צמיחה נדחית Assay העיכוב לכמת את ההשפעה של antimicrobials הנגזר חיידקים על תחרות

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לבחון תחרות בין בידודים בקטריאליים שונים באופן כמותי ואיכותני. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לחקירת דחייה תחרותית בתוך קהילות חיידקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משקפת את המתרחש בקהילה בקטריאלית.

על בידודים פולשים להיות מסוגלים לשרוד את ההשפעות המעכבות של בידודים מבוססים כדי שהפלישה תהיה מוצלחת. תדגים את הפרוצדורה אמה קרנק (Emma Crank), סטודנטית לתואר מתקדם במחלקת ביולוגיה של בתי חולים. לתחילתו, הכין אגר brain heart infusion או BHI בהתאם להוראות היצרן.

יש לעקר את האגר באוטוקלאב בטמפרטורה של 121 °C בלחץ של 15 psi למשך 20 דקות. יש למזוג מנות של 15 milliliter של אגר BHI שעוקר לתוך צלחות פטרי סטריליות, ולהמתין עד שהאגר יתקשה. יש להכין ציר BHI לפי הוראות היצרן, ולהעביר מנות של 10 milliliter לבקבוקי זכוכית אוניברסליים בנפח של 28 milliliter.

לאחר מכן, עקרו את מרק ה-BHI באוטוקלאב למשך 20 דקות. להכנת בקבוקי האידור, התחילו בפירוק הבקבוקים. רססו חומר ניקוי פעיל שטח בריכוז 5% דרך האידור כדי להסיר מזהמים פנימיים.

לאחר מכן, השרו את בקבוק המאיד, המכסה והמאיד בחומר הניקוי למשך הלילה. למחרת, ייבשו את המאיד, המכסה והבקבוקים תחת תא זרימה סטרילי. לאחר מכן, מלאו את הבקבוקים ב-70%ethanol.

לאחר מכן, חברו מחדש את המאייד ורססו מעט אתונול דרכו. הניחו את המכסה על המאייד ואחסנו אותו כשבתוכו אתונול עד לשימוש. לפני השימוש, השתמשו במציר BHI סטרילי כדי לשטוף את הבקבוק באופן אספטי, ורססו את המציר דרך המאייד.

להכנת תרביות חיידקים למשך לילה, יש לבצע מריחה (streak) של זני המתחרה והמעכב על צלחת אגר BHI סטרילית, ולדגור ב-37 degrees Celsius בתנאים אירוביים למשך כ-18 שעות. בבקבוק אוניברסלי של 28 milliliter, יש להוסיף מושבה אחת של זן חיידקי המתחרה הדרוש ל-10 milliliters של ציר BHI סטרילי. יש לדגור את התרבית במנער אורביטלי אוניברסלי ב-37 degrees Celsius וב-250 RPM למשך לילה.

ביום למחרת, ודאו שפלטות האגרר יבשות לחלוטין וללא עיבוי על המכסה, כדי למנוע התפשטות של התהליל על הפלטה. העבירו בפיפטה 25 µL מהתרבית של הלילה למרכז פלטות האגרר, תוך הימנעות מלחיצה מלאה של בוכנת הפיפטה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר שעלולות להתיז את התרבית על פני האגרר. אפשרו לתרבית להתייבש בטמפרטורת החדר כדי להגביל את התפשטותה.

לאחר מכן, דגרו את צלחות האגר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתנאים אירוביים למשך הלילה. לאחר גידול תרבית למשך הלילה, בעת עבודה תחת מCב בטיחות ברמה 2 המרופד בנייר סופג, השתמשו ב-BHI broth כדי לדלל את התרבית פי עשרה, כך שיתקבלו כ-four times ten to the sixth CFU per milliliter. לאחר מכן, שפכו את התרבית המדוללת לבקבוק פלסטיק סטרילי המיועד לריסוס בישום.

לביצוע בדיקת עיכוב צמיחה נדחית, התיזו את התרבית דרך כל אחד מבקבוקי האידוי כדי להבטיח שהתרבית נטענה במנגנון הריסוס לפני ההשפרצה על האגר. ממרחק של כ-15 סנטימטרים מעל האגר, התיזו כ-250 microliters של תרבית מדוללת על פני כל שטח האגר. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתנאים אירוביים למשך הלילה.

כדי לפרש עיכוב גדילה דחוי, מדוד את אזור עיכוב הגדילה של זן המתחרה שהורסס במילימטרים, תוך הפחתת קוטרו של הנקודה המרכזית של יצרן המעכב. לבסוף, רשום את ציון הצלילות עבור אזורי העיכוב בהתאם לפרוטוקול הכתוב. כפי שמוצג בדמות זו, תוצאות הבדיקה צריכות להיות נראות כהבדל בזן המתחרה המונח מעל, בסמוך לזן יצרן המעכב שהונח במרכז.

ההבדלים יכולים להיות עיכוב מלא, עיכוב חלקי, היעדר עיכוב או קשר חיובי. גרף זה משווה בין אזורי העיכוב בין בידודים המייצרים מעכבים, מה שיכול לנבוע מכמות החומר האנטימיקרובי המיוצר, יכולת הדיפוזיה של המעכב דרך המצע, סוג המעכב המיוצר, או רמת העמידות של זן המתחרה למעכבים. דוגמה זו מראה כי אם תרבית המתחרה לבדיקה מדוללת מדי, אזור העיכוב ייראה גדול יותר ועם קצה פחות מוגדר באופן ברור מכפי שנצפה בדרך כלל.

אם נקודת זן המעכב לא יובשה לחלוטין לפני הדגירה למשך לילה, זן המעכב יתפשט ולא ייצור נקודה מוגדרת לחלוטין. לחלופין, אם זן המתחרה אינו מרושש באופן אחיד, הדבר עלול להוביל להתפשטות לא אחידה של החיידקים. לבסוף, אם זן המתחרה ריכוזי מדי, הוא עלול לגדול מעל זן המעכב ובמקרים קיצוניים להוביל להיפוך בתפקידים של זן המתחרה וזן המעכב.

לאחר השליטה בטכניקה, ביצועה יארך שעה אחת המחולקת לארבעה ימים עבור כל זוג איזולטים שנבדק. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לרסס באופן אחיד עם חזרות טובות בין הבדיקות. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשליך את נתוני העכבה על נתונים טקסונומיים בנוגע לנוכחות או היעדר של מין חיידקי בקהילה.

בשלב זה ניתן לקבוע אם השפעות מעכבות משפיעות על יכולתה של מין להתנחל בסביבה מסוימת. לאחר פיתוחה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום המיקרוביום של קהילות לבחון את ההשפעות של שונות בתכונות, כגון חיזוי של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים, על מבנה הקהילה בהדרה תחרותית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשוות את יכולתו של בידוד חיידקי אחד לעכב באופן תחרותי את הצמיחה של בידוד אחר, הן באופן איכותני והן באופן כמותי.

יש לזכור כי עבודה עם חיידקים במצב של רסס (ארוסול) עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון עבודה בתוך קבינה בטיחותית ברמה 2 (level two safety cabinet) וחבישה של ציוד מיגון אישי (PPE) מתאים.