תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

המטרה הכללית של פרוטוקול השראת ההמוגניזציה זה היא לעורר תהליך התפתחותי בפיברובלסטים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של גורמי שעתוק, כדי להפיק תאי קדם המטופואטיים in vitro המייצרים תאי דם לאחר תרבית ממושכת. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום התכנות ההמטופואטי, כגון האם ניתן לפתח פרוטוקול להשגת HSCs אמיתיים de novo, המסוגלים להבדיל למספר שורות תאים ולהשתבץ ברקמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבאמצעות ביטוי יתר של סט מינימלי של גורמי שעתוק, ניתן להתחיל את תהליך ההתפתחות בתאים שעברו תכנות מחדש, ללא צורך במעבר דרך שלב ביניים פלוריפוטנטי.

לאחר גידול פיברובלסטים עובריים של עכבר או MEFS, והפקת וירוס בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו בג'לטין בריכוז 0.1 אחוז ב-PBS לציפוי מקדים של פלטות בעלות 6 בארות. ודאו שהג'לטין מכסה את כל שטח הבאר. הניחו את הפלטות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות לפחות.

לאחר מכן, הוצא את הפלטות ושאב את הג'לטין. זרע MEFs ב-DMEM סטנדרטי בצפיפות של 25, 000 תאים לבאר והשאר את התאים להשקיע ב-37 degrees celsius למשך לילה. הכן תערובת נגיפיים של 100 microliter על ידי ערבוב של 50 microliters של M2RTTA ו-12.5 microliters מכל אחד מ-GATA2, GFI1B, CFOS ו-ETV6.

שאבו את המצע מה-MEFS והוסיפו שני מיליליטרים של DMEM סטנדרטי עם 8 מיקרוגרם למילליליטר של hexadimethrine bromide. לאחר מכן, בצעו טרנסדוקציה לכל באר של MEFs באמצעות 15 מיקרוליטר של תערובת הנגיף והדגירו ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר 16 עד 20 שעות של הדגרה, החליפו את המצע בכל באר בשני מיליליטרים של DMEM סטנדרטי טרי, בתוספת של מיקרוגרם אחד למילליליטר של DOX.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שלושה ימים. ביום הרביעי, הכינו מצע תרבית המטופואטית מועשר ב-hydrocortisone, stem cell factor, MFS-related tyrosine kinase three ligand, interleukin three, interleukin six ו-DOX. לאחר מכן, שאבו את המצע מה-MEFs והשתמשו ב-1 mL של PBS לשטיפת התאים.

לאחר מכן, לאחר שאיבת ה-PBS, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.05 percent trypsin לכל באר כדי להפריד ולאסוף את התאים. השתמשו בhemocytometer לספירת התאים, затем סובבו ב-300 ×g למשך חמש דקות והשתמשו ב-12 milliliters של המצע ההמטופואטי שהוכן זה עתה כדי לסבסב את התאים. לאחר מכן, זרעו 10,000 תאים לכל באר בלוחות שש-בארים מצופים בג'לטין.

בכל שישה ימים, החליפו את המצע במצע תרבית המטופואטי משולב טרי למשך תקופת התרבית. נתחו את התאים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר הפקת שליות מעכברים ההרה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו בשניים עד חמישה מיליליטר של 0.2% collagenase type one ב-PBS עם 20% FBS כדי לשטוף את הרקמה, ובאמצעות מחט gauge 18 המורכבת על מזרק של חמישה מיליליטר, בצעו דה-אסוציאציה מכנית של הרקמה בתוך תמיסת ה-PBS.

הדגרו את תאי השילייה בשני עד חמישה מיליליטר של תמיסת קולגנאז ב-37 °C למשך 1.5 שעות. לאחר מכן, העבירו את התאים מספר פעמים דרך מחטים בכיול 20 עד 25 המותקנות על מזרקים של 5 מיליליטר כדי להמשיך בפירוק מכני שלהם. לאחר מכן, סננו תרחיפי תאים בודדים דרך מסנני תאים של 70 מיקרון.

לאחר מכן, באמצעות המוציטומטר, ספרו את התאים והקרינו ב-2,000 centigray volts לצורך אינאקטיבציה של המיטוזה. הוסיפו עשרה מיליליטר של מצע תרבית המטופואטית המועשר בתוספות הבאות לכלי תרבית בקוטר עשרה סנטימטרים. הניחו את המסנן בגודל 0.65 micron ישירות על מצע התרבית בכלי, אפשרו לו לצוף כדי ליצור ממשק נוזל-גז והניחו את הכלי בצד.

בצעו דיסוציאציה לתאי MEFs שעברו טרנסדוקציה ביום 25 כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, וערבבו 33,000 מתאי ה-MEFs שעברו טרנסדוקציה עם 167,000 תאים של אגרגטים של שליה שעברו אינאקטיבציה מיטוטית. כדי ליצור אגרגט, צנטריפוגו את תערובת תאי ה-MEF ותאי השליה ב-300 ×g למשך חמש דקות. שאבו את המדיום והשתמשו ב-30 עד 50 µL של DMEM סטנדרטי כדי להשעות מחדש את התאים שהשקיעו, תוך שאיבת תרחיף התאים הבודדים לתוך טיפ של פיפט בנפח 200 µL ללא קצה חתוך.

בשלב הבא, חסמו את קצה הפ pipette באמצעות סרט פאראפין. לאחר מכן, הכניסו את הקצה החסום לתוך מבחנה צנטריפוגית של 15 milliliter וסובבו אותה במהירות של 300 times g למשך חמש דקות, כך שייוצר משקע בקצה המכוסה של ה-pipette. הוציאו בזהירות את ה-pipette מהמבחנה של 15 milliliter והניחו אותה על קצה של pipette P200.

הסיר את סרט הפרפין והעבר את משקע התאים אל המסנן הצף בצלחת עם מצע גידול. גדל את הצברים על המסננים הצפים בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% carbon dioxide למשך ארבעה עד חמישה ימים. בעזרת גורד תאים (cell scraper), אסוף את הצברים, איחד אותם והשתמש ב-0.5% collagenase כדי לעכל אותם.

לאחר הדיסוציאציה, השתמשו בשניים עד חמישה מיליליטר של PBS עם 5% FBS לשטיפת האגרגטים, וסובבו בcenterY-צנטריפוגה ב-300 ×g למשך חמש דקות. השעיקו מחדש את האגרגטים ב-500 µL של DMEM ללא FBS, Pen-Strep או L-glutamine. הוסיפו את כל התוךSuspension לשלושה מיליליטר של מדיום עם 1% methylcellulose המועשר ב-10 ng/mL של Tepo, תוך הימנעות זהירה מיצירת בועות.

העבירו נפחים שווים של תערובת זו לשלוש צלחות תרבית לא מטופלות בגודל 35 על עשרה מילימטרים לצורך בדיקות CFU. כביקורת, גדלו אגרגטים של שליה שהוקרנו. לבסוף, ספרו את המושבות ההמטופואטיות ידנית תחת מיקרוסקופ לאחר עשרה עד 14 ימי תרבית בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% carbon dioxide.

בתהליך התכווץ תאים של MEFs ל-HSCs, התאים עוברים טרנסדוקציה של גורמי שעתוק כפי שמוצג כאן. לאחר שלושה ימים של הרחבה וחשיפה ל-DOX להפעלת הגן המועבר, התאים מופרדים, מחולקים ומגודלים על פלטות מצופות ג'לטין ובמדיום המטופבל המשלים. ביום ה-20 בתרבית, לאחר טרנסדוקציה במדיום התכווץ, MEFs מסוג 34/H2BGFP עוברים שינויים מורפולוגיים ברורים, כולל מורפולוגיה אנדותליאלית הנבדלת מזו של MEFs.

תרבית נוספת עד ליום 35 גורמת להופעתם של מספר תאים עגולים דמויי-המטופויטיים מתוך תוצרי ביניים דמויי-אנדותל, שהם חיוביים ל-GFP ונצבעים כחיוביים לסממנים ההמטופויטיים Sca1 ו-CD45. המשך התרבית מוביל לתאים המבטאים CD45 תוך שמירה על ביטוי של הדיווח (reporter) האנושי CD34. לאחר אגרגציה של שליה, תאי התרבית מקבלים פוטנציאל קלונוגני ומייצרים מושבות במתילצלולוז המכילות מורפולוגיות המטופויטיות שונות ותאים דמויי-בלאסטים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע כל שלב באיטיות כדי למנוע בלבול. קשיים בזיהוי טעויות עלולים להתרחש עד מספר שבועות לאחר תחילת התכנות מחדש. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון בדיקות תאים יוצרי-cobblestone ובדיקות תאים יוצרי-תרביות ארוכות טווח, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם התאים שהופקו אכן בעלי תפקוד המטופואטי כפי שהודגם בבדיקות התפקודיות.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום התכנות של תאי גזע המטופואטיים לבחון אסטרטגיות תכנות מחדש ופרוטוקולי אופטימיזציה נוספים בתאי דם, תאי אנדותל וסוגי תאים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד להשרות תכנית המוגנית בפיברובלסטים של עכבר, כיצד לבצע ביטוי יתר של פקטורי שעתוק וכיצד לבצע בדיקה פונקציונלית של התא שהופק. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.