Name: תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: למד לתכנת מחדש פיברובלסטים עובריים בעכברים באמצעות גורמי שעתוק כדי ליצור תאי קדם המטופויטיים. שיטה זו מאפשרת ייצור HSCs ללא שלב פלוריפוטנטי ביניים ומקדמת מחקר במחלות המטולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NHLBI לק.מ. ו-I.R.L. (1RO1HL119404). קרלוס-פיליפה פריירה זכה במלגה ביו-רפואית בכירה של רבסון. אנו מודים למתקן המשאבים המשותפים של הר סיני hESC/iPSC ול-S. D'Souza על הסיוע בחומרים ובפרוטוקולים. אנו מודים גם למתקני הציטומטריה, הגנומיקה והעכבר של הר סיני.

<ol><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Papapetrou, E. P., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+blood+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells.</a> F1000 Med Rep. 2, (2010).</li>
<li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li>
<li>Mitchell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evidence+for+OCT4-induced+plasticity+in+adult+human+fibroblasts+required+for+direct+cell+fate+conversion+to+lineage+specific+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors.</a> Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divisional+history+and+hematopoietic+stem+cell+function+during+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).</li>
<li>Riddell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+committed+murine+blood+cells+to+induced+hematopoietic+stem+cells+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors.</a> Cell. 157 (3), 549-564 (2014).</li>
<li>Sandler, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+endothelial+cells+to+haematopoietic+cells+requires+vascular+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction.</a> Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).</li>
<li>Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+Hematopoietic+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Making a Hematopoietic Stem Cell.</a> Trends Cell Biol. , (2015).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li>
<li>Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+timed+pregnancies+in+two+strains+of+genetically+engineered+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%22%5BJournal%5D)">Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice.</a> Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).</li>
<li>Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+handling+of+mouse+embryonic+fibroblasts%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts).</a> Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).</li>
<li>Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of mouse embryonic stem cells.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+murine+and+human+somatic+cells+using+a+single+polycistronic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drug-inducible+system+for+direct+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).</li>
<li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin%2BCD45%2B+pre-definitive+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li>
<li>Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+hematopoietic+stem+cells+from+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Lewis, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+blood+cells+capable+of+engrafting+in+primary%2C+secondary%2C+and+tertiary+xenogeneic+hosts+are+preserved+after+ex+vivo+culture+in+a+noncontact+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system.</a> Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).</li>
<li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li>
<li>Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+and+its+niche%3A+a+comparative+view%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view.</a> Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).</li>
<li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+vascular+niche+platform+for+expansion+of+repopulating+human+cord+blood+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells.</a> Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).</li>
<li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+niche+promotes+hematopoietic+multipotent+progenitor+formation+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).</li>
<li>Bar-Nur, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li>
<li>Maza, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+acquisition+of+pluripotency+during+somatic+cell+transdifferentiation+with+iPSC+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Epigenetic+memory%3A+phenomenon+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">"Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells.</a> Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).</li>
<li>Elcheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+haematoendothelial+programs+in+human+pluripotent+stem+cells+by+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators.</a> Nat Commun. 5, 4372(2014).</li>
<li>Vereide, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expandable%2C+inducible+hemangioblast+state+regulated+by+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor.</a> Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

יצירת HSPCs דה נובו מן התאים הסומטיים להשגה בקלות מציעה שיטה ייחודית ללמוד hematopoiesis במבחנה, וההזדמנות פוטנציאל ליישם את הטכנולוגיה הזו על המערכת האנושית. התרגום הזו יעורר כלי חדש ללמוד מחל המטולוגית אדם בצלחת, כמו גם לספק פלטפורמות בבדיקת סמי גן מיקוד הזדמנויות לטיפול בהפרעות רבות עם הרפוי רומן או השתלות HSC. בתחום, מחקרים שנעשה לאחרונה הרחיבו על היכולת ליצור HSPCs דה נובו, הוכיחו את החשיבות של מספר תכונות של תהליך תכנות מחדש. אלה כוללים את הבחירה ש...

Hematopoiesis היא תהליך התפתחותי מורכב שבו בתאי גזע hematopoietic (HSCs) יוצאים מגוף האנדותל hemogenic קיים במגוון רחב של אתרי hematopoietic עובריים כגון האאורטה-בלוטת המין-כלה ואת 1,2 השליה. חוסר יכולת התרבות HSCs במבחנה מונעת עומק בניתוח של התהליך הזה, כמו גם את היישום הקליני של מחקרים אלה. כדי לעקוף מגבלה זו, מחקרים קודמים ניסו לגזור HSCs דה נובו או דרך בידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) 3, או פלסטיות מושרה בתאים הסומטיים בידול מכוון באמצעות מדיה תכנות מחדש 4,5. מחקרים אלה, לעומת זאת, לא לייצר תאי engraftable בטוחים קליני או לאפשר מחקר של hematopoiesis התפתחותי הסופי &quot;בצלחת&quot;. עבודת הרומן שהקימה יאמאנאקה ועמיתיו ליצור מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) מ- p פיברובלסטים סומטייםrovides מסגרת גורם שעתוק (TF) אסטרטגיות ביטוי יתר מבוססות גורל תא תכנות מחדש 6,7. עבודה זו הביאה חוקרים בתחומים שונים כדי ליצור סוגי תאים של בחירה באמצעות תכנות מחדש TF של תאים סומטיים להשגה בקלות. מטרת אסטרטגית תכנות מחדש המתוארת כאן היא להשפיע על תהליך hemogenic מן תאי הסומטיים עכבר באמצעות גישת תכנות מחדש מבוסס TF במטרת תרגום ממצאים אלה למערכת האנושית לתכנת מחדש fibroblasts מטופל ספציפי כדי ללמוד hematopoiesis האנושי במבחנה ליצור מוצרי דם מטופל ספציפי עבור מודלי מחלה, בדיקות סמים, גזע השתלה תאית. הצעד הראשון כדי להבטיח תכנות מחדש נאה במערכת העכבר הזה היה לפתח קו כתב ששמש מחוץ קריאה לביטוי CD34, סמן ידוע ובתאי אנדותל HSCs. כדי לעשות זאת, קווי huCD34-TTA ו TETO-H2BGFP העכבר המהונדסים שמשו gפיברובלסטים עובריים בעכבר כפול enerate מהונדס (MEFs), עכשיו מסומן 34 / H2BGFP, כי לזרוח ירוק באקטיבציה של האמרגן CD34 8. זה איפשר הקרנת מגוון של TFS ידוע להידרש בנקודות שונות במהלך מפרט hematopoietic ופיתוח. החל 18 TFS וקטורים retrovial PMX (נקבע באמצעות כריית ספרות פרופיל של תווית GFP שמירה HSCs מן שתואר לעיל 34 / H2BGFP עכברים), 34 / H2BGFP MEFs היו transduced עם כל הגורמים ותרבותי על AFT024 HSC-תאים תומכים סטרומה. לאחר זיהוי של הפעלת 34 / H2BGFP, TFS שהועבר בפועל מקוקטייל תכנות מחדש עד ששקעה האופטימלי של TFS להפעלת כתב זוהה. לאחר מסך ראשוני זה, הגורמים הועברו מערכת וקטור DOX מושרה pFUW לאפשר ביטוי לשליטה של ​​TFS. מאז שתי אלה מערכות לשליטת DOX אינן עולים בקנה אחד (תאי 34 / H2BGFP ואת וקטורי pFUW המושרים), MEFs מwild-type C57BL / 6 עכברים נדרשו. זה היה גם צורך לספק microenvironment שראוי לאפשר hemogenesis כדי להמשיך וליצור אבות clonogenic multilineage. מחקרים עכשוויים המנסים לתכנת מחדש תאי סומטיים לתאי גזע אבות היווצרות דם (HSPCs) נפגשו רמות מגוונות של הצלחה 9-11. נכון להיום, דור שני עכבר HSPCs להשתלת אדם עם לטווח ארוך ויכולת repopulating עצמית חידוש שלא הושג באמצעות אותה הקבוצה של TFS. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של האסטרטגיה הוקמה בעבר לגרום hemogenesis reproducibly ב MEFs. אנו מדגימים הקדמה של מספר מינימאלי של TFS (Gata2, Gfi1b, סמנכ&quot;לי כספים, ואת Etv6) מסוגל ייזום תכנית התפתחותית מורכבת במבחנה המספקת פלטפורמה שבאמצעותה hematopoiesis התפתחותיים יישום קליני של תכנות מחדש hematopoietic ניתן ללמוד עוד 12.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; מסנני M</td><td>Corning</td><td>430625</td><td></td></tr><tr><td>Amicon מסננים צנטריפוגליים אולטרה</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini's Benchmark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>18 גרם מחטים</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>20 גרם מחטים</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>25 גרם מחטים</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג I</td><td>סיגמא</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>מדיה Myelocult</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>מו"פ & D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Flt3L</td><td>R & D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>מו"פ D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>מו"פ D Systems</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R & D Systems</td><td>488-TO</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (hexadimethrine bromide)</td> <td>Sigma</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 0.65 &mu; מסנני ממברנה M</td><td>Millipore</td><td>DVPP14250</td><td></td></tr><tr><td>מדיה מתיל צלולוז</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>Methocult M3434</td><td></td></tr><tr>טכנולוגיות <td>תאי גזע</td><td>הידרוקורטיזון</td><td>07904</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 עכברים</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>G-1890 100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO</td><td>Addgene</td><td>פלסמיד #20321</td><td></td></tr><tr><td>Gata2</td><td>Origene</td><td>MR226728</td><td></td></tr><tr><td>Gfi1b</td><td>Origene</td><td>MR204861</td><td></td></tr><tr><td>cFos&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>פלסמיד #19259</td><td></td></tr><tr><td>Etv6</td><td>Origene</td><td>MR207053</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #20342</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ x 10 מ"מ תרבית כלים</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>171099</td><td></td></tr></tbody></table>

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית hemogenic

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

פרוטוקול זה מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) באמצעות ביטוי יתר של גורמי שעתוק (TFs). תחילה עיצבנו מסך מדווח באמצעות MEFs מעכברים טרנסגניים כפולים CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP). תאי CD34+ מעכברים אלה מסמנים היסטונים H2B ב-GFP, ומפסיקים את התיוג עם הוספת דוקסיציקלין (DOX). MEFS הומרו עם TFs מועמדים ולאחר מכן נצפו להופעתם של תאי GFP+ שיצביעו על רכישת גורל של תאים המטופויאטיים או אנדותליים. החל מ-18 TFs מועמדים, ודרך תהליך של חיסול קומבינטורי, השגנו קבוצה מינימלית של גורמים שיגרמו לאחוז הגבוה ביותר של תאי GFP+. מצאנו ש-Gata2, Gfi1b ו-cFos היו נחוצים והתוספת של Etv6 סיפקה את האינדוקציה האופטימלית. סדרה של ניתוחי ביטוי גנים שנעשו בנקודות זמן שונות במהלך תהליך התכנות מחדש גילתה כי נראה כי תאים אלה עוברים דרך תא מבשר שעבר מעבר אנדותל להמטופויאטי (EHT). ככזה, תהליך תכנות מחדש זה מחקה המטופואיזיס התפתחותי "בצלחת", ומאפשר מחקר של המטופואיזיס במבחנה ופלטפורמה לזיהוי המנגנונים העומדים בבסיס מפרט זה. מתודולוגיה זו מספקת גם מסגרת לתרגום עבודה זו למערכת האנושית בתקווה ליצור מקור חלופי של תאי גזע המטופויאטיים ספציפיים לחולה (HSCs) למספר יישומים בטיפול ומחקר של מחלות המטולוגיות.

Hematopoiesis היא תהליך התפתחותי מורכב שמתחיל אתרים עובריים שונים. תאי אנדותל Hemogenic מתגוררים באתרים אלה להצמיח HSCs באמצעות תא ניצני 23. תהליך זה כרגע לא ניתן לשחזר על ידי הצבת HSCs או מבשרי hematopoietic בתרבות, דבר המחייב מתודולוגיה איכשהו להשיג תאים אלה במבחנה, בין אם על ידי הרחבת HSPC vivo לשעבר או דור דה נובו. פרוטוקול זה מדגים הטכנולוגיה החדשנית שלנו המנסה להשיג תאים אלה באמצעות ביטוי יתר TF ב MEFs. <...

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של קבוצה מינימלית של גורמי שעתוק. טכנולוגיה זו עשויה להיות מתורגמת למערכת האנושית כדי לספק פלטפורמות למחקר עתידי של המטופואיזה, מחלות המטולוגיות והשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

המטרה הכללית של פרוטוקול השראת ההמוגניזציה זה היא לעורר תהליך התפתחותי בפיברובלסטים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של גורמי שעתוק, כדי להפיק תאי קדם המטופואטיים in vitro המייצרים תאי דם לאחר תרבית ממושכת. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום התכנות ההמטופואטי, כגון האם ניתן לפתח פרוטוקול להשגת HSCs אמיתיים de novo, המסוגלים להבדיל למספר שורות תאים ולהשתבץ ברקמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבאמצעות ביטוי יתר של סט מינימלי של גורמי שעתוק, ניתן להתחיל את תהליך ההתפתחות בתאים שעברו תכנות מחדש, ללא צורך במעבר דרך שלב ביניים פלוריפוטנטי.לאחר גידול פיברובלסטים עובריים של עכבר או MEFS, והפקת וירוס בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו בג'לטין בריכוז 0.1 אחוז ב-PBS לציפוי מקדים של פלטות בעלות 6 בארות. ודאו שהג'לטין מכסה את כל שטח הבאר. הניחו את הפלטות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות לפחות.לאחר מכן, הוצא את הפלטות ושאב את הג'לטין. זרע MEFs ב-DMEM סטנדרטי בצפיפות של 25, 000 תאים לבאר והשאר את התאים להשקיע ב-37 degrees celsius למשך לילה. הכן תערובת נגיפיים של 100 microliter על ידי ערבוב של 50 microliters של M2RTTA ו-12.5 microliters מכל אחד מ-GATA2, GFI1B, CFOS ו-ETV6.שאבו את המצע מה-MEFS והוסיפו שני מיליליטרים של DMEM סטנדרטי עם 8 מיקרוגרם למילליליטר של hexadimethrine bromide. לאחר מכן, בצעו טרנסדוקציה לכל באר של MEFs באמצעות 15 מיקרוליטר של תערובת הנגיף והדגירו ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר 16 עד 20 שעות של הדגרה, החליפו את המצע בכל באר בשני מיליליטרים של DMEM סטנדרטי טרי, בתוספת של מיקרוגרם אחד למילליליטר של DOX.דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שלושה ימים. ביום הרביעי, הכינו מצע תרבית המטופואטית מועשר ב-hydrocortisone, stem cell factor, MFS-related tyrosine kinase three ligand, interleukin three, interleukin six ו-DOX. לאחר מכן, שאבו את המצע מה-MEFs והשתמשו ב-1 mL של PBS לשטיפת התאים.לאחר מכן, לאחר שאיבת ה-PBS, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.05 percent trypsin לכל באר כדי להפריד ולאסוף את התאים. השתמשו בhemocytometer לספירת התאים, затем סובבו ב-300 ×g למשך חמש דקות והשתמשו ב-12 milliliters של המצע ההמטופואטי שהוכן זה עתה כדי לסבסב את התאים. לאחר מכן, זרעו 10,000 תאים לכל באר בלוחות שש-בארים מצופים בג'לטין.בכל שישה ימים, החליפו את המצע במצע תרבית המטופואטי משולב טרי למשך תקופת התרבית. נתחו את התאים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר הפקת שליות מעכברים ההרה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו בשניים עד חמישה מיליליטר של 0.2% collagenase type one ב-PBS עם 20% FBS כדי לשטוף את הרקמה, ובאמצעות מחט gauge 18 המורכבת על מזרק של חמישה מיליליטר, בצעו דה-אסוציאציה מכנית של הרקמה בתוך תמיסת ה-PBS.הדגרו את תאי השילייה בשני עד חמישה מיליליטר של תמיסת קולגנאז ב-37 °C למשך 1.5 שעות. לאחר מכן, העבירו את התאים מספר פעמים דרך מחטים בכיול 20 עד 25 המותקנות על מזרקים של 5 מיליליטר כדי להמשיך בפירוק מכני שלהם. לאחר מכן, סננו תרחיפי תאים בודדים דרך מסנני תאים של 70 מיקרון.לאחר מכן, באמצעות המוציטומטר, ספרו את התאים והקרינו ב-2,000 centigray volts לצורך אינאקטיבציה של המיטוזה. הוסיפו עשרה מיליליטר של מצע תרבית המטופואטית המועשר בתוספות הבאות לכלי תרבית בקוטר עשרה סנטימטרים. הניחו את המסנן בגודל 0.65 micron ישירות על מצע התרבית בכלי, אפשרו לו לצוף כדי ליצור ממשק נוזל-גז והניחו את הכלי בצד.בצעו דיסוציאציה לתאי MEFs שעברו טרנסדוקציה ביום 25 כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, וערבבו 33,000 מתאי ה-MEFs שעברו טרנסדוקציה עם 167,000 תאים של אגרגטים של שליה שעברו אינאקטיבציה מיטוטית. כדי ליצור אגרגט, צנטריפוגו את תערובת תאי ה-MEF ותאי השליה ב-300 ×g למשך חמש דקות. שאבו את המדיום והשתמשו ב-30 עד 50 µL של DMEM סטנדרטי כדי להשעות מחדש את התאים שהשקיעו, תוך שאיבת תרחיף התאים הבודדים לתוך טיפ של פיפט בנפח 200 µL ללא קצה חתוך.בשלב הבא, חסמו את קצה הפ pipette באמצעות סרט פאראפין. לאחר מכן, הכניסו את הקצה החסום לתוך מבחנה צנטריפוגית של 15 milliliter וסובבו אותה במהירות של 300 times g למשך חמש דקות, כך שייוצר משקע בקצה המכוסה של ה-pipette. הוציאו בזהירות את ה-pipette מהמבחנה של 15 milliliter והניחו אותה על קצה של pipette P200.הסיר את סרט הפרפין והעבר את משקע התאים אל המסנן הצף בצלחת עם מצע גידול. גדל את הצברים על המסננים הצפים בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% carbon dioxide למשך ארבעה עד חמישה ימים. בעזרת גורד תאים (cell scraper), אסוף את הצברים, איחד אותם והשתמש ב-0.5% collagenase כדי לעכל אותם.לאחר הדיסוציאציה, השתמשו בשניים עד חמישה מיליליטר של PBS עם 5% FBS לשטיפת האגרגטים, וסובבו בcenterY-צנטריפוגה ב-300 ×g למשך חמש דקות. השעיקו מחדש את האגרגטים ב-500 µL של DMEM ללא FBS, Pen-Strep או L-glutamine. הוסיפו את כל התוךSuspension לשלושה מיליליטר של מדיום עם 1% methylcellulose המועשר ב-10 ng/mL של Tepo, תוך הימנעות זהירה מיצירת בועות.העבירו נפחים שווים של תערובת זו לשלוש צלחות תרבית לא מטופלות בגודל 35 על עשרה מילימטרים לצורך בדיקות CFU. כביקורת, גדלו אגרגטים של שליה שהוקרנו. לבסוף, ספרו את המושבות ההמטופואטיות ידנית תחת מיקרוסקופ לאחר עשרה עד 14 ימי תרבית בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% carbon dioxide.בתהליך התכווץ תאים של MEFs ל-HSCs, התאים עוברים טרנסדוקציה של גורמי שעתוק כפי שמוצג כאן. לאחר שלושה ימים של הרחבה וחשיפה ל-DOX להפעלת הגן המועבר, התאים מופרדים, מחולקים ומגודלים על פלטות מצופות ג'לטין ובמדיום המטופבל המשלים. ביום ה-20 בתרבית, לאחר טרנסדוקציה במדיום התכווץ, MEFs מסוג 34/H2BGFP עוברים שינויים מורפולוגיים ברורים, כולל מורפולוגיה אנדותליאלית הנבדלת מזו של MEFs.תרבית נוספת עד ליום 35 גורמת להופעתם של מספר תאים עגולים דמויי-המטופויטיים מתוך תוצרי ביניים דמויי-אנדותל, שהם חיוביים ל-GFP ונצבעים כחיוביים לסממנים ההמטופויטיים Sca1 ו-CD45. המשך התרבית מוביל לתאים המבטאים CD45 תוך שמירה על ביטוי של הדיווח (reporter) האנושי CD34. לאחר אגרגציה של שליה, תאי התרבית מקבלים פוטנציאל קלונוגני ומייצרים מושבות במתילצלולוז המכילות מורפולוגיות המטופויטיות שונות ותאים דמויי-בלאסטים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע כל שלב באיטיות כדי למנוע בלבול. קשיים בזיהוי טעויות עלולים להתרחש עד מספר שבועות לאחר תחילת התכנות מחדש. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון בדיקות תאים יוצרי-cobblestone ובדיקות תאים יוצרי-תרביות ארוכות טווח, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם התאים שהופקו אכן בעלי תפקוד המטופואטי כפי שהודגם בבדיקות התפקודיות.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום התכנות של תאי גזע המטופואטיים לבחון אסטרטגיות תכנות מחדש ופרוטוקולי אופטימיזציה נוספים בתאי דם, תאי אנדותל וסוגי תאים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד להשרות תכנית המוגנית בפיברובלסטים של עכבר, כיצד לבצע ביטוי יתר של פקטורי שעתוק וכיצד לבצע בדיקה פונקציונלית של התא שהופק. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

reprogramming-mouse-embryonic-fibroblasts-with-transcription-factors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

וידאו זה מציג את התהליך להפקת המושרה בתאי גזע pluripotent באמצעות lentivirus ועין מתנהלת המבטאים Oct4, Sox2, c-myc ו Klf4.

יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

עכבר Stemgent DOX ועין מתנהלת TF הגדר Lentivirus ניתן לתכנת מחדש fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) הנגרמת על גזע pluripotent (שב"ס) תאים. כאן אנו מדגימים את פרוטוקול לביטוי DOX-ועין מתנהלת תכנות מחדש של העכבר גורמי תעתוק Oct4, Sox2, Klf4 ו c-myc ליצור מושבות iPS המבטאים משותף סמנים MES pluripotency.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

ניתן לתכנת מחדש פיברובלסטים עובריים של עכבר לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ביעילות נמוכה על ידי ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. המתווכים הנדירים של תגובת התכנות מחדש מבודדים FACS באמצעות תיוג עם נוגדנים כנגד יצרני פני התא Thy-1.2, Ssea-1 ו-Epcam.

טיהור מרקר פני תא בתיווך של התשומות לייצור תאי iPS מדגם אפשר לתכנת עכבר

פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה יעילה של אנדותל המוגני ואבות המטופויאטיים רב-פוטנציאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק.

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירה וכימות של תת-סוגים לבביים מגוונים שתוכנתו מחדש באמצעות אספקה מתווכת רטרו-וירוס של Gata4, Hand2, Mef2c ו-Tbx5.

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

כאן אנו מציגים שיטה חזקה לתכנת fibroblasts עובריים הראשי לתוך cardiomyocytes פונקציונלי. דרך ביטוי של GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, מיר-1, ומיר-133 (GHMT2m) לצד עיכוב של TGF-β איתות. פרוטוקול שלנו יוצרת מכות cardiomyocytes מוקדם ככל 7 ימים שלאחר התמרה חושית עם עד 60% יעילות.

דיכוי של Pro-fibrotic איתות Potentiates בתיווך גורם התכנות של העכבר מתחלקים Fibroblasts לתוך Cardiomyocytes המושרה

כאן אנו מציגים שלנו פרוטוקול עבור הפקת המושרה אבות erythroid (iEPs) מן העכבר fibroblasts למבוגרים באמצעות מונחי-פקטור שעתוק ישיר לשושלת התכנות (DLR).

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

פרוטוקול זה ממחיש את האינדוקציה של תוכנית המטוגניים בתוך הגוף האנושי פיברותקיעות על ידי ביטוי נאכף של הגורמים שעתוק GATA2, GFI1B ו-FOS כדי ליצור גזע המטפאות ובתאי קדמון.

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

אימות ניסיוני של פעילות משפר ניגש בצורה הטובה ביותר על ידי ניתוח אובדן תפקוד. מוצג כאן פרוטוקול יעיל המשתמש במחיקה בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לחקור ויסות ספציפי לאלל של שעתוק גנים בתאי F1 ES המכילים גנום היברידי (Mus musculus129 x Mus castaneus).

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

למד לתכנת מחדש פיברובלסטים עובריים בעכברים באמצעות גורמי שעתוק כדי ליצור תאי קדם המטופויטיים. שיטה זו מאפשרת ייצור HSCs ללא שלב פלוריפוטנטי ביניים ומקדמת מחקר במחלות המטולוגיות.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

גלה סרטונים נוספים