ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

המטרה הכללית של הליך זה היא למנות את תדירות התאיים הגזעים העצביים באוכלוסייה נתונה באמצעות השורה של יצירת נוירוספירות (neurospheres) ודיפרנציאציה בתנאים קלונליים. לשיטה זו ישנם שימושים מרכזיים בתחום התאים הגזעים העצביים, כגון הערכה של סממנים מועמדים לתאים גזעים עצביים, טהרות של תאים גזעים עצביים והבחנה בין תאים גזעים עצביים לבין תאי אב עצביים (neural progenitors). יתרונותיה של שיטה זו הם משך ביצוע של 13 ימים, זמן קצר יותר מהשיטות הנוכחיות למניית תדירות תאים גזעים עצביים, והעובדה שהיא מבוצעת בתנאים קלונליים.

כדי להתחיל בנוהל זה, ביום הראשון, הכינו מצע גידול ל-NSC על ידי שילוב של מצע DMEM F12 עם B27, EGF, BFGF, ופניצילין סטריפטומייסין. לאחר מכן, בצעו דיסוציאציה של נוירוספירות עכבר E14.5 במיליליטר אחד של מצע גידול ל-NSC ובמיליליטר אחד של Sodium Hydroxide בריכוז 0.05 normal למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את התאים בעזרת פיפטה למעלה ולמטה מדי פעם כדי לשמור אותם בסספנסיון, ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של חומצה הידרוכלורית בריכוז 0.05 normal כדי לנטרל את הבסיס.

לאחר מכן, בצעו ספירת תאים באמצעות צביעה ב-trypan-blue והמציטומטר. לאחר מכן, זרעו תאי נוירוספירה בודדים של עכבר בשלב E14.5 בצפיפות של 50 תאים למילליטר או פחות, ב-100 microliters של מדיום גידול ל-NSC בתוך פלטת 96 באריים. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, ו-5%CO2 למשך שבוע כדי להפיק נוירוספירות קלונאליות.

על מנת לגדל נוירוספרות עבור המצע המותנה, ביום השלישי יש לפרק נוירוספרות של עכבר בשלב E14.5 ולזרע את התאים הבודדים בריכוז של 20,000 תאים למיליליטר ב-10 מיליליטר של מצע גידול NSC בצלחת תרבית של 10 סנטימטרים. לאחר מכן, יש לדגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך חמישה ימים כדי להפיק נוירוספרות בגידול המוני. ביום השמיני יש להכין את תמיסת הציפוי על ידי ערבוב של 700 מיקרוליטר של 0.01% poly-L-lysine, 70 מיקרוליטר של laminin בריכוז של 1 מיליגרם למיליליטר ו-6,230 מיקרוליטר של PBS.

בשלב הבא, השקיעו צלחת תרבית של 10 סנטימטר באמצעות שבעה מיליליטר של תמיסת poly-L-lysine laminin למשך שעתיים ב-37 degrees Celsius. בעזרת פיפט סרולוגי של 10 מיליליטר, העבירו את כל הנוירוספירות שגודלו במסה למבחנה קונית של 15 מילימטר לצנטריפוגה. סבבו את הנוירוספירות בצנטריפוגה ב-171 times g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והסִירו את הנוזל העליון לחלוטין.

לאחר מכן, הכין מצע דיפרנציאציה ל-NSC על ידי שילוב של מצע DMEM F12 עם B27 ו-FBS. הוסף 10 מיליליטר של מצע דיפרנציאציה ל-NSC אל הנוירוספירות ובצע פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לתלה מחדש את הנוירוספירות. לאחר מכן, שאב את ה-poly-L-lysine laminin מתוך כלי התרבית בן ה-10 סנטימטרים ושטוף פעם אחת עם 10 מיליליטר של PBS.

העבירו את כל הנוירוספירות לצלחת תרבית בעלת קוטר 10 סנטימטר מצופה ב-poly-L-lysine laminin, והדגירו אותן למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 כדי לאפשר לנוירוספירות להיקשר לצלחת. ביום השמיני, ספרו תחת מיקרוסקופ את מספר הנוירוספירות שנוצרו בכל באר, ולאחר מכן צפו כל באר של זכוכית כיסוי עם 50 בארות (50 well chambered cover slip) באמצעות 10 µL של תמיסת ציפוי poly-L-lysine laminin למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הכינו שלוש מבחנות צנטריפוגה קוניות של 50 מיליליטר, המכילות כל אחת 30 מיליליטר של PBS.

הוציאו באמצעות פינצטה סטרילית את כיסוי הזכוכית בעל 50 התאים המצופה, טבלו את כיסוי הזכוכית בשפופרת הראשונה של PBS, לאחר מכן בשנייה, ואז בשפופרת השלישית של PBS כדי לשטוף את תמיסת הציפוי. לאחר מכן, שאבו כל נוזל שנותר מהתאים של כיסוי הזכוכית. העבירו בעדינות את כל המצע והנוירוספרים מכל תא בצלחת בעלת 96 תאים לצלוחית תרבית אחת בקוטר 10 סנטימטרים.

ודאו שרק נוירוספירה אחת נבחרת בכל פעם על ידי הגדרת עמודת הפיפטה לשני מיקרוליטרים; תחת המיקרוסקופ, בחרו דגימה של נוירוספירה באמצעות מיקרו-פיפטה P10 המצוידת בקצה פיפטה של 10 מיקרוליטרים. ניתן לבחור את הנוירוספירות תחת המיקרוסקופ, בתוך מנדף זרימה למינרית, או על גבי משטח עבודה. לאחר מכן, העבירו את הנוירוספירה למרכזו של באר בכיסוי זכוכית בעל 50 תאים מצופה.

חזור על הפרוצדורות עד שכל באער של כיסוי הזכוכית בעל התאים יכיל נוירוספירה. לאחר מכן, הוסף 10 µL של מצע דיפרנציאציה ל-NSC לכל באער בכיסוי הזכוכית בעל התאים. הנח את כיסוי הזכוכית בעל התאים בתוך צלחת תרבית של 10 cm.

ניתן להניח עד שתי זכוכיות כיסוי בעלות תאיים (chambered cover slips) בתוך צלחת של 10 סנטימטרים. טפטפו PBS לאורך דפנות הצלחת כדי למנוע התייבשות של מצע ההבדלה של תאי NSC. דגרו את זכוכיות הכיסוי בעלות התאים במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2.

ביום התשעה, העבירו את המצע המותנה מהנוירוספירות שגודלו במסה לצמיג centrifuge קוני בנפח 15 milliliter. באמצעות מזרק סטרילי של 20 milliliter, העבירו את המצע המותנה דרך מסנן של 0.2 micrometer כדי להסיר תאים או שיירי תאים. לאחר מכן, העבירו את המצע המותנה המסונן בחזרה לצCלחת התרבית של 10 centimeter.

לאחר מכן, בעזרת פינצטה סטרילית, הניחו בעדינות את כיסוי הזריקה (chambered cover slip) על המצע המותנה באופן הפוך, כך שנוירוספירות הדגימה פונות כלפי מטה. דגרו את כיסוי הזריקה למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 37 °C ו-5%CO2. ביום ה-12, הסירו בעדינות את כיסוי הזריקה מתוך צלחת התרבית בנפח 10 סנטימטר בעזרת פינצטה סטרילית.

טבול בעדינות את לוכסנית הכיסוי ב-PBS כדי לשטוף את המצע המותנה. לאחר מכן, קלף את אטם הסיליקון מלוכסנית הכיסוי; בצע זאת בעדינות ובאיטיות כדי למנוע את שבירת לוכסנית הכיסוי. שים לב לצד שבו דבקו הנוספירות (neurospheres) המובחנות.

לאחר מכן, טפטפו 1 mm של 4% paraformaldehyde על פיסת סרט פראפין שנגזרה לגודלו של לית סטיפ (cover slip). הניחו בעדינות את הלית סטיפ על סרט הפראפין כאשר הנוירוספירות פונות כלפי מטה ובמגע עם ה-paraformaldehyde, וקבעו (fix) את הנוירוספירות למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בשלב זה, נוירוספירות בודדות נבחרו ועברו דיפרנציאציה בלית סטיפ עם 50 תאים למשך שלושה ימים.

זוהי תמונה מייצגת של נוירוספירה טריפוטנטית שצבעה ב-dapi וצבעה אימונוהיסטוכימית עבור GFAP, TUJ1 ו-O4. תמונה זו מראה את חפיפת הצביעות של dapi, GFAP, TUJ1 ו-O4. פרוטוקול זה משמש להערכת היכולת של LeX, סמן ידוע עבור NSC, להעשיר את אוכלוסיית ה-NSC. גרף זה מציג את אחוזי הנוירוספירות העניפוטנטיות, הביפוטנטיות והטריפוטנטיות שנוצרו על ידי תאים חיוביים ל-LeX ותאים שליליים ל-LeX. תאים חיוביים ל-LeX מייצרים באופן מובהק יותר נוירוספירות טריפוטנטיות מאשר תאים שליליים ל-LeX.

טבלה זו מראה כי שכיחות ה-NSC של תאים חיוביים ל-LeX ותאים שליליים ל-LeX חושבה כמכפלה של NFU ואחוז ה-neurospheres הטריפוטנטיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לתרבת ולהבדיל neurospheres בתנאים קלונאליים כדי להעריך את שכיחות התאי הגזע העצביים. בעת ביצוע שיטה זו, חשוב להשתמש במצעי גידול ובידול שהוכנו טרי ובתמיסת ציפוי שהוכנה טרי, כדי להבטיח תנאי גידול ובידול אופטימליים עבור ה-neurospheres.

לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע שיטה זו תוך 13 ימים, זמן קצר יותר בהשוואה לשיטות הנוכחיות לספירת שכיחות תאי גזע עצביים. ניתן להשתמש בשיטה זו לצד שיטות נוכחיות, כגון בדיקת תאי מושבה עצביים (neural colony forming cell assay), כדי להעשיר תאי גזע חדשים יותר ולזהות סמן מובהק לתאי גזע עצביים.