Name: הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למד סינתזת הידרוגלים פונקציונליים עם RGD להנדסת רקמות באמצעות CuAAC ופיקוד מיקרוגל. שיטה זו משפרת את היכולת לשמור על חייות תאים בתרביות תלת-ממדיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות פרופ &#39;מאוריציו Masi לדיון פורה מיס קיארה Allegretti לעריכה השפה. מחקר &#39;מחברים נתמך על ידי Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero דלה הצדעה GR-2010- 2,312,573).

הערה: כימיקלים המשמשים כפי שהתקבלו. לינארית RGD נרכש, אבל זה יכול להיות מוכן על ידי סינתזה פפטיד שלב מוצק רגיל Fmoc 16,19. ממסים של כיתת אנליטי. הדיאליזה מחייבת שימוש קרום עם M w חתוך שווה 3,500 Da. התרכובות המסונתזות מאופייני 1 ספקטרום NMR H ונרשם על כלורופורם באמצעות ספקטרומטר 400 MHz (CDCl 3) או תחמוצת דאוטריום (D 2 O) כמו ממסים, משמרות כימיות מדווחות כערכים δ חלקים למ&#39;. יתר על כן, הידרוג חשוף ניתוח FT-IR באמצעות טכניקה גלולה KBR והאפיון הפיזי שלהם כרוך מחקרי gelation הוערכו באמצעות המבחנה ההפוכה ב 37 ° C. 1. סינתזה של 4-Azidobutanoyl כלוריד 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 500 מ&quot;ג של 4-azidobutanoic חומצה (3.90 מילימול) ב 10 מ&quot;ל של dichloromethane ו -0.5 מ&quot;ל של dimethylformamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את הפתרון ב 0 ° C, באמצעות אמבט קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 505 μl של כלוריד oxalyl (5.85 מילימול) עד ​​5 מ&quot;ל של dichloromethane ולאט לאט מוסיפים dropwise למערכת התגובה, תוך ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 ב 0 ° C באמצעות באמבט קרח, לחזור לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את המוצר הנרכש על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת המדגם ב CDCl 3 16. </li></ol> 2. סינתזה של-אזיד RGD נגזרים 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 מ&quot;ג של RGD (0.145 mmol) ב 1 מ&quot;ל של 1 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 24 מ&quot;ג 1 (0.16 מילימול) ב 2 מ&quot;ל של tetrahydrofuran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את כל הפתרון RGD כדי dropwise פתרון 1 ב 0 ° C באמצעות אמבט קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור לטמפרטורת החדר ומערבבים לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 1 M HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את OBTained המוצר על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D 2 O 16. </li></ol> 3. PAA אלקין שינוי 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 200 מ&quot;ג של 35% w / w פתרון PAA (2.8 מילימול) ב 15 מ&quot;ל מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15.4 מ&quot;ג הידרוכלוריד propargylamine (0.20 מילימול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 42.8 מ&quot;ג של מימה 1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 0.28 מילימול) ב 14 מ&quot;ל של 1: פתרון מים מזוקקים על ידי חימום עד 50 מעלות צלזיוס: 1 v / v אצטוניטריל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את כל הפתרון HOBt לפתרון PAA בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 53.6 מ&quot;ג של ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0.28 מילימול) לתערובת התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 M HCl כדי להתאים את ה- pH ל 5.5 ומערבבים מערכת התגובה הלילה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze הפתרון. ממיסים 11.2 גרם של נתרן כלורי ב 2 ליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ&quot;ל של 37% w / w HCl. Dialyze הפתרון באמצעות קרום עם M w החתוך של 3.5 kDa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> perform דיאליזה במשך שלושה ימים. שנה את הפתרון דיאליזה יומי עם 2 ליטר של מים מזוקקים מוכן טרי המכיל 0.2 מ&quot;ל של 37% w / w HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון הסופי ב -80 מעלות צלזיוס. Lyophilize אותו lyophilizer על פי הפרוטוקולים של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את הפולימר הפונקציונלי ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D 2 O 16. </li></ol> 4. סינתזה של PAA-RGD פולימר 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 78 מ&quot;ג של PAA שונה אלקין 3 (1.083 mmol) ב 10 מ&quot;ל מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 25 מ&quot;ג של הנגזר אזיד 2 RGD (0.0722 מילימול) ב 5 מ&quot;ל של tetrahydrofuran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את כל הפתרון RGD לפתרון פולימריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.2 מ&quot;ג של יודיד נחושת (0.0116 מילימול) ו -2.2 מ&quot;ג של ascorbate נתרן (0.0111 מילימול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריפלוקס את התערובת וכתוצאה מכך לילה בשעה 60 ° C, עם ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את התערובת עד 25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyzדואר הפתרון. ממיסים 11.2 גרם של נתרן כלורי ב 2 ליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ&quot;ל של 37% w / w HCl. Dialyze הפתרון באמצעות קרום עם M w החתוך של 3.5 kDa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע דיאליזה במשך שלושה ימים. שנה את הפתרון דיאליזה יומי עם 2 ליטר של מים מזוקקים מוכן טרי המכיל 0.2 מ&quot;ל של 37% w / w HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון הסופי ב -80 מעלות צלזיוס. Lyophilize אותו lyophilizer על פי הפרוטוקולים של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את המוצר הנרכש על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D 2 O 16. </li></ol> 5. פונקציונליות RGD סינתזה הידרוג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את PBS. ממיסים 645 מ&quot;ג מלח PBS ב 50 מ&quot;ל מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערבבו 40 מ&quot;ג של carbomer ו -10 מ&quot;ג של פונקציונליות PAA 4 ב 9 מ&quot;ל של PBS (שלב 5.1), בטמפרטורת החדר, עד המסה מלאה (30 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 400 מ&quot;ג של PEG לפתרון ולשמור ערבוב במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את הערבוב ולאפשר למערכת להתיישב למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 N NaOH כדי להתאים את pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד 5 מ&quot;ל של תערובת שהושג, להוסיף 25 מ&quot;ג של אבקת agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרין את המערכת עם קרינת מיקרוגל ב -500 W עד רתיחה, במשך זמן בדרך כלל בין 30 שניות ו 1 דקות, ולאחר אלקטרומגנטית לחמם עד 80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את התערובת חשופים בטמפרטורת החדר עד לטמפרטורה יורדת ל -50 מעלות צלזיוס, להוסיף 5 מ&quot;ל של PBS (שלב 5.1), על מנת לקבל פתרון ביחס של 1: יחס נפח 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 12 גלילי פלדה המכילה multiwell צלחת בקוטר של 1.1 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 500 aliquots μl מהפתרון ומניח אותם לכל גלילי פלדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר במנוחה במשך 45 דקות עד gelification מלא במערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבלונים באמצעות מלקחי נירוסטה להשיג את הידרוג. </li></ol> 6. טוען של כלי טיפולי (Drug או תאים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור steps 5.1-5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהתערובת (כבר מדינת סול) מגיעה 37 ° C, להוסיף 5 מיליליטר של התמיסה המכילה פתרון תרופה הרצוי או תרבית תאים, כדי לקבל מערכת סופית ביחס של 1: יחס נפח 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 5.9-5.12 להשיג ברשתות פולימריות עם biocompounds בפח פיזי בתוך הג&#39;ל. </li></ol> 7. אפיון הידרוג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח FT-IR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היווצרות קריש, להשרות אחד הידרוג synthetized ב 2.5 מ&quot;ל של מים מזוקקים למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מימית שבו הידרוג&#39;ל הוא שקוע ולהקפיא-יבש עם נוזלי N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרבד המדגם הידרוג&#39;ל פי טכניקה גלולה KBR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מרית מלאה KBR לתוך מרגמה אגת. קח כמות קטנה של מדגם הידרוג&#39;ל (כ 0.1-2% מסכום KBR, או רק מספיק כדי לכסות את קצה מרית) ומערבבים עם אבקת KBR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את התערובת עד שהאבקה בסדר והומוגני. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת גלולת KBR ליצירת גלולת IR. לחץ על האבקה באמצעות עיתונות מעבדה ידנית: 3 דקות ב קיבולת לחץ שווה ל 5 טון ולאחר מכן במשך 3 דקות בתפוקת לחץ של 10 טון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את הלחץ להשגת הגלולה הסופית כפי הומוגנית ושקופה במראה. הכנס גלולה לתוך מחזיק מדגם IR ולהפעיל את ספקטרום 16. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחקרים gelation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 2 מ&quot;ל צינור microcentrifuge עם 900 μl של PBS לאזן ל -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של פתרון פולימר מוכן ליצור את הידרוג&#39;ל לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הצינור ולבחון אם הג&#39;ל זורם בבית 1, 2, 5, 10 ו -20 דקות. רשום את המועד שבו הג&#39;ל אינו זורם כמו בפעם gelation. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in Regenerative Medicine.</a> Adv. Mater. 21 (32-33), 3307-3329 (2009).</li>
<li>Rossi, F., Perale, G., Papa, S., Forloni, G., Veglianese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+options+for+drug+delivery+to+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Current options for drug delivery to the spinal cord.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10 (3), 385-396 (2013).</li>
<li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell%2Fmatrix+interface+to+control+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li>
<li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+spinal+cord+by+transplantation+of+neural+stem+cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li>
<li>Khetan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation-mediated+cellular+traction+directs+stem+cell+fate+in+covalently+crosslinked+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels.</a> Nat. Mater. 12 (5), 458-465 (2013).</li>
<li>Ashley, G. W., Henise, J., Reid, R., Santi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+drug+delivery+system+with+predictable+and+tunable+drug+release+and+degradation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110 (6), 2318-2323 (2013).</li>
<li>Rossi, F., van Griensven, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Functionalization+as+a+Powerful+Tool+to+Improve+Scaffold+Performances%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Polymer Functionalization as a Powerful Tool to Improve Scaffold Performances.</a> Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2043-2051 (2014).</li>
<li>Gould, S. T., Darling, N. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+peptide+functionalized+thiol-ene+hydrogels+as+culture+substrates+for+understanding+valvular+interstitial+cell+activation+and+de+novo+tissue+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Small peptide functionalized thiol-ene hydrogels as culture substrates for understanding valvular interstitial cell activation and de novo tissue deposition.</a> Acta Biomater. 8 (9), 3201-3209 (2012).</li>
<li>Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Controlled+Photocleavage+for+the+Orthogonal+and+Sequential+Release+of+Multiple+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Controlled Photocleavage for the Orthogonal and Sequential Release of Multiple Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 52 (51), 13803-13807 (2013).</li>
<li>Larrañeta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-Assisted+Preparation+of+Hydrogel-Forming+Microneedle+Arrays+for+Transdermal+Drug+Delivery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Mater.+Eng%22%5BJournal%5D)">Microwave-Assisted Preparation of Hydrogel-Forming Microneedle Arrays for Transdermal Drug Delivery Applications.</a> Macromol. Mater. Eng. 300 (6), 586-595 (2015).</li>
<li>Cook, J. P., Goodall, G. W., Khutoryanskaya, O. V., Khutoryanskiy, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-Assisted+Hydrogel+Synthesis%3A+A+New+Method+for+Crosslinking+Polymers+in+Aqueous+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Microwave-Assisted Hydrogel Synthesis: A New Method for Crosslinking Polymers in Aqueous Solutions.</a> Macromol. Rapid Comm. 33 (4), 332-336 (2012).</li>
<li>Perale, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+drug+delivery+hydrogel+system+for+spinal+cord+injury+repair+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Multiple drug delivery hydrogel system for spinal cord injury repair strategies.</a> J. Control. Release. 159 (2), 271-280 (2012).</li>
<li>Rossi, F., Perale, G., Storti, G., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Library+of+Tunable+Agarose+Carbomer-Based+Hydrogels+for+Tissue+Engineering+Applications%3A+The+Role+of+Cross-Linkers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">A Library of Tunable Agarose Carbomer-Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications: The Role of Cross-Linkers.</a> J. Appl. Polym. Sci. 123 (4), 2211-2221 (2012).</li>
<li>Frith, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+injectable+hydrogel+incorporating+mesenchymal+precursor+cells+and+pentosan+polysulphate+for+intervertebral+disc+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An injectable hydrogel incorporating mesenchymal precursor cells and pentosan polysulphate for intervertebral disc regeneration.</a> Biomaterials. 34 (37), 9430-9440 (2013).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry%3A+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 40 (11), (2001).</li>
<li>Sacchetti, A., Mauri, E., Sani, M., Masi, M., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-assisted+synthesis+and+click+chemistry+as+simple+and+efficient+strategy+for+RGD+functionalized+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">Microwave-assisted synthesis and click chemistry as simple and efficient strategy for RGD functionalized hydrogels.</a> Tetrahedron Lett. 55 (50), 6817-6820 (2014).</li>
<li>Ossipov, D. A., Hilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28vinyl+alcohol%29-based+hydrogels+formed+by+%26%2334%3Bclick+chemistry%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(vinyl alcohol)-based hydrogels formed by &#34;click chemistry&#34.</a> Macromolecules. 39 (5), 1709-1718 (2006).</li>
<li>Truong, V., Blakey, I., Whittaker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+and+Amphiphilic+Polyethylene+Glycol-Based+Hydrogels+with+Tunable+Degradability+Prepared+by+%26%2334%3BClick%26%2334%3B+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic and Amphiphilic Polyethylene Glycol-Based Hydrogels with Tunable Degradability Prepared by &#34;Click&#34; Chemistry.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 4012-4021 (2012).</li>
<li>Hou, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+synthetic+route+for+RGD+tripeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Prep.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">New synthetic route for RGD tripeptide.</a> Prep. Biochem. Biotechnol. 36 (3), 243-252 (2006).</li>
<li>Rossi, F., Chatzistavrou, X., Perale, G., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Degradation+of+Agar-Carbomer+Based+Hydrogels+for+Tissue+Engineering+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Degradation of Agar-Carbomer Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications.</a> J. Appl. Polym. Sci. 123 (1), 398-408 (2012).</li>
<li>Mauri, E., Rossi, F., Sacchetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+drug+delivery+using+chemoselective+functionalization+of+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Tunable drug delivery using chemoselective functionalization of hydrogels.</a> Mater. Sci. Eng. C. 61, 851-857 (2016).</li>
<li>Joaquin, A., Peppas, N. A., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+Polymer+Library+for+Developing+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiac+Patches%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Hydrogel Polymer Library for Developing Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Patches.</a> Tissue Eng. Part A. 20, S55-S55 (2014).</li>
<li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+hydrogel-Nanoparticles+release+system+for+sustained+combination+therapies+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf.+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Tunable hydrogel-Nanoparticles release system for sustained combination therapies in the spinal cord.</a> Colloids Surf. B Biointerfaces. 108, 169-177 (2013).</li>
<li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 8 (24), 1128-1137 (2003).</li>
<li>Ossipov, D. A., Yang, X., Varghese, O., Kootala, S., Hilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+approach+to+functional+hyaluronic+acid+hydrogels+using+orthogonal+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Modular approach to functional hyaluronic acid hydrogels using orthogonal chemical reactions.</a> Chem. Commun. 46 (44), 8368-8370 (2010).</li>
<li>Anderson, S. B., Lin, C. C., Kuntzler, D. V., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+performance+of+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+cell-degradable+polymer-peptide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The performance of human mesenchymal stem cells encapsulated in cell-degradable polymer-peptide hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (14), 3564-3574 (2011).</li>
<li>Caron, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+three+dimensional+biomimetic+hydrogel+to+deliver+factors+secreted+by+human+mesenchymal+stem+cells+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A new three dimensional biomimetic hydrogel to deliver factors secreted by human mesenchymal stem cells in spinal cord injury.</a> Biomaterials. 75, 135-147 (2016).</li>
<li>Lee, J. W., Kim, H., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+spacer+arm+length+between+adhesion+ligand+and+alginate+hydrogel+on+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd.+Polym%22%5BJournal%5D)">Effect of spacer arm length between adhesion ligand and alginate hydrogel on stem cell differentiation.</a> Carbohyd. Polym. 139, 82-89 (2016).</li>
<li>Liu, Y., Fan, Z., Wang, Y., Yu, L. Controlled Release of Low Molecular Protein Insulin-like Growth Factor-1 through Self-Assembling Peptide Hydrogel with Biotin Sandwich Approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+Y+%22J.Biomed.+Eng%22">J.Biomed. Eng</a>. 32 (2), 387-392 (2015).</li>
</ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים והם לא קיבלו כל תשלום עבור הכנת כתב היד הזה.

השינוי שלאחר הפילמור של PAA עם חלקי אלקין ופונקציונליזציה של RGD עם קבוצת האזידים מבטיחים היווצרות קשר יציב בין הפולימר לפפטיד. ואכן, טריאזול משמש כיחידת קישור קשיחה בין אטומי הפחמן, המחוברים למיקומי 1,4 של טבעת 1,2,3-טריאזול ולא ניתן לבקע אותו הידרוליטית או אחרת. בנוסף, טריאזול קשה מאוד לחמצון ולהפחתה, בניגוד למבנים מחזוריים אחרים כגון בנזנואידים והטרוציקלים ארומטיים קשורים24. באופן זה, היכולת הכימית של מוצר PAA-RGD כמעט נעדרת בתנאי הניסוי של סינתזת הידרוג'ל. הפפטיד מושתל ברשת הפולימרית התלת-ממדית בשל אופי הק...

הידרוג הן רשתות תלת מימדי נוצר על ידי פולימרים צולבים הידרופילי, אשר הם טבעיים או סינתטיים, ואת המאופיינת במבנה תלת מימדי ייחודי. מכשירים אלו אטרקטיביים יותר ויותר בתחומי הביו-הרפואיים של אספקת סמים, הנדסת רקמות, נושאות גנים 1,2 חיישנים חכמים. אכן, תכולת המים הגבוהה שלהם, כמו גם המאפיינים rheological המכאניים שלהם להפוך אותם מועמדים מתאימים לחקות microenvironments רקמות רך ולגרום להם כלים יעילים ציטוקינים מסיסים במים או מסירת גורם גדילה. אחד לשימוש המבטיח ביותר הוא בתור ביולוגי בזריקות נושאת תאי תרכובות ביו. הידרוג עשוי לשפר הישרדות תא ואת גורלו תאי גזע מלא על ידי החזקה ודווקא מתן אותות רגולטוריות תאי גזע באופן רלוונטי פיסיולוגי, כפי שנצפה במבחנה בניסויי vivo 3,4. היתרון המוביל של זה הוא האפשרותכדי לשמור על תאים מוזרקים בתוך האזור של חיסון (in situ), הפחתת כמות התאים שמשאירה את שטח extravasates לתוך מבול הדם, נודד בכל רחבי הגוף ואיבוד יעד המטרה 5. היציבות של רשתות הידרוג&#39;ל תלת ממדי נובעת מאתרי cross-linking שלה, שהוקמו על ידי קשרים קוולנטיים או כוחות משיכה בין שרשרות הפולימר 6. במסגרת זו, כימיה סלקטיבית מאונכת להחיל שרשרות פולימר הוא כלי תכליתי מסוגל לשפר את הביצועים הידרוג&#39;ל 7. ואכן, השינוי של פולימרים עם קבוצות כימיות מתאימות יכול לעזור לספק כימי מתאים, פיזי תכונות מכאניות לשפר כדאיויות תא והשימוש בם היווצרות רקמה. באותו אופן, בין הטכניקות לטעון תאים או גורמי גדילה בתוך מטריצת ג&#39;ל, השימוש של פפטיד RGD מאפשר שיפורי הידבקות תא והישרדות. RGD הוא tripeptide מורכבשל ארגינין, גליצין וחומצה אספרטית, שהוא בלי ספק היעיל ביותר, ולעתים קרובות מועסקי tripeptide בשל יכולתה לטפל יותר קולטן הידבקות תא אחד וההשפעה הביולוגית שלה על עיגון תא, התנהגות והישרדות 8,9. בעבודה זו, הסינתזה של הידרוג הפונקציונלית RGD נלמדת במטרה בעיצוב הרשתות מאופיינות תכונות הביוכימיות מספיק עבור microenvironment תא מסבירי פנים. שימוש קרינת מיקרוגל בסינתזה הידרוג&#39;ל מציע הליך פשוט כדי למזער תגובות לוואי ולקבל שיעורי תגובה גבוהים ותשואות בתוך פרק זמן קצר יותר לעומת התהליכים התרמיים הקונבנציונליים 10. שיטה זו אינה דורשת צעדים טיהור והתשואות הידרוג&#39;ל סטרילית בשל אינטראקציות של פולימרים והיעדר ממיס אורגני במערכת התגובה 11. לכן, היא מבטיחה באחוזים גבוהים של RGD צמוד רשת הפולימרים כי אף modifications נדרש הקבוצות הכימיות פולימר המעורבים ביצירת ג&#39;ל. קבוצות carboxyl, מן PAA ו carbomer, וקבוצות הידרוקסיל, מ PEG ו agarose, להצמיח את המבנה התלת-ממדי הידרוג&#39;ל באמצעות תגובה polycondensation. הפולימרים ציינו משמשים לסינתזה של הידרוג בטיפולים תיקון פגיעה בחוט השדרה 12. התקנים אלה, כפי שדווח קודם עובד 13,14, להראות התאמה ביולוגית גבוהה, כמו גם תכונות מכניות physicochemical הדומים לאלו של רקמות חיות רבות בטבע thixotropic. יתר על כן, הם נשארים מקומי באתרו, על אזור ההזרקה. בעבודה זו, קבוצות carboxyl PAA הם שונים עם מחצית אלקין (איור 1), וכן תרכובת RGD-יזיד הוא מסונתזת ניצול תגובתיות של קבוצת מסוף tripeptide -NH 2 עם תרכובת כימית מוכנה עם מבנה (CH 2) n - N 3 (&lt;strong&gt; איור 2). כתוצאה מכך, PAA השונה מגיב עם נגזר RGD-יזיד הקלקה CuAAC התגובה 15-17 (איור 3). שימוש זרז נחושת (I) מוביל לשיפורים משמעותיים בשני קצב התגובה ואת רגיוסלקטיביות. התגובה CuAAC נעשה שימוש נרחב סינתזה אורגנית ב מדע הפולימרים. הוא משלב יעילות גבוהה וסובלנות גבוהה הקבוצות הפונקציונליות, וזה מושפע שימוש בממסים אורגניים. סלקטיביות גבוהה, זמן תגובה מהיר הליך טיהור פשוט לאפשר הקניית פולימרי כוכב, קופולימרים לחסום או שרשרות השתלת moieties רצוי 18. האסטרטגיה לחץ זה מאפשר לשנות פולימרים לאחר פילמור להתאים אישית את מאפייני physicochemical בהתאם ליישום ביוכימיים הסופי. תנאי ניסוי CuAAC הם לשחזור בקלות (התגובה היא לא רגישה למים, ואילו חמצון נחושת עלול להתרחש מינימאלי), והמהותtriazole נוצר מבטיח יציבות של המוצר. השימוש מתכת נחושת יכול להיחשב נקודה קריטית, עקב השפעה רעילה הפוטנציאל שלה נגד תאים והן במיקרו-סביבה ביולוגית, אבל דיאליזה משמש כשיטה טיהור כדי לאפשר פינוי מוחלט של שאריות קטליטי. לבסוף, PAA שונה RGD משמש סינתזה הידרוג&#39;ל (איור 4) ואת מאפייני physicochemical של רשתות וכתוצאה נחקרות, על מנת לבדוק את הפונקציונליות הפוטנציאל של מערכות אלה כנשאים תאים או סמים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig1.jpg" /> איור 1: PAA שונה סינתזה אלקין סכימה של functionalization PAA עם קבוצת אלקין;. &quot;n&quot; מציין את מונומרים עם קבוצת carboxyl מגיבים עם propargylamine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig2.jpg" /> איור 2:.. סינתזה-יזיד RGD הסינתזה של נגזרי RGD-יזידו <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig3.jpg" /> איור 3: לחץ תגובת תכנית תגובה קליק בין נגזרת RGD-יזיד ו-PAA אלקין.. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig4.jpg" /> איור 4: הידרוג&#39;ל synthesis. הליך סינתזת הידרוג&#39;ל פונקציונלי RGD. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>תמיסת פולי (חומצה אקרילית) ממוצעת Mw ~ 100,000, 35 wt% ב-H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>523925</td><td>CAS 9003-01-4</td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) 2,000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84797</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Carbomeer 974P</td><td>Fagron</td><td>1387083</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen Corp.</td><td>16500-500</td><td>UltraPure</td></tr><tr><td>Agarose RGD פפטיד</td><td>ab142698</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-חומצה אזידובוטנואית</td><td>Aurum</td><td>Pharmatech Z-2421</td><td>&nbsp; CAS 54447-68-6</td></tr><tr><td>אוקסליל כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>O8801</td><td>CAS 79-37-8</td></tr><tr><td>פרופרג'ילמין הידרוכלוריד 95%</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P50919</td><td>CAS 15430-52-1</td></tr><tr><td>נחושת (I) יודיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>3140</td><td>CAS 7681-65-4</td></tr><tr><td>נתרן אסקורבט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Y0000039</td><td>CAS 134-03-2</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות ספקטרום</td> <td>ממברנה דיאליזה</td>, בע"מ<td>132725</td><td>Spectra/Por 3 ממברנת דיאליזה&nbsp; צינורות RC סטנדרטיים MWCO: 3.5 kD</td></tr></tbody></table>

הסינתזה של rgd פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

השימוש בפולימרים כביו-חומרים סיפק יתרונות משמעותיים ביישומים טיפוליים. בפרט, האפשרות לשנות ולתפקד שרשראות פולימרים עם תרכובות המסוגלות לשפר תאימות ביולוגית, תכונות מכניות או כדאיות תאים מאפשרת תכנון של חומרים חדשים כדי לעמוד באתגרים חדשים בתחום הביו-רפואי. עם אסטרטגיות הפונקציונליזציה של הפולימרים, כימיית הקליק היא כלי רב עוצמה לשיפור תאימות התאים ותכונות העברת התרופות של מכשירים פולימריים. באופן דומה, הצורך הבסיסי של הביו-רפואה להשתמש בכלים סטריליים כדי למנוע תופעות לוואי שליליות פוטנציאליות, כגון רעילות או זיהום של הסביבה הביולוגית, מעורר עניין גובר באסטרטגיה בסיוע מיקרוגל.
השילוב של כימיית קליק ושיטה בסיוע מיקרוגל מתאים לייצור הידרוג'לים תואמים ביולוגית עם פונקציות רצויות וביצועים משופרים ביישומים ביו-רפואיים. עבודה זו נועדה לסנתז הידרוג'לים מתפקדים RGD. RGD (חומצה ארגינילגליצילספרטית) הוא טריפפטיד שיכול לחקות חלבוני הידבקות תאים ולהיקשר לקולטנים על פני התא, וליצור מיקרו-סביבה מסבירת פנים לתאים בתוך הרשת הפולימרית התלת-ממדית של ההידרוג'לים. פונקציונליזציה של RGD מתרחשת באמצעות תוספת ציקלו-דו-קוטבית של Huisgen 1,3. חלק מקבוצות הקרבוקסיל של PAA משתנות עם חלק אלקין, בעוד ש-RGD מתפקד עם חומצת אזידו כשאריות הסופיות של רצף הפפטידים. לבסוף, שני המוצרים משמשים בתגובת לחיצה מזורזת נחושת כדי לקשר לצמיתות את הפפטיד ל-PAA. פולימר שונה זה משמש עם קרבומר, אגרוז ופוליאתילן גליקול (PEG) לסינתזה של מטריצת הידרוג'ל. המבנה התלת מימדי נוצר עקב תגובת אסטריפיקציה הכוללת קבוצות קרבוקסיל מקבוצות PAA וקרבומר והידרוקסיל מאגרוז ו-PEG באמצעות עיבוי פולי בסיוע מיקרוגל. היעילות של מנגנון הג'לציה מבטיחה רמה גבוהה של פונקציונליזציה של RGD. בנוסף, ההליך להעמסת תרכובות טיפוליות או כלים ביולוגיים בתוך רשת פונקציונלית זו הוא פשוט מאוד וניתן לשחזור.

נגזר אלקין PAA הוא מסונתז ביעילות מחומצת polyacrylic ו propargylamine, כפי הראה באיור 1 כאשר n תוויות את מונומרים אשר קבוצות carboxyl מגיבים עם אמין. זהות המוצר אושר על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR. איור 5 מראה 1 ספקטרום H-NMR של PAA שונה עם אג&quot;ח משולש. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig5.jpg" />...

אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של הידרוג'לים מתפקדים RGD כמכשירים להעברת תאים ותרופות. ההליך כולל תוספת ציקלו-אזיד אלקין-אזיד מזורזת נחושת (CuAAC) בין חומצה פוליאקרילית ששונה באלקין (PAA) ונגזרת RGD-אזיד. ההידרוג'לים נוצרים באמצעות עיבוי בסיוע מיקרוגל ונחקרים תכונותיהם הפיזיקוכימיות.

הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לסנתז הידרוגלים ליישומים של הנדסת רקמות בצורה פשוטה מאוד. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות, כגון האפשרות לשמר חיוניות תאיים גבוהה במערכות תרבית תאים תלת-ממדיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבזכות תגובה מהירה, ניתן לשנות בקלות מערכות הידרוגלים כדי לשפר את יכולתן לשמר את חיוניות התאים.ההשלכות של טכניקה זו משתמעות לטיפול בפגיעות בחוט השדרה, מכיוון שהתאים שנטענו בתוך הפיגום יכולים לשקם את הרקמה הפגועה. שיטה זו עשויה לספק תובנות משמעותיות לגבי טיפולים תאיים כרפואה רגנרטיבית והשלכותיהם במתודולוגיות רבות. ניתן להשמיש אותה גם במספר מערכות אחרות, כגון עצם, לב וסחוס.כדי לסנתז את נגזרת ה-RGD-azide, המיסו 50 milligrams של RGD במיליליטר אחד של sodium hydroxide בריכוז one molar. לאחר מכן, המיסו 24 milligrams של 4-azidobutanoyl chloride בשני מיליליטרים של tetrahydrofuran. הוסיפו את כל תמיסת ה-RGD לתוך תמיסת ה-4-azidobutanoyl chloride בטמפרטורה של zero degrees Celsius באופן טיפתי.החזירו לטמפרטורת החדר וערבבו למשך לילה. הוסיפו 1 mL של HCl בריכוז 1 M. הסירו את הממס בתנאי ואקום באמצעות אידור סיבובי (rotary evaporator).אפיינו את המוצר שהתקבל באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית של פרוטונים, על ידי המסת הדגימה במי דאוטריום או D2O. לביצוע המודיפיקציה של ה-PAA לאלקין, המיסו 200 מיליגרם של תמיסת PAA בריכוז 35% משקל ב-15 מיליליטר של מים מזוקקים. הוסיפו 15.4 מיליגרם של propargylamine hydrochloride.לאחר מכן, המיסו 42.8 milligrams של HOBt ב-14 milliliters של תמיסת acetonitrile ומים מזוקקים ביחס של אחד לאחד על ידי חימום ל-50 degrees Celsius. הוסיפו את כל תמיסת ה-HOBt לתמיסת ה-PAA בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 53.6 milligrams של EDC לתערובת התגובה.השתמש ב-HCL בריכוז one molar כדי לכוונן את ה-PH ל-5.5 וערבב את מערכת התגובה למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, המס 11.2 grams של sodium chloride בשני ליטרים של מים מזוקקים. ולאחר מכן הוסף 200 microliters של 37%weight by weight HCL.בצעו דיאליזה לתמיסה באמצעות ממברנה עם סף משקל מולקולרי של 3.5 kilodaltons. בצעו את הדיאליזה במשך שלושה ימים. החליפו את תמיסת הדיאליזה מדי יום בשני ליטרים של מים מזוקקים שהוכנו טריים ומכילים 200 µL של 37%weight by weight HCL.יש לאחסן את התמיסה הסופית בטמפרטורה של 80- °C. יש לאפיין את הפולימר הפונקציונלי באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית של פרוטונים (¹H NMR), תוך המסת הדגימה ב-D2O. כדי לסנתז את פולימר ה-PAA-RGD, המיסו 78 mg של PAA modified alkine ב-10 mL של מים מזוקקים.לאחר מכן, המיסו 25 milligrams של נגזרת ה-RGD-azide בחמישה milliliters של tetrahydrafuran. הוסיפו את כל תמיסת ה-RGD לתמיסה הפולימרית. לאחר מכן, הוסיפו 2.2 milligrams של copper iodide.ו-2.2 milligrams של sodium ascorbate. חממו את התערובת שהתקבלה בריפלקס למשך לילה בטמפרטורה של 60 °C תוך כדי ערבוב. צננו את התערובת ל-25 °C.כדי לבצע דיאליזה לתמיסה, המיסו 11.2 גרם של sodium chloride בשני ליטרים של מים מזוקקים והוסיפו 200 µL של HCl בריכוז 37% משקל למשקל. בצעו את הדיאליזה במשך שלושה ימים. החליפו את תמיסת הדיאליזה מדי יום בשני ליטרים של מים מזוקקים שהוכנו טריים ומכילים 200 µL של HCl בריכוז 37% משקל למשקל.לאחר מכן, הניחו את התמיסה הסופית בטמפרטורה של 80°C-. אפיינו ואחסנו את פולימר ה-PAA-RGD שהתקבל באופן שבו בוצע עבור מרכיביו. ערבבו 40 mg של carbomer ו-10 mg של PAA הפונקציונלי ב-9 mL של phosphate-buffered saline בטמפרטורת החדר עד להמסה מלאה.הוסיפו 400 milligrams של PEG לתמיסה והמשיכו בערבוב למשך 45 דקות. הפסיקו את הערבוב והמתינו 30 דקות עד שהמערכת תשקע. לאחר מכן, השתמשו בנתרן הידרוקסיד בריכוז one molar כדי לכוון את ה-PH ל-7.4.לחמישה מיליליטר של התערובת שהתקבלה, יש להוסיף 25 מיליגרם של אבקת agarose. יש להקרין את המערכת בקרינת מיקרוגל בהספק של 500 וואט למשך 30 שניות עד דקה אחת, עד לרתיחה. ולאחר מכן, יש לחמם את התמיסה באופן אלקטרומגנטי ל-80 מעלות צלזיוס.השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר עד שטמפרטורתה תירד ל-50 °C. לאחר מכן, הוסיפו 5 mL של PBS כדי לקבל תמיסה ביחס נפחי של 1:1. הכינו פלטה של 12 בארות המכילה גלילי פלדה בקוטר של 1.1 cm.קחו אליקוטים של 500 µL מהתמיסה והעבירו אותם לכל גליל פלדה. השאירו את הפלטה במצב מנוחה למשך 45 דקות עד להג'לציה מלאה של המערכת. הוציאו את הגלילים באמצעות פינצטה מפלדת אל-חלד כדי לקבל את ההידרוג'לים.ראה את הפרוטוקול הכתוב לאפיון התכונות הפיזיקו-כימיות של ההידרוג'לים הפונקציונליים עם RGD. Carbomer 974P, PAA-RGD ו-PEG, יחד עם אגרוז, משתתפים בפוליקונדנסציה סטטיסטית אקראית לאחר הקרנה במיקרוגל. קבוצות הידרוקסיל המצויות ב-PEG ובאגרוז מגיבות עם קבוצות קרבוקסיל הנמצאות ב-Carbomer 947P וב-PAA-RGD ליצירת הידרוג'לים מסוג ACPEG-RGD.בבחינת התכונות הראולוגיות, נמצא כי מודול האגירה גבוה בערך בסדר גודל אחד ממודול האיבוד, דבר המעיד על חומר אלסטי יותר מאשר צמיגי. יתרה מכך, ניתן לראות בבירור כי בערכי מאמץ נמוכים, התנהגות ההידרוג'ל נשלטת על ידי המודול האלסטי. מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת מראה את המורפולוגיה של דגימת הידרוג'ל עם פונקציונליזציית RGD ושל הידרוג'ל ללא פונקציונליזציה.שני ההידרוג'לים חשפו כי הם בעלי מבנה שזור מאוד של נקבוביות מקושרות, כאשר חלק מהנקבוביות הגדולות מכילות נקבוביות קטנות ורשתות סיביות על דפנות הנקבוביות. תכונות דומות אלו מעידות כי נוכחות של RGD אינה משנה את רשת הפולימר. לאחר פיתוח זה, סללה טכניקה זו את הדרך למחקר בתחום הנדסת הרקמות כדי לבחון את היציבות של מערכות תרביות תאים אלו במספר מחלות אחרות.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע פונקציונליזציה להידרוגלים, במטרה לשפר את יכולתם לשמר תאי גזע חיוניים.

the-synthesis-rgd-functionalized-hydrogels-as-tool-for-therapeutic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Bioprinter שימש ליצירה הידרוג דוגמת המבוסס על תבנית עולה. עובש poloxamer היה backfilled עם הידרוג'ל שני ולאחר מכן eluted, ומשאיר חללים שהיו מלאים בידרוג'ל שלישי. שיטה זו משתמשת elution המהיר וטוב של printability poloxamer לייצר ארכיטקטורות מורכבות מbiopolymers.

הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D

בסרטון זה ידגים שיטה מהירה, יעילה לmethacrylate פולי (אתילן גליקול), המאפשר polymerizations שרשרת וסינתזת הידרוג'ל. זה ידגים כיצד להציג את פונקציות methacrylamide דומות לפפטידים, שיטות אנליטיות נפוצות פרטים כדי להעריך את יעילות functionalization, לספק הצעות לפתרון בעיות ושינויים מתקדמים, ולהדגים טכניקות אפיון הידרוג'ל טיפוסיות.

Functionalization בסיוע מיקרוגל של פולי (אתילן גליקול) ופפטידים על השרף לשימוש בPolymerizations שרשרת וגיבוש Hydrogel

אנו מתארים תהליך רציף להיווצרות בתיווך אור ודפוס ביוכימי לאחר מכן של מטריצות הידרוג'ל סינתטיות ליישומי תרבית תאים תלת מימדיים. מודגמת בנייה ושינוי של הידרוג'לים עם כימיה של פוטו-קליק תואם ציטו. בנוסף, מוצגות טכניקות קלות לכימות והתבוננות בדפוסים וקביעת כדאיות התאים בתוך הידרוג'לים אלה.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

פרוטוקולים מתוארים להרכבת מתכלה thermoresponsive hydrogels מבוסס על hydrazone cross-linking של oligomers פולימריים על הסולם בתפזורת, microscale, ו ננו, והשני עבור הכנת ג'ל חלקיקים והן nanofibers.

בדיית Thermoresponsive Hydrogels מתכלה-פיסיקליות מרובים באמצעות שחול תגובתי, מיקרופלואידיקה, הרכבה עצמית, Electrospinning

שיטות שונות כדי לתפעל אדריכלות תלת מימדי המבוסס על חלבון hydrogels מוערכים פה לגבי תכונות החומר. הרשתות macroporous הן functionalized עם פפטיד תא-דבק, הכדאיות שלהם בתרבות תא מוערך באמצעות שתי שורות תאים מודל שונה.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

בשיטה זו, אנו משתמשים photopolymerization, לחץ על כימיה טכניקות ליצירת דפוסים חלבון או פפטיד על פני השטח של hydrogels פוליאתילן גליקול (PEG), מתן מתאושש אותות ביו לצורך המחקר של תגובות הסלולר במבחנה .

תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

המודלים הנוכחיים של תרבות bilayer אינן מאפשרות לימודים פונקציונלי במבחנה המחקים ויוו microenvironments. שימוש בפוליאתילן גליקול שיטה תבניות תחמוצת אבץ, פרוטוקול זה מתאר את התפתחות קרום המרתף ביונים ודק במיוחד עם נוקשות tunable, נקבוביות, והרכב ביוכימי המחקה באופן הדוק ויוו מטריצה חוץ-תאית.

תרבית תאים זגוגית אלסטי Porated Hydrogels כמו קרום המרתף ביונים עבור כפול

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה והניסוח של ביו-חומרים הידרוג'ל הידרוג'ל להזרקה, סופראמולקולריים (PNP). יישומים של חומרים אלה לאספקת תרופות, ייצוב ביופארמה, אנקפסולציה של תאים ואספקה מודגמים.

הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות

הפרוטוקול המוצג כאן מראה סינתזה של ג'לטין הידרוג'ל דביק חזק o-nitrosobenzaldehyde (ג'לטין-NB). לג'לטין-NB יכולת היצמדות מהירה ויעילה של רקמות, שיכולה להוות מחסום פיזי חזק להגנה על משטחי פצעים, ולכן הוא צפוי להיות מיושם בתחום הביוטכנולוגיה לתיקון פציעות.

סינתזה של הידרוג'ל דבק חזק, ג'לטין O-Nitrosobenzaldehyde

במאמר זה אנו מציגים שני פרוטוקולים להטמעת תגובות סינתזת חלבונים נטולי תאים במטריצות הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו ללא צורך בפאזה נוזלית חיצונית.

שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים בקנה מידה מאקרו

למד סינתזת הידרוגלים פונקציונליים עם RGD להנדסת רקמות באמצעות CuAAC ופיקוד מיקרוגל. שיטה זו משפרת את היכולת לשמור על חייות תאים בתרביות תלת-ממדיות.

הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

גלה סרטונים נוספים