לחתיכות קטנות. לאחר מכן השתמש בבוכנת מזרק אחת של שלושה מיליליטר לכל רקמה כדי לרסק כל דגימה על מסנני תאים בודדים של 70 מיקרון לצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר תוך שטיפת המסננות במדיום. לאחר שכל החלקים הושרו, הביאו את הנפח הסופי בצינורות עד 50 מיליליטר עם מדיום טרי, ואז צנטריפוגה את מתלי התאים.

השעו מחדש כל גלולה בארבעה מיליליטר של תמיסת שיפוע בצפיפות של 40%. לאחר מכן שכב בזהירות את התא באיטיות לאורך הקירות של צינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר על גבי שני מיליליטר של תמיסת שיפוע בצפיפות של 70% לכל צינור. הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה והשתמש בפיפטות העברה של מיליליטר אחד כדי להשליך בזהירות את שכבות המיאלין העליונות.

לאחר מכן, העבירו את התאים הקיימים מממשקי הדגימה לצינורות חרוטיים חדשים של 15 מיליליטר ושטפו את התאים בנפח סופי של 15 מיליליטר של מדיום טרי לכל צינור. השעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של מדיום טרי והעבירו את מתלי התאים לבארות בודדות של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות. צנטריפוגה של הצלחת והעיף את הסופרנטנטים.

לאחר מכן, השעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של מדיום רסטימולציה ודגרו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. בתום הדגירה יש לצנטריפוגה שוב את הצלחת ולהסיר את הסופרנטנטים. לאחר מכן שטפו את התאים ב-200 מיקרוליטר PBS בתוספת 2%FCS והשעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר PBS בתוספת 2% FCS ובלוק FC למשך 10 עד 15 דקות על קרח.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים כפי שהודגם זה עתה ולהשעות את הכדורים ב-15 מיקרוליטר של קוקטייל כתמים על פני התא למשך 15 דקות על קרח. לאחר מכן סובב את התאים ושטוף את הדגימות פעמיים ב-200 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים בריאגנטים לצביעה של גורם שעתוק FOXP3 על פי הוראות היצרן למשך 30 דקות עד לילה ב-4 מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים ב -150 מיקרוליטר של מאגר חדירה. לאחר מכן צנטריפוגה של התאים והשעיה מחדש של הכדורים בנוגדנים התוך-תאיים המעניינים ב-15 מיקרוליטר של מאגר חדירות על קרח. לאחר 30 דקות, סובב את התאים ואחריו שלוש שטיפות ב-200 מיקרוליטר של מאגר חדירה.

לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר PBS ונתחו את הדגימות על ידי ציטומטריית זרימה, תוך שמירה על התאים החיים חיוביים ל-CD4, TCR חיוביים לבטא. חשוב גם להעריך את התפשטות תאי T היקפיים מכיוון ששינויים בפריפריה יכולים להשפיע על חדירת תאי החיסון למערכת העצבים המרכזית. כדי לכמת את מספר האסטרוציטים ותאי הגליה הקיימים בדגימות רקמת חוט השדרה לאחר השראת EAE, השג תמונות של כל קטע בהגדלה פי 4 ושמור את התמונות כקבצי TIFF.

לאחר מכן, ב-ImageJ, בחר את התמונה המעניינת והשתמש בכלי בחירת המצולע כדי לעקוב אחר כל קטע רקמת השדרה. בתפריט התמונה, בחרו type ו- 16 סיביות כדי להמיר את התמונה ל- 16 סיביות. לאחר מכן, פתח את תפריט התהליך ובחר רקע נושא כדי להגדיר את רדיוס הכדור המתגלגל לפחות לגודל האובייקט הגדול ביותר שאינו חלק מהרקע.

בדוק את הפרבולואיד הגולש ולחץ על אישור. לאחר מכן, תחת תמונה, בחר התאם וסף, והשתמש בסרגלי ההזזה כדי להגדיר את רמת הסף התחתונה. כדי לקבל את אחוז השטח הסף באזור שנבחר, תחת ניתוח והגדרת מדידות, בחר שבר שטח. ודא שהמגבלה לסף אינה מסומנת וכי תווית התצוגה מסומנת, ולחץ OK.To לקבל את המדידות תחת ניתוח, בחר מדידה.

תופיע תיבה קופצת של תוצאות. שמור נתונים אלה והשווה את ערכי שבר השטח בין קבוצות הטיפול. כדי לכמת את הצביעה הבסיסית של המיאלין על ידי צפיפות אופטית, פתח את התמונה המעניינת והשתמש בכלי חתכי המצולע כדי לצייר אזור עניין בתוך הדגימה.

תחת נתח והגדר מדידות, בחר ערך אפור ממוצע ואשר שהמגבלה לסף אינה מסומנת, ותווית התצוגה מסומנת. לחץ על OK. לאחר מכן, תחת תפריט הניתוח, בחר מדידה. תיבה קופצת חדשה של תוצאות תופיע עם נתוני הערך האפור הממוצע של החלבון הבסיסי של המיאלין.

הסרת חוט השדרה וניתוח זרימה ציטומטרי מאפשרים להעריך את חדירת תאי החיסון של מערכת העצבים המרכזית, כאשר חדירת תאי החיסון היא מקסימלית בשיא המחלה. ניתוח סטטיסטי של מספרי התאים החיוביים ל-CD4, אינטרפרון גמא חיובי, IL-17 חיובי ו-FOXP3 יכול לחשוף את המשמעות של השינויים שנצפו במספרי תאי T חודרים חיוביים ל-CD4 בבעלי חיים שטופלו בתרופות, לעומת חיות ביקורת, כאשר ניתוח ביטוי משותף מעמיק חיוני לשלילת הטיה כגורם מבלבל בהפחתה הכוללת של מספר תאי T חודרים חיוביים ל-CD4. כדי לבטל את האפשרות שהפחתה במערכת העצבים המרכזית החודרת לתאי T היא תוצאה של עיכוב התפשטות, הפעלה והתמיינות בפריפריה, ניתן להעריך את מספר תאי ה-T המתרבים באופן פעיל ואת שיעור תת-הסוגים של תאי T.

לצורך הערכה כמותית של שלמות המיאלין, ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי של הצפיפות האופטית של צביעת החלבון הבסיסי של המיאלין, ולחשוף דה-מיאלינציה משמעותית של רקמת חוט השדרה בחיות נוקאאוט גנטיות לא מוגדרות בהשוואה לחברי המלטה מסוג בר, למשל. כדי לבסס עוד יותר כי דלקת עצבית נשמרת או מופחתת על ידי התערבויות טיפוליות, ניתן להעריך גליוזיס תגובתי גם על ידי מדידת שטח השבר הממוצע עבור גליוזיס תגובתי כפי שהודגם זה עתה. לאחר השליטה, ניתן להשלים את טכניקת הזרימה הציטומטרית תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי, בעוד שניתן לבצע כימות של צביעת הרקמה תוך כשעתיים לכל כתם.

ניתן להעריך את האימונומודולציה על ידי הצגת הטיפולים לפני חדירת תאי החיסון כדי לכמת את השינויים הנודדים והשגשוג בתאי T. ניתן להעריך את ההגנה על מערכת העצבים המרכזית על ידי הכנסת הטיפולים בשיא המחלה כאשר תאי החיסון כבר חדרו למערכת העצבים המרכזית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להעריך את הגדרות הסף האופטימליות ב-ImageJ עבור ההדגשה הספציפית של צביעה סלולרית בלבד.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להעריך את ההשפעות של טיפולים ספציפיים על מערכת העצבים המרכזית, התפשטות תאי T ותגובות נדידה. על ידי שינוי זמני הטיפול לפני ואחרי חדירת תאי חיסון.