Anionic פילמור של קופולימר amphiphilic עבור הכנת Micelles קופולימר בלוק מיוצב על ידי אינטראקציות הנחת π-π

המטרה הכוללת של עבודה זו היא להדגים את השלבים הקריטיים הדרושים לסנתזה של חומרי קו-פולימר בלוקים באמצעות פולימריזציה אניונית של פתיחת טבעת, ולהראות את רצף המחקרים הנדרש לניסוח מיצלה של קו-פולימר בלוקים עבור תרופה הידרופובית. פרוטוקול זה מדגים את הביצוע הנכון של השלבים וההליכים הדרושים לסנתזה של קו-פולימר בלוקים באמצעות פולימריזציה אניונית. היתרון הגדול של פולימריזציה אניונית של פתיחת טבעת הוא סנתזה של חומרים ביבול גבוה ובפיזור מולקולרי נמוך.

כמו גם את יכולת ההרחבה (scalability) של התהליך. זהו זמן מרגש עבור מערכות פולימריות להולכת תרופות, כאשר מספר תרופות המבוססות על פורמולציה ומיצלות של פולימרים בלוקיות נמצאות כעת בשלבים מאוחרים של פיתוח פרה-קליני או קליני.

הכינו את הריאגנטים ואת החומרים להעברה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. שקלו methoxypolyethylene glycol בעלות משקל מולקולרי של 5,000. הוסיפו את ה-mPEG לבקעיבוב יבש המכיל מגנט Stir bar, ואטמו את מתאם השטיפה באמצעות ספטום בחלקו העליון.

חבר את הבקבוק לסעפת, ושטוף את הבקבוק במשך שתי עד שלוש דקות בארגון. סובב את השסתום למצב ואקום כדי לשאוב את האוויר מהבקבוק. סובב את הבקבוק ידנית, ויבש את כלי התגובה באופן הומוגני, באמצעות מייבש שיער או אקדח חום, עד להמסת ה-mPEG.

לאחר דקה אחת, שברו את הוואקום על ידי סיבוב השסתום במניפולטור לעבר תנוחת ה-Argon בכמה תנועות מהירות כדי לקרר את הבקרה. שמרו את המאקרו-איניציאטור הפולימרי תחת ואקום למשך כשעתיים, ולאחר מכן תחת Argon לפני תחילת התגובה. לאחר מכן, הרכיבו שני מכשירים לזיקוק בוואקום גבוה אשר יובשו מראש בתנור תחת המנדף.

מכשיר אחד נועד לזיקוק של DMSO, ומכשיר אחד נועד לזיקוק של המונומר, phenyl glycerol ether. חברו את הבקרוקים הנפרדים לשני המכשירים, והניחו כל אחד מהם על מעטפת חימום חצי-כדורית, או בתוך אמבט שמן. חברו מים קרים לחלק העליון של כל מכשיר ולסעף.

יש לוודא שכל מכשירי המערכת מקובעים ואטומים היטב. הפעילו את הוואקום באמצעות השסתום. קבעו את החום באמצעות בקר טמפרטורה והתחילו בערבוב התמיסות.

לאחר שעתיים של זיקוק במחזור של DMSO, סגור את שסתום הוואקום הגבוה כדי לאסוף כ-20 מיליליטר של תמיסה. לאחר מכן, שחרר את הפראקציה אל הבקראק, וחזור על הפעולה פעם נוספת, כדי להבטיח את טוהר הפראקציה הרצויה שתיאסף מאוחר יותר. חמם את הבקראק המכיל את ה-mPEG תחת ואקום באמצעות אקדח חום עד להמסת הפולימר, ולאחר מכן נטרל שוב בארגון.

לאחר שעתיים, סגור את שסתום הוואקום הגבוה ואסוף את נפח הממס. הפסק את החימום ושחרר את הוואקום מהסעיף (manifold). הכנס ארגון לתא, כפי שתואר קודם לכן.

תחת לחץ חיובי של Argon, חברו צד אחד של הקנולה למשחורית מדורגת, או ישירות לבקרה המכילה את ה-mPEG, גם היא תחת Argon, וטבלו בזהירות את הקצה השני בתוך הפракציה שזווקקה זה עתה. חברו בובלר נוסף לבקרה, סגרו את זרימת ה-Argon, והשתמשו אך ורק בלחץ ה-Argon ממכשיר הזיקוק. כדי למנוע תאונות הנגרמות מלחץ ה-Argon, פתחו את ברז המעצור מזכוכית למשך אחת עד שתי שניות, וסגרו אותו שוב כדי להמשיך את זרימת ה-DMSO עד להשלמת ההעברה המלאה.

בשלב הבא, תחת זרם ארגון, חבר צד אחד של הקנולה מהמשורת המידה המיובשת, האטומית באמצעות ספטום, לתמיסת מלאי של נפתלין פוטשיום בריכוז 0.3 מולארי. לאחר מכן, הוסף בובלר נוסף למשורת המידה, סגור את זרימת הארגון אל המשורת, ותחת לחץ ארגון חיובי, העבר חמישה מיליליטרים של נפתלין פוטשיום 0.3 מולארי באמצעות קנולציה מהתמיסה למשורת המידה. הכנס מחט נוספת מהמניפולד אל המשורת, והסר את הבובלר הנוסף.

הסר בזהירות את הקנולה המחוברת לתמיסת המקור, הכנס אותה במהירות לבקבוק התגובה וחבר בבלר נוסף. לאחר מכן, כפי שתואר קודם לכן, הוסף את הבסיס טיפה אחר טיפה עד שהתמיסה תהפוך לכהה. בעקבות ההיעלמות האיטית של הצבע, הוסף מנה נוספת עד להופעת הצבע הכהה שוב, וחזור על הפעולה עד לסיום ההעברה המלאה.

כפי שתואר קודם לכן, העבירו את הנפח הרצוי של המonomer לתגובה כדי להגיע לדרגת פולימריזציה של polyphenol glycol ether של כ-18 עד 20 יחידות. השאירו את התגובה למשך 48 שעות בטמפרטורה של 80 °C, תחת אטמוספירה של Argon ובערבוב מתמיד, כדי להבטיח פולימריזציה מלאה. עצרו את התגובה על ידי הוספת טיפות של חומצה כלורית בריכוז 1N ומטנול, עד להעלמות הצבע כפי שניתן להבחין.

חלץ את הנתלן (naphthalene) מתמיסת ה-DMSO באמצעות הקסאן. הסר כ-70 מיליליטר של DMSO באמצעות זיקוק בוואקום. קראר את תמיסת הסלורי (slurry), והוסף 15 מיליליטר של THF.

הסר את המלח מתמיסת ה 슬ורי (slurry) באמצעות צנטריפוגה במהירות של 5,000 ×g למשך עשר דקות. העבר את הנוזל העליון (supernatant), והוסף אותו בטיפות ל-500 milliliters של דיאתיל אתר קר. אסוף את המשקע באמצעות סינון או צנטריפוגה.

לאחר חזרה על תהליך השקיעה פעמיים, ייבשו את המשקע בטמפרטורת החדר תחת מastateful, למשך לילה, ולאחר מכן בוואקום ב-30 °C למשך 24 עד 48 שעות, כדי להגיע לניצול של 85%. הפולימר המשותף מוכן כעת לאפיון, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. המיסו 12 mg של doxorubicin בתוך 1 mL של acetonitrile. הוסיפו 10 µL של triethylamine, והניחו לתמיסה להתערבב בחושך למשך שעתיים.

המיסו 45 מיליגרם של copolymer במיליליטר אחד של THF, וערבבו למשך אותו פרק זמן. הוסיפו את תמיסת ה-copolymer לתמיסת ה-doxorubicin, ושטפו את הבקבוק המכיל copolymer ששאר נפח נוסף של THF. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת ה-copolymer-drug טיפה אחר טיפה לבקבוק של 20 מיליליטר המכיל 15 מיליליטר של 0.9% saline תוך כדי ערבוב.

העבירו את התמיסה לשקית דיאליזה, ובצעו דיאליזה כנגד 500 milliliters של 0.9% saline. העבירו את התסנין לשפופרת של 15 milliliter וסובבו בצנטריפוגה ב-5, 000 ×g, למשך 15 דקות. לאחר מכן, העבירו את העל-נוזל למערכת אולטרה-פילטרציה המכילה ממברון דיאליזה.

הכנס את מתאם הבחישה למערכת העלטילטרציה, סגור את המכסה ופתח את זרימת החנקן. רכז את תמיסת המיצלות של הבלוק-קופולימר לנפח של ארבעה מיליליטרים, והוסף שישה מיליליטרים של סליין טרי. לאחר מכן, רכז שוב את תמיסת המיצלות של הבלוק-קופולימר ל-4 מיליליטרים, שטוף את התא עם 0.5 מיליליטרים של סליין, והוסף אותם לתמיסה.

יש לאחסן את התמיסה שהתקבלה בבקבוקונים חומים בטמפרטורת החדר ובחושך, לפני השימוש הבא. פולימריזציה אניונית של פתיחת טבעת של פניל גליצרול אתר על המאקרו-יוזם mPEG שימשה להכנת קו-פולימר דיבלוק אמפיפילי על ידי פרוטונציה עמוקה של קבוצת ההידרוקסיל של mPEG. השלב כלל שימוש בנפתלן פוטסיום כאניון רדיקלי, ולאחריו פולימריזציה של מונומר פניל גליצרול אתר.

אפיון הפולימר התגלי (block copolymer) באמצעות כרומטוגרפיית חדירה בגל (gel permeation chromatography) ואנליזת ספקטרוסקופיית NMR של פרוטונים אישרו התפלגות שקלול מולקולרי צרה, עם דרגת פולימריזציה של פניל גליסריל אתר של 15 יחידות. במדיום מימי, הפולימרים התגליים האמפיפיליים מתארגנים ליצירת מיצלות המורכבות מליבה הידרופובית המוקפת במעטפת הידרופילית. מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (Transmission electron microscopy) אישרה מורפולוגיה כדורית, ופיזור אור דינמי (dynamic light scattering) העיד על קוטר הידרודינמי של 25 nano meters.

דוקסורוביצין נכנס בהצלחה לקפסולות בתוך מיצלאים של פולימר בלוקי. בהשוואה לתרופה הפרוטונית החופשית בתמיסה, כיבוי עצמי של הדוקסורוביצין, שנצפה באמצעות ספקטרוסקופיה של פלואורסצנציה, אישר את שילוב התרופה במיצלאים הפולימריים, עם קיבולת טעינה של התרופה עד 14%. פרופיל השחרור של הדוקסורוביצין מהמיצלאים של הפולימר הבלוקי העיד על יציבות טובה של פורמולציה זו ב-pH ניטרלי, ועל שחרור ממושך של התרופה לאורך ארבעה ימים בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית.

לאחר השליטה בטכניקה זו, יוכלו מתמחים במדעי הרוקחות להכין סינתזה של קו-פולימרים די-בלוק ליישומים בהולכת תרופות. הפרוצדורה המתוארת כאן ניתנת ליישום עבור סינתזה של מגוון רחב של קו-פולימרים שבהם PEG משמש כיוזם. כאן הושם דגש על הבטחת פרקטיקות מעבדה תקינות, המספקות תנאים אנहाइडריים ומובילות לחומרים באיכות גבוהה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אני אמור להחזיק בהבנה טובה של אופן העבודה בתנאים אנहाइडריים ולהיות מסוגל ליישם שלבים אלו עבור סינתזה של פוליאסטרי PEG או חומרים של פוליאסטרי PEG. בעת ביצוע כל אחד מהמחקרים המתוארים, חיוני לזכור כי העבודה מבוצעת תחת תנאים מבוקרים, עם ממסים אורגניים שעלולים להיות מסוכנים וחומרים אחרים. יתרה מכך, כל התרופות הן רעילות ויש לטיפל בהן תוך נקיטת אמצעי הזהירות הנדרשים.

כגון, חבישת כפפות, לבישת חלוק מעבדה ונעליים סגורות, וכן חבישת מסכה בעת שבישולם שקילה של התרופות.