Name: ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: למדו ספירת תדירות תאי גזע עצביים באמצעות יצירת משובטים והבדלה בתנאים קלונליים. שיטה זו מסייעת להערכת סמנים וטיהור תאי גזע עצביים בתוך 13 ימים בלבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר (A * STAR), סינגפור למימון מחקר זה.

הטיפול של בעלי חיים בוצע בהתאם להנחיות IACUC ו NACLAR ואושר על ידי מח&#39; בעלי החיים ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11). הערה: תרבויות neurosphere הוכנו מן המוח הקדמי של עוברי (E14) C57BL / 6 עכברים כפי שתוארו לעיל 5. 1. תרבות של Neurospheres לדוגמא המשובט (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני צמיחת המל&quot;ל ידי שילוב F-12 המזון הבינוני / נשרי Modified של Dulbecco (DMEM / F12) בינוני עם תוסף B27 (ריכוז סופי: 1x), EGF (ריכוז סופי: 20 ng / mL), bFGF (ריכוז סופי: 10 ng / מ&quot;ל) ו פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוז סופי: 1x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק neurospheres העכבר E14.5 ב 1 מדיום הגידול מ&quot;ל המל&quot;ל 1 מ&quot;ל 0.05 N סודיום הידרוקסיד עבור 7 דקות ב RT. תאים פיפטה מעלה ומטה מדי פעם כדי לשמור על התאים בתרחיף. הוסף 1 מ&quot;ל של 0.05 N חומצה הידרוכלורית כדי נייטרליize אלקלי. הערה: תאים neurosphere הם זורעים ב -20,000 תאים / מ&quot;ל בצלחת תרבות 10 ס&quot;מ והם בתרבית למשך 5 ד ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. התשואה הצפויה לאחר כ -10 מיליון תאים לכל צלחת 10 ס&quot;מ. תאים אלה הם ניתקו אז זורעים בצפיפות משובטת כמתואר בשלבי 1.2 ו -1.3, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו ספירת תאים באמצעות מכתים Trypan כחול hemocytometer. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים neurosphere העכבר E14.5 זרע בודד בצפיפות של 50 תאים / מ&quot;ל ​​או מתחת 100 מדיום הגידול μL המל&quot;ל בצלחת 96-היטב. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 1 w כדי ליצור neurospheres המשובט. הערה: Clonality מובטח במהלך היווצרות neurosphere בצפיפות זה כמו התאים לא קשר אחד לשני. </li></ol> 2. תרבות של Neurospheres עבור בינוני אלף (יום 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק neurospheres העכבר E14.5 כמתואר בשלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בודדים זרע מ- E14.5 neurospheres העכבר בצפיפות של 20,000 תאים / מ&quot;ל ​​במדיום הגידול 10 מ&quot;ל המל&quot;ל בצלחת תרבות 10 ס&quot;מ. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 ד לייצר neurospheres תרבותי בתפזורת. </li></ol> 3. הכנת neurosphere אוויר בינוני (יום 8) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הציפוי על ידי ערבוב 700 μL של 0.01% פולי- L- ליזין (PLL), 70 μL של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Laminin ו 6230 μL של בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל צלחת תרבות 10 ס&quot;מ עם 7 מ&quot;ל של תמיסת PLL / Laminin עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ&quot;ל, להעביר את כל neurospheres תרבותי בתפזורת צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה neurospheres בעמ &#39;171 XG דקות 1 ב RT ולהסיר את supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני בידול המל&quot;ל ידי שילוב בינוני DMEM / F12 עם B27 (ריכוז סופי: 1x) ו עוברי שור סרום (FBS) (ריכוז סופי: 0.5%) מודעותד 10 מ&quot;ל של מדיום בידול המל&quot;ל neurospheres. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי resuspend neurospheres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PLL / Laminin מצלחת תרבות 10 ס&quot;מ ולשטוף פעם עם 10 מ&quot;ל PBS. להעביר את כל neurospheres אל PLL / Laminin מצופה תרבות צלחת 10 ס&quot;מ. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור neurospheres לדבוק המנה. </li></ol> 4. קביעת nfu של המדגם Neurospheres (יום 8) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת neurospheres (זורע ביום 1; סעיף 1) יצרה בכל טוב תחת מיקרוסקופ. הערה: לקבוע את מספר neurospheres שנוצר ל -100 תאים מצופים, אשר נותן את nfu. </li></ol> 5. העברת Neurospheres לדוגמא 50-היטב תאיים Coverslip (יום 8) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל היטב בכל coverslip תאיים 50-היטב עם 10 μL של פתרון הציפוי PLL / Laminin עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: כן פתרון ציפוי כמתוארצעד 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3 x 50 צינורות צנטריפוגה חרוטי מ&quot;ל המכיל 30 מ&quot;ל של PBS לכל. בעזרת מלקחיים סטריליות, להסיר את coverslip 50-היטב התאי המצופה. טובלים את coverslip תאיים לתוך הצינור הראשון של PBS, ואחריו השני ואז הצינור השלישי של PBS, לשטוף את פתרון הציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוף כל נוזל הנותר מן הבארות של coverslip התאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה כל בינוניות neurospheres מבאר כל המנה 96-היטב ולהעביר אותו אל צלחת תרבות אחת 10 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ, לבחור neurosphere מדגם באמצעות micropipette P10 מצויד עם קצה פיפטה 10 μL. ודא שרק neurosphere יחיד נקלט בכל פעם על ידי הגדרת העמודה פיפטה 2 μL. השתמש קצה פיפטה חדש עבור כל neurosphere. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את neurosphere על גבי במרכז באר של coverslip 50-היטב התאי המצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 5.5 ו -5.6 עד היטב כל conta coverslip התאיins neurosphere. הערה: neurospheres ניתן לאסוף תחת מיקרוסקופ להציב במנדף זרימה למינרית או על benchtop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של המל&quot;ל בינוני בידול זה טוב של coverslip התאי. מניח את coverslip התאי בצלחת תרבות 10 סנטימטרים פיפטה PBS לאורך הקצוות של המנה כדי למנוע התייבשות של מדיום הבידול המל&quot;ל. הנח עד שני coverslips החדרים ב תרבות צלחת אחת 10 ס&quot;מ. דגירת coverslip התאי (כלול צלחת תרבות 10 סנטימטרים) הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 6. בידול של Neurospheres לדוגמא (יום 9) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את בינוני בידול מן neurospheres תרבותי בתפזורת (מסעיף 3) לצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ&quot;ל. ודא 2-3 מ&quot;ל של מדיום בידול נשאר בצלחת התרבות כדי למנוע מתאי דבקה מן ניתוק. באמצעות מזרק 20 מ&quot;ל סטרילי, להעביר את בינוני בידול באמצעות 0.2 μמ &#39;מסנן כדי להסיר את כל התאים או פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את בינוני הבידול המסונן בחזרה את מנת תרבות 10 סנטימטרים המכילה את התאים הדבקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, מקום coverslip תאי בעדינות על בינוני הבידול באופן הפוך כזה כי neurospheres המדגם פונה כלפי מטה. דגירת coverslip תאי עם מדיום הבידול עבור 3 ד ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הערה: neurospheres המדגם נמצא בקשר עם מדיום הבידול אך לא במגע עם תאי המבדילים מתחת. </li></ol> תיקון 7. של הבדיל Neurospheres (יום 12) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את coverslip התאי מצלחת תרבות 10 סנטימטרים באמצעות מלקחיים סטרילית. בעדינות לטבול את coverslip לתוך PBS כדי לשטוף את המדיום המותנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף את אטם סיליקון מן coverslip. בצע זה בעדינות ובאיטיות כדי למנוע את שבירת coverslip. שימו לב בצד שבו הneurospheres דואר הבדיל הם דבקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של 4% paraformaldehyde (PFA) על פיסת לחתוך סרט פרפין לגודל של coverslip. בעדינות במקום coverslip על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם PFA. תקן את neurospheres במשך 20 דקות ב RT. זהירות: PFA הוא רעיל הוא בצורת נוזל אד והוא דליק. הימנע משאיפת אדי ומגע עם העור והעיניים. תמיד טפלו PFA במנדף מאוורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של PBS על גבי פיסת הסרט פרפין. שטפו את neurospheres על ידי הנחת coverslip בעדינות עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 7.4 פעמים נוספות. </li></ol> 8. O4 הכתמה של הבדיל Neurospheres (יום 12) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ב- PBS. פיפטה 1 מ&quot;ל של BSA 3% על פיסת הסרט פרפין. חסום את neurospheres ידי בעדינות placing coverslip (עם neurospheres פונה כלפי מטה) במגע עם BSA למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של נוגדן IgM אנטי-O4 העכבר (1: 300 דילול ב BSA 3%) על פיסת הסרט פרפין המקום coverslip על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם הנוגדן. אפשר מכתים O4 להתרחש במשך 2 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslip פעמים עם PBS כמתואר בשלב 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של נוגדנים משני מצומדות-אנטי עכבר צבע פלואורסצנטי ירוק IgM (1: 500 דילול ב BSA 3%) על פיסת הסרט פרפין המקום coverslip על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם נוגדן . השאר למשך 1 שעות ב RT בחושך. הערה: בצע immunostaining להיערך לצילום בסביבה חשוכה משלב זה ואילך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslip פעמים עם PBS כמתואר בשלב 7.4. </li></ol> 9. Tuj1 וחלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) מכתיםשל הבדיל Neurospheres (יום 12) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן permeabilizing פתרון על ידי הוספת טריטון-X 100 (ריכוז סופי: 0.5%) ל- BSA 3%. פיפטה 1 מ&quot;ל של permeabilizing הפתרון על חתיכת סרט פרפין. מניחים coverslip על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם הפתרון permeabilizing במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslip פעמים עם PBS כמתואר בשלב 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של העכבר אנטי Tuj1 נוגדן 2a IgG (1: 500 דילול ב BSA 3%) ו ארנב נגד GFAP נוגדן IgG (1: 1,000 דילול של BSA 3%) על פיסת coverslip הסרט ומקום פרפין על סרט הפרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם הנוגדנים. אפשר Tuj1 מכתים GFAP להתרחש במשך 2 שעות ב RT. הערה: שני נוגדנים ניתן להכין כפתרון יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslip פעמים עם PBS כמתואר בשלב 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מ&quot;ל של צבע פלואורסצנטי אדוםמצומדות-אנטי עכבר 2a IgG (1: דילול 500 BSA 3%) ו צבע פלואורסצנטי אדום רחוק IgG מצומדות-נגד ארנב (1: 500 דילול ב BSA 3%) נוגדנים משני על פיסת סרט והמקום פרפין coverslip על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם נוגדנים. השאר למשך 1 שעות ב RT. הערה: שני נוגדנים ניתן להכין כפתרון יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslip פעמים עם PBS כמתואר בשלב 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פתרון מניות 300 ננומטר ב PBS. פיפטה 1 מ&quot;ל של DAPI על פיסת הסרט פרפין coverslip מקום על הסרט פרפין עם neurospheres פונה כלפי מטה במגע עם DAPI עבור 2 דקות ב RT עבור מכתים גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslip פעם עם PBS פעמיים עם מים ללא יונים כמתואר בשלב 7.4. הר coverslip בשקופית זכוכית באמצעות הרכבה בינונית מתאים ולאפשר לו להתייבש O / N ב RT. </li></ol> 10. אמאגינג של הבדיל Neurospheres (יום 13) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> neurospheres תמונה תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות 40X. השתמש לייזרים ב 488 ננומטר, 594 ננומטר 647 ננומטר לזהות oligodendrocytes, הנוירונים האסטרוציטים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אחוז unipotent, neurospheres bipotent ו tripotent. הערה: און נקבע על פי היכולת של neurosphere להתמיין שלוש השושלות העצביות - oligodendrocytes, נוירונים האסטרוציטים 5,14,15,26. Oligodendrocytes מזוהה מכתים חיובי עבור O4 (סעיף 8). נוירונים מזוהים מכתים חיובי עבור Tuj1 (סעיף 9). האסטרוציטים מזוהים מכתים חיובי עבור GFAP (סעיף 9). Neurosphere unipotent מתבדל רק אחד השושלת צריך להכתים חיובי לאף O4, GFAP או Tuj1. Neurosphere bipotent מתבדל כל שני שושלות וצריך להכתים חיובי עבור O4 ו GFAP או O4 ו Tuj1 או GFAP ו Tuj1. Tripotent neurosphere שונהiates לכל שלוש שושלות וצריך להכתים חיובי עבור O4, GFAP ו Tuj1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע תדירות המל&quot;ל באוכלוסייה של עניין באמצעות הנוסחה הבאה: תדירות המל&quot;ל = (% x nfu של neurospheres tripotent) / 100%. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The culture of neural stem cells.</a> J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).</li>
<li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+Population+Analyses+Demonstrate+That+an+EGF-Responsive+Mammalian+Embryonic+CNS+Precursor+Is+a+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell.</a> Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).</li>
<li>Narayanan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+mRNA+Profiling+Identifies+Progenitor+Subclasses+in+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres.</a> Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+human+central+nervous+system+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of human central nervous system stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).</li>
<li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LeX%2Fssea-1+Is+Expressed+by+Adult+Mouse+CNS+Stem+Cells%2C+Identifying+Them+as+Nonependymal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal.</a> Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).</li>
<li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LeX+is+expressed+by+principle+progenitor+cells+in+the+embryonic+nervous+system%2C+is+secreted+into+their+environment+and+binds+Wnt-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1.</a> Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).</li>
<li>Corti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+neural+stem%2Fprogenitor+cells+based+on+Prominin-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression.</a> Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).</li>
<li>Nagato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+characterization+of+neural+stem+cells+by+flow+cytometry+analysis+using+a+combination+of+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers.</a> J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).</li>
<li>Kim, M., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Populations+of+Forebrain+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+Can+Be+Isolated+Using+Side-Population+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis.</a> J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).</li>
<li>Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+neural+stem+cells+in+the+developing+and+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain.</a> J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).</li>
<li>Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+pluripotent+neural+stem+cell+from+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain.</a> Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).</li>
<li>Tham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSPG+Is+a+Secreted+Factor+that+Stimulates+Neural+Stem+Cell+Survival+Possibly+by+Enhanced+EGFR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling.</a> PLoS ONE. 5 (12), e15341(2010).</li>
<li>Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ApoE+as+an+autocrine%2Fparacrine+factor+that+stimulates+neural+stem+cell+survival+via+MAPK%2FERK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway.</a> J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).</li>
<li>Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+survival+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell survival factors.</a> Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).</li>
<li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+neural+stem+cell+self-renewal%2C+growth+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation.</a> Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Neural+Stem+Cells+Reside+into+the+Rostral+Extension+and+Olfactory+Bulb+of+Adult+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents.</a> J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+and+Fibroblast+Growth+Factors+Behave+as+Mitogenic+Regulators+for+a+Single+Multipotent+Stem+Cell-Like+Population+from+the+Subventricular+Region+of+the+Adult+Mouse+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).</li>
<li>Vescovi, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cloning+of+multipotential+stem+cells+from+the+embryonic+human+CNS+and+establishment+of+transplantable+human+neural+stem+cell+lines+by+epigenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation.</a> Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).</li>
<li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural-Colony+Forming+Cell+Assay%3A+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (49), e2639(2011).</li>
<li>Louis, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony-Forming+Cell+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observational+examination+of+aggregation+and+migration+during+early+phase+of+neurosphere+culture+of+mouse+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells.</a> J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li>
<li>Yu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+Visualization%2C+and+Molecular+Signature+of+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells.</a> Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).</li>
<li>Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYu%2C+YH+%22Identification+of+mouse+embryonic+neural+stem+cell+surface+markers%22">Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers</a>. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).</li>
<li>Tham, M. Neural colony-forming cell assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTham%2C+M+%22A+role+for+chondroitin+sulfate+proteoglycan+in+regulating+the+survival+and+growth+of+neural+stem+cells%22">A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells</a>. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Surface+Marker+Signatures+for+the+Isolation+of+Neural+Stem+Cells%2C+Glia+and+Neurons+Derived+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Are+Markers+of+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells.</a> Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

אנו מתארים הי הספירה של NSCs בתנאים משובטים. צעדים קריטיים לכלול את השימוש של מדיום גידול והבחנה טרי המל&quot;ל, וגם שימוש פתרון PLL / Laminin מוכן טרי כדי לצפות את coverslips התאי, כמו גם את כלי התרבות. הדבר מבטיח תנאי גידול והתמיינות אופטימליים של neurospheres. שימוש נוגדנים באיכות טובה כדי לאתר את הנוירונים גליה ביעילות, כמו גם לקטיף סלקטיבית של neurospheres משובט כי אינם באים במגע עם neurospheres אחר, הם קריטיים. יתר על כן, חשוב להבטיח את neurospheres הרים לא להתייבש. מומלץ להוסיף 10 μL של מדיום בידול זה טוב לאחר קטיפתם כל 10 neurospheres. חשוב להשתמש coverslip אחד החדרים ב צלחת אחת 10 ס&quot;מ לדגימה להימנע הצטלבות בין neurospheres ממדגמים שונים. אם שני coverslips (כל neurospheres המכיל בין מדגמים שונים) ממוקםאותו 10 ס&quot;מ צלחת, neurospheres מ coverslip אחד יכול לשחרר גורמים שעשויים לשנות את הנטייה של neurospheres ב coverslip אחרים להתמיין שושלות ספציפיים. שני coverslips באותה 10 ס&quot;מ צלחת עשויה גם לגרום בלבול בין דגימות. במקרה ש nfu או תדירות המל&quot;ל נמוך מהמצופה, להבטיח כי neurospheres מספר מעבר נמוך משמשים. כמו כן, חשוב כי neurospheres מעבר נמוך הבריא משמש להפקה בינונית מותנה. לאחר מכן, אם neurospheres מתורבתים בבארות עם קוטר קטן, כגון בצלחת 96-היטב, אז זה יהיה קשה לתמרן ולבחור neurospheres באמצעות micropipette. במקרה זה, להעביר את neurospheres לצלחת תרבות גדולה, כגון צלחת 6-היטב, לפני לקטוף. חלק מן neurospheres ההרים עשוי להמריא מן coverslip התאי במהלך תרבות immunostaining. צמצום התנועה של coverslip התאי במהלך התרבות, לשטוף אינטנסיבי פחותing במהלך immunostaining, יעזור למנוע ניתוק של neurospheres. מחקרים ראשוניים לכמת NSCs רק באמצעות NFA 7,11,13. עם זאת, NFA מגזים בהערכת תדירות המל&quot;ל הן NSCs ו NPS מוקדם ליצור neurospheres 5. לואיס ואח &#39;. פיתח שיטה אחרת לכמת NSCs המכונה NCFCA 21,22. NCFCA כרוכה culturing תאים בודדים במטריצה ​​מבוססת קולגן כדי להבטיח clonality, וזה היה מראה כי neurospheres מעל 2 מ&quot;מ קוטר נוצרים על ידי NSCs בלבד. בדומה NCFCA, clonality מובטחת בכל פרוטוקול זה. זו מושגת על ידי יצירת neurospheres בצפיפות משובטת ובידול neurospheres ב coverslips התאי. השימוש התאי coverslips מקנה מספר היתרונות. את coverslip התאי מאפשר לכל neurosphere מדגם להבדיל מבלי מגע פיזי עם neurospheres מדגם אחר, ובכך להבטיח clonality במהלך התמיינות.את coverslip התאי ניתן למקם מושעה על מדיום הבידול לאפשר neurospheres המדגם להיות מותנה ברציפות כדי להבטיח בידול מקסימאלי. בהעדר בינוני בסרום המותנה במהלך התמיינות, הישרדות של neurospheres פוחתת neurospheres בעיקר ליצור האסטרוציטים (Tham M ואחמד S, לא פורסם). בנוסף, neurospheres immunostained ניתן לאחסן בנוחות תקופה ארוכה ואת coverslips התאי יכול להיות מותקן ישירות על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ. בנוסף, הדמיה של neurospheres immunostained נעשתה קלה כאחד יכול במהירות לאתר את neurosphere הקטן תאי היטב, ללכידת תמונה, ולהמשיך הלאה אל באר הבא. קבענו את התדירות המל&quot;ל בתרבות neurosphere עכבר E14.5 הוא באמצעות הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה 27 ו NCFCA 28. תדירות המל&quot;ל neurospheres העכבר E14.5 נקבע על ידי שני ליthods ניתן להשוואה. NCFCA מונה NSCs כי הם מולטיפוטנטיים יש יכולת התחדשות עצמית לטווח ארוך. מאז תדירות המל&quot;ל מן השיטה שלנו דומה לזו מן NCFCA, את קריאת נתוני הפרוטוקול שלנו לא נראתה להעריך את התדירות המל&quot;ל. NCFCA דורש שלושה שבועות להסתיים וכולל בעיקר ציפוי תא ומילוי בינוני. הפרוטוקול המתואר כאן דורש 13 ימים כדי לבצע וכרוך סדרות שונות של צעדים, למשל, קטיף neurosphere ו immunostaining. פרוטוקול זה יכול לשמש ככלי עזר אלטרנטיבה למנות NSCs. חוקרים יכולים להשתמש בשני NCFCA ופרוטוקול זה כדי לאמת תדירות המל&quot;ל בדגימות שלהם. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי שורה של צעדים חשובים צריכה להיות כל שבוצעו ביום 8. הכנת הבינוני המותנה, קביעת nfu של neurospheres מדגם, והעברת neurospheres מדגם coverslip 50-היטב התאי צריך להיות שבוצע על דהy 8. אפשר לקחת את הזמן כדי להשלים את השלבים הבאים. בנוסף, זה דורש תרגול כדי לבצע שלבים אלה בצורה יעילה. Neurospheres היה בשימוש נרחב כדי ללמוד לתפקד והתנהגות המל&quot;ל. עם זאת, neurospheres מורכב הן של NSCs ו NPS. לפיכך, חשוב להעשיר NSCs מן neurospheres ללמוד ביולוגיה המל&quot;ל. נכון לעכשיו, סמנים פני תא, רכוש הדרה לצבוע כמו גם גודל תא גרעיני שמשו להעשיר עבור NSCs 6,7,9-13,29,30. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לכמת את העשרת NSCs ידי סמני פוטנציאל המל&quot;ל, וכדי להקל על החיפוש אחר סמן המל&quot;ל מוחלט. ארבעה מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו בפרוטוקול זה למנות תדירות המל&quot;ל 5,14,15,26.

תאי גזע עצביים (NSCs) הם תאים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שיכול עצמי לחדש והם multipotent. NSCs המפורט הראשון במהלך ההתפתחות של המוח הקדמי העוברי ולהמשיך להתמיד במוח הבוגר בבית לאזורים ספציפיים כגון אזור subventricular (SVZ) של החדרים לרוחב ואת gyrus המשוננת (DG) של ההיפוקמפוס. מספר קווי המל&quot;ל נמצא בשימוש בניסויים קליניים לטיפול בשבץ ומחלות נוירולוגיות אחרות כמו מחל 1 של באטן. NSCs ואת אבות עצביים (NPS) מופצים בתרבות צף מבנים אליפטית 3 ממדים שנקראים neurospheres. מערכת תרבות neurosphere פותחה על ידי ריינולדס וייס בתחילת 1990, כאשר הם מצאו כי תאי קליפת מוח עובריים ומבוגרים יכולים לחלק בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו גורם גדילה פיברובלסטים בסיסית (bFGF) 2-4. Neurospheres מורכב תערובת הטרוגנית של גאמות הכולל subclasses בשלבים התפתחותיים שונים 5. זה מאתגר במיוחד ללמוד NSCs באמצעות נתונים המתקבלים neurospheres בשל נוכחותם של צירופים. לפיכך, חשוב להעשיר NSCs מן neurospheres. כיום, ארבע שיטות עיקריות שימשו להעשיר עבור NSCs במבחנה. הראשון הוא השימוש סמנים פני התא. לואיס-X (לקס) ו CD133 (הידוע גם בשם Prominin1) הם פני התא הבולט המל&quot;ל סמני 6-9. Syndecan-1, Notch-1 ו integrin-beta1 הם חלבונים משטח אחר המעשירים עבור NSCs 10. השני הוא הדרה לצבוע. הוכח כי התאים האוכלוסייה בצד, אשר יש את היכולת הייחודית לשאוב את צבע פלואורסצנטי ה- DNA מחייבת Hoechst 33342, מועשרים עבור NSCs 11. השלישי הוא השימוש של מיון המורפולוגי. הוכח כי תאים עם גודל תא גדל גרעיניות נמל יותר NSCs מאשר עמיתיהם 5,12,13. הרביעית היא תוספת של המל&quot;ל suגורמי rvival עד בינוני התרבות. הוכח בנוסף לזה של proteoglycan כונדרויטין סולפט אפוליפופרוטאין E משפר הישרדות המל&quot;ל ובכך מגביר המל&quot;ל תדירה 14,15. למרות סמנים רבים, כולל גורמי שעתוק נקשרו NSCs 16,17, אף אחד הסמנים האלה מסוגלים להעשיר NSCs לטוהר. בשל חוסר סמנים המל&quot;ל סופיים, זה עדיין מהווה אתגר לכמת NSCs ולהבחין ביניהם לבין צירופים במבחנה. מחקרים ראשוניים השתמשו assay היווצרות neurosphere (NFA) לכמת NSCs 7,11,13. ב assay זה, תאים ניתקים הם מתורבתים כדי ליצור neurospheres ומספר neurospheres שנוצר עבור כל 100 תאים מצופים נקבע. ערך זה נקרא כמו יחידת גיבוש neurosphere (nfu). Nfu שווה את תדירות המל&quot;ל אם כל neurospheres לנבוע NSCs. עם זאת, ניתן היה לראות כי nfu מגזים בהערכת תדירות המל&quot;ל כפי neurospheres נוצרות על ידי שני NSCs ותחילת צירופים 5. לפיכך, אין זה מדויק למנות NSCs מבוססת אך ורק על היווצרות neurosphere. זה יכול להיות אפשרי לכמת NSCs מבוסס על יכולתם עצמית לחדש, להתרבות בהרחבה וליצור neurospheres multipotent. NSCs, שהן EGF ו bFGF תגובה, בדרך כלל לשרוד במשך עשרה קטעים לפחות ובכך להציג יכולת התחדשות עצמית נרחבת בתרבות 4,18-20. צירופים, שהן EGF ו bFGF תגובה וכן, יכול גם ליצור neurospheres במשך כמה קטעים אבל לא במשך תקופה ארוכה של זמן. מכאן, זה כבר מקובל כי NSCs בתום לב אפשר למנות בדייקנות הוגנת מבוסס על היווצרות neurosphere במשך עשרה קטעים לפחות. במרבית המחקרים, לעומת זאת, התחדשות עצמית נמדד בדרך כלל מבוסס על היווצרות neurosphere שניוני ושלישוני בשל הזמן ניסיוני הרב הנדרש במשך עשר קטעים. לפיכך, NFA המשני יכול לשמש רחב להשוות את הימור יכולת התחדשות העצמיתאוכלוסיות Ween, אבל לא ניתן להשתמש בהם כדי למנות תדירות המל&quot;ל במדויק. NSCs יש יכולת שגשוג גדולה לעומת צירופים. מאפיין זה של NSCs שימש לואי ואח &#39;. לפתח assay עבור ספירה המל&quot;ל - את assay תא מושבת יוצרים העצבי (NCFCA) 21,22. ב assay זה, תאים בודדים בתרבית למשך 3 שבועות במטריצה ​​חצי קשה המכיל קולגן. בתנאי התרבות אלה, זה היה מראה כי תאי יוצרי neurospheres מעל 2 מ&quot;מ קוטר הם tripotent ויכולים עצמי לחדש לטווח ארוך. תאים אלה מוגדרים NSCs. לכן, NSCs נבדלים באופן יעיל מפני צירופים. NSCs יש את היכולת להתמיין האסטרוציטים, oligodendrocytes נוירונים. לבידול של neurospheres, גורמי גדילה יוסרו בסרום מתווסף בינוני התרבות. אם כל שלוש השושלות עצביות הם נצפו בתוך neurosphere, ואז התא שיזם כי neurosphere iזה המל&quot;ל. עם זאת, assay הבידול יש מספר מגבלות. ראשית, תנאי התרבות המשמשים לבידול לא יכולים להיות אופטימליים עבור דור של השלוש כל השושלות העצביות. למעשה, בתהליך התמיינות יחיד neurosphere, מוות של תאים משמעותי מתרחש בעיקר הדור astrocyte מתרחשת (Tham M ואחמד S, לא פורסם). שנית, יש את הנושא של clonality. עבור ספירה מדויקת של NSCs, היווצרות והבחנה של neurospheres צריכה להתבצע בתנאים משובטים, כאשר כל neurosphere עולה מתא בודד. בתרבויות ההשעיה בתפזורת, צבירה מתרחשת הן ברמות הסלולר neurosphere 23-25. לפיכך, זה אפשרי עבור כל neurosphere לנבוע מספר תאים או neurospheres, אשר מסבך ספירת neurosphere והערכת multipotency. הראיות אחרונות עולות כי צבירה של תאים אינה מתרחשת בצפיפות ציפוי נמוכה של 0.5 תאים / μL או מתחת, וכאשר צלחות תרבות אינן מועברות במהלך neurosphere היווצרות 15. לפיכך culturing תאים בצפיפות נמוכה כזה יבטיח clonality. נכון לעכשיו, NCFCA היא השיטה הנפוצה ביותר להבחין NSCs מ צירופים ולפקידה תדירות המל&quot;ל. NCFCA, לעומת זאת, דורש זמן רב יחסית של שלושה שבועות. כאן אנו מתארים פרוטוקול למנות תדירות המל&quot;ל מבוססת על היכולת של NSCs לגבש neurospheres multipotent. פרוטוקול זה לוקח רק 13 ימים כדי לבצע. NCFCA מבטיח clonality כמו מטריקס קולגן מונע תנועה של neurospheres. תנאי התרבות להשתמש בפרוטוקול זה גם מאפשרים clonality כדי להישמר לאורך. למשל, השימוש 50-היטב תאי coverslips מבטיח כי neurospheres יבדיל בלי קשר לזה. יתר על כן, אנו משתמשים מותנים בינוניים המספקים גורמי neurotrophic במהלך התמיינות מנת למקסם את הפוטנציאל של בידול neurospheres (איור 1).

<table><tbody><tr><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"ל&nbsp;</td><td>צינורות</td> צנטריפוגה חרוטיים <td>BD 352096</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל&nbsp;</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>מזרק סטרילי 20 מ"ל&nbsp; &nbsp;</td><td>מזרק סטרילי BD</td><td>300141</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל&nbsp;</td><td>BD</td><td>300144</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-Tuj1 IgG2a נוגדן</td><td>Covance</td><td>MMS-435P-100</td><td></td></tr><tr><td>ארנב נגד GFAP IgG נוגדן</td><td>Dako</td><td>Z033401</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר&nbsp;</td>מיקרוסקופ <td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>המותאם למכסה זרימה למינרית&nbsp;</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>Marienfeld-superior</td><td>1000200</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-O4 IgM נוגדן&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100-F</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים זרימה למינארי</td><td>NuAire</td><td>NU-543</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחות תרבית</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ&nbsp;</td><td>NUNC</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>סרט פרפין</td><td>Parafilm</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס אנושי (EGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי רקומביננטי (bFGF)&nbsp;</td><td>פפרוטק</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ומיקרו; מסנן M&nbsp;</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534-K</td><td></td></tr><tr><td>0.45 ומיקרו; m מסנן</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555-K</td><td></td></tr><tr><td>1.0 N נתרן הידרוקסיד (NaOH)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>1.0 N חומצה הידרוכלורית (HCl)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין (PLL)&nbsp;</td><td>אבקת Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>אבקת אלבומין סרום בקר רעיל (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים עם 50 תאים&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7735</td><td></td></tr><tr><td>צלחת ערבוב עם פונקציית חום&nbsp;</td><td>סטיוארט</td><td>UC152</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 בינוני</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>1x פוספט חוצץ מלח ללא Ca2+ ו-Mg2+ (DPBS)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר נוגדן IgM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 נוגדן IgG נגד עכבר IgG2a</td><td>נוגדן Thermo Fisher Scientific</td><td>A21135</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 נוגדן IgG נגד ארנב</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה לתרבית תאים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; RT1 75002383</td><td></td></tr><tr><td>פסטר פיפטות</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>10006021</td><td></td></tr><tr><td>CO2 אינקובטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאוורר אדים מכסה מנוע</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שואב</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td>קונפוקלי</tr><tr><td>מיקרופיפטות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קצות</td><td></td><td></td><td></td>מיקרופיפטות</tr><tr><td>פיפטות פלסטיק פיפטות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>רב ערוציות</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>זכוכית</tr><tr><td>מלקחיים סטריליים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מד</td><td></td><td></td><td></td> pH</tr></tbody></table>

ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

תאי גזע עצביים (NSCs) יש את היכולת עצמית לחדש וליצור השושלות העצביות העיקריות השלוש - האסטרוציטים, נוירונים oligodendrocytes. NSCs ואת אבות עצביים (NPS) מתורבתים נפוץ במבחנה כמו neurospheres. פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לקבוע את התדירות המל&quot;ל באוכלוסיית תא נתונה בתנאים משובטים. הפרוטוקול מתחיל עם הזריעה של התאים בצפיפות המאפשרת דור neurospheres המשובט. Neurospheres מועבר לאחר מכן coverslips התאי בדיל בתנאים משובטים במדיום מותנה, אשר ממקסם את פוטנציאל הבידול של neurospheres. לבסוף, תדירות המל&quot;ל מחושבת על בסיס יכולות היווצרות multipotency neurosphere. כלי עזר של פרוטוקול זה כולל את הערכה של סמנים המל&quot;ל המועמד, טיהור של NSCs, ואת היכולת להבחין NSCs מ צירופים. שיטה זו אורכת 13 ימים כדי לבצע, וזה של הרבהhorter מאשר השיטות הקיימות למנות תדירות המל&quot;ל.

השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להעריך את היכולת של לקס, סמן המל&quot;ל פני התא ידוע 7, כדי להעשיר את NSCs. נתונים ממחקר זה ישמש כדי להמחיש כיצד NSCs הם המנויים באמצעות מבחני המשובטים בפרוטוקול. תאי neurosphere עכבר E14.5 הודגרו עם נוגדן אנטי לקס. כתוצאה מכך, התאים המבטאים לקס (לקס +) ותאי כי אינם מבטאים לקס (LEX -) היו זורעים ב 50 תאים / מ&quot;ל ידי הקרינה המופעל מיון תאים (FACS) והשאיר ליצור neurospheres המשובטים עבור 1 wk. זמן לשגות הדמיה מראה כי neurospheres שנוצר ב 50 תאים / מ&quot;ל הם משובט (איור 2). Nfu עבור לקס + ולקס - תאים נקבע. זה מוצג שלקס + יש תאים יכולת היווצרות neurosphere גבוה משמעותית לעומת לקס - תאים (3g איור). Neurospheres שנוצר אז הובדלובתנאים משובטים, ובהמשך immunostained הדמיה (e-איור 3 א). תאים לקס + ליצור באופן משמעותי יותר neurospheres tripotent מ לקס - תאים (3F איור). תדירות המל&quot;ל מכן חושבה על nfu ו-% של neurospheres tripotent (3g איור). בחירה המבוססת על לקס, מעשיר תדירות המל&quot;ל על ידי יותר מ -14 לקפל, אימות לקס כסמן המל&quot;ל. אנחנו גם קבענו את תדירות המל&quot;ל של neurospheres עכבר E14.5 באמצעות פרוטוקול זה 27 ו NCFCA 28. שתי השיטות לדווח תדירות המל&quot;ל השוואה של 2% על ב neurospheres העכבר E14.5. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig1.jpg" /> פרוטוקול באיור 1. לבידול neurosphere בתנאי משובט. Neurospheres לדוגמא גדל בתנאים המשובטים ממוקמים בנפרד בכל PLL / Laminin-גoated היטב של coverslip תאיים 50-היטב, ואיפשר לדבוק O / N. באותו היום, neurospheres התרבותי בתפזורת הם מצופים במדיום בידול בצלחת סנטימטר PLL / 10 מצופה Laminin, ואפשר לדבוק O / N. למחרת, בינוני מותנה מן neurospheres תרבותי בתפזורת מסונן והניח בחזרה בצלחת 10 ס&quot;מ. Neurospheres מדגם מכן הפוך על המדיום המותנה ואפשר להבדיל במשך 3-4 ימים 28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig2.jpg" /> צמיחה איור 2. של המשובטים neurosphere. תאים שמקורם neurospheres E14.5 היו הפרידו זורעים 50 תאים / מ&quot;ל בצלחת 96-היטב. תאים בודדים אותרו במשך 6 ד ידי הדמיה זמן לשגות. תמונות של oתא ne כזה גדל לתוך neurosphere מוצג. ראוי לציין, כי neurosphere שומרת clonality. (א) 0 ימים; (ב) 1.19.45; (ג) 2.95.37; (ד) 3.32.76; (ה) 4.46.53; (ו) 5.61.44; איפה את המספר הראשון מתייחס היום, המספר השני מתייחס שבריר של יום, ומספר השלישי מתייחס שבריר של h. הגדלה 10X. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig3.jpg" /> איור 3. דיפרנציאציה של משובטי Neurospheres ואת ספירת התדירות המל&quot;ל. Neurospheres היחיד נקטף בדיל ב coverslip תאי 50-גם עבור 3 ד. תמונה מייצגת של STA neurosphere tripotentשאינו עומד עם (א) DAPI immunostained עבור (ב) GFAP, (ג) Tuj1 ו- (ד) O4. (ה) מציגה את הכיסוי של (א) - (ד). סרגל קנה מידה, 65 מיקרומטר. (ו)% של unipotent, bipotent ו neurospheres tripotent שנוצר על ידי לקס + ולקס - תאים (ממוצע ± SEM, n = 3). (ז) תדירות המל&quot;ל לקס + ולקס -. התאים מחושב כמכפלה של nfu ו-% של neurospheres tripotent <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

תאי גזע עצביים (NSCs) להתייחס לתאים אשר יכול עצמית לחדש ולבדל לשלוש השושלות עצביות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לקבוע תדירות המל&quot;ל באוכלוסיית תא נתונה באמצעות neurosphere היווצרות והבחנה בתנאים משובטים.

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא למנות את תדירות התאיים הגזעים העצביים באוכלוסייה נתונה באמצעות השורה של יצירת נוירוספירות (neurospheres) ודיפרנציאציה בתנאים קלונליים. לשיטה זו ישנם שימושים מרכזיים בתחום התאים הגזעים העצביים, כגון הערכה של סממנים מועמדים לתאים גזעים עצביים, טהרות של תאים גזעים עצביים והבחנה בין תאים גזעים עצביים לבין תאי אב עצביים (neural progenitors). יתרונותיה של שיטה זו הם משך ביצוע של 13 ימים, זמן קצר יותר מהשיטות הנוכחיות למניית תדירות תאים גזעים עצביים, והעובדה שהיא מבוצעת בתנאים קלונליים.כדי להתחיל בנוהל זה, ביום הראשון, הכינו מצע גידול ל-NSC על ידי שילוב של מצע DMEM F12 עם B27, EGF, BFGF, ופניצילין סטריפטומייסין. לאחר מכן, בצעו דיסוציאציה של נוירוספירות עכבר E14.5 במיליליטר אחד של מצע גידול ל-NSC ובמיליליטר אחד של Sodium Hydroxide בריכוז 0.05 normal למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את התאים בעזרת פיפטה למעלה ולמטה מדי פעם כדי לשמור אותם בסספנסיון, ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של חומצה הידרוכלורית בריכוז 0.05 normal כדי לנטרל את הבסיס.לאחר מכן, בצעו ספירת תאים באמצעות צביעה ב-trypan-blue והמציטומטר. לאחר מכן, זרעו תאי נוירוספירה בודדים של עכבר בשלב E14.5 בצפיפות של 50 תאים למילליטר או פחות, ב-100 microliters של מדיום גידול ל-NSC בתוך פלטת 96 באריים. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, ו-5%CO2 למשך שבוע כדי להפיק נוירוספירות קלונאליות.על מנת לגדל נוירוספרות עבור המצע המותנה, ביום השלישי יש לפרק נוירוספרות של עכבר בשלב E14.5 ולזרע את התאים הבודדים בריכוז של 20,000 תאים למיליליטר ב-10 מיליליטר של מצע גידול NSC בצלחת תרבית של 10 סנטימטרים. לאחר מכן, יש לדגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך חמישה ימים כדי להפיק נוירוספרות בגידול המוני. ביום השמיני יש להכין את תמיסת הציפוי על ידי ערבוב של 700 מיקרוליטר של 0.01% poly-L-lysine, 70 מיקרוליטר של laminin בריכוז של 1 מיליגרם למיליליטר ו-6,230 מיקרוליטר של PBS.בשלב הבא, השקיעו צלחת תרבית של 10 סנטימטר באמצעות שבעה מיליליטר של תמיסת poly-L-lysine laminin למשך שעתיים ב-37 degrees Celsius. בעזרת פיפט סרולוגי של 10 מיליליטר, העבירו את כל הנוירוספירות שגודלו במסה למבחנה קונית של 15 מילימטר לצנטריפוגה. סבבו את הנוירוספירות בצנטריפוגה ב-171 times g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והסִירו את הנוזל העליון לחלוטין.לאחר מכן, הכין מצע דיפרנציאציה ל-NSC על ידי שילוב של מצע DMEM F12 עם B27 ו-FBS. הוסף 10 מיליליטר של מצע דיפרנציאציה ל-NSC אל הנוירוספירות ובצע פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לתלה מחדש את הנוירוספירות. לאחר מכן, שאב את ה-poly-L-lysine laminin מתוך כלי התרבית בן ה-10 סנטימטרים ושטוף פעם אחת עם 10 מיליליטר של PBS.העבירו את כל הנוירוספירות לצלחת תרבית בעלת קוטר 10 סנטימטר מצופה ב-poly-L-lysine laminin, והדגירו אותן למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 כדי לאפשר לנוירוספירות להיקשר לצלחת. ביום השמיני, ספרו תחת מיקרוסקופ את מספר הנוירוספירות שנוצרו בכל באר, ולאחר מכן צפו כל באר של זכוכית כיסוי עם 50 בארות (50 well chambered cover slip) באמצעות 10 µL של תמיסת ציפוי poly-L-lysine laminin למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הכינו שלוש מבחנות צנטריפוגה קוניות של 50 מיליליטר, המכילות כל אחת 30 מיליליטר של PBS.הוציאו באמצעות פינצטה סטרילית את כיסוי הזכוכית בעל 50 התאים המצופה, טבלו את כיסוי הזכוכית בשפופרת הראשונה של PBS, לאחר מכן בשנייה, ואז בשפופרת השלישית של PBS כדי לשטוף את תמיסת הציפוי. לאחר מכן, שאבו כל נוזל שנותר מהתאים של כיסוי הזכוכית. העבירו בעדינות את כל המצע והנוירוספרים מכל תא בצלחת בעלת 96 תאים לצלוחית תרבית אחת בקוטר 10 סנטימטרים.ודאו שרק נוירוספירה אחת נבחרת בכל פעם על ידי הגדרת עמודת הפיפטה לשני מיקרוליטרים; תחת המיקרוסקופ, בחרו דגימה של נוירוספירה באמצעות מיקרו-פיפטה P10 המצוידת בקצה פיפטה של 10 מיקרוליטרים. ניתן לבחור את הנוירוספירות תחת המיקרוסקופ, בתוך מנדף זרימה למינרית, או על גבי משטח עבודה. לאחר מכן, העבירו את הנוירוספירה למרכזו של באר בכיסוי זכוכית בעל 50 תאים מצופה.חזור על הפרוצדורות עד שכל באער של כיסוי הזכוכית בעל התאים יכיל נוירוספירה. לאחר מכן, הוסף 10 µL של מצע דיפרנציאציה ל-NSC לכל באער בכיסוי הזכוכית בעל התאים. הנח את כיסוי הזכוכית בעל התאים בתוך צלחת תרבית של 10 cm.ניתן להניח עד שתי זכוכיות כיסוי בעלות תאיים (chambered cover slips) בתוך צלחת של 10 סנטימטרים. טפטפו PBS לאורך דפנות הצלחת כדי למנוע התייבשות של מצע ההבדלה של תאי NSC. דגרו את זכוכיות הכיסוי בעלות התאים במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2.ביום התשעה, העבירו את המצע המותנה מהנוירוספירות שגודלו במסה לצמיג centrifuge קוני בנפח 15 milliliter. באמצעות מזרק סטרילי של 20 milliliter, העבירו את המצע המותנה דרך מסנן של 0.2 micrometer כדי להסיר תאים או שיירי תאים. לאחר מכן, העבירו את המצע המותנה המסונן בחזרה לצCלחת התרבית של 10 centimeter.לאחר מכן, בעזרת פינצטה סטרילית, הניחו בעדינות את כיסוי הזריקה (chambered cover slip) על המצע המותנה באופן הפוך, כך שנוירוספירות הדגימה פונות כלפי מטה. דגרו את כיסוי הזריקה למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 37 °C ו-5%CO2. ביום ה-12, הסירו בעדינות את כיסוי הזריקה מתוך צלחת התרבית בנפח 10 סנטימטר בעזרת פינצטה סטרילית.טבול בעדינות את לוכסנית הכיסוי ב-PBS כדי לשטוף את המצע המותנה. לאחר מכן, קלף את אטם הסיליקון מלוכסנית הכיסוי; בצע זאת בעדינות ובאיטיות כדי למנוע את שבירת לוכסנית הכיסוי. שים לב לצד שבו דבקו הנוספירות (neurospheres) המובחנות.לאחר מכן, טפטפו 1 mm של 4% paraformaldehyde על פיסת סרט פראפין שנגזרה לגודלו של לית סטיפ (cover slip). הניחו בעדינות את הלית סטיפ על סרט הפראפין כאשר הנוירוספירות פונות כלפי מטה ובמגע עם ה-paraformaldehyde, וקבעו (fix) את הנוירוספירות למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בשלב זה, נוירוספירות בודדות נבחרו ועברו דיפרנציאציה בלית סטיפ עם 50 תאים למשך שלושה ימים.זוהי תמונה מייצגת של נוירוספירה טריפוטנטית שצבעה ב-dapi וצבעה אימונוהיסטוכימית עבור GFAP, TUJ1 ו-O4. תמונה זו מראה את חפיפת הצביעות של dapi, GFAP, TUJ1 ו-O4. פרוטוקול זה משמש להערכת היכולת של LeX, סמן ידוע עבור NSC, להעשיר את אוכלוסיית ה-NSC. גרף זה מציג את אחוזי הנוירוספירות העניפוטנטיות, הביפוטנטיות והטריפוטנטיות שנוצרו על ידי תאים חיוביים ל-LeX ותאים שליליים ל-LeX. תאים חיוביים ל-LeX מייצרים באופן מובהק יותר נוירוספירות טריפוטנטיות מאשר תאים שליליים ל-LeX.טבלה זו מראה כי שכיחות ה-NSC של תאים חיוביים ל-LeX ותאים שליליים ל-LeX חושבה כמכפלה של NFU ואחוז ה-neurospheres הטריפוטנטיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לתרבת ולהבדיל neurospheres בתנאים קלונאליים כדי להעריך את שכיחות התאי הגזע העצביים. בעת ביצוע שיטה זו, חשוב להשתמש במצעי גידול ובידול שהוכנו טרי ובתמיסת ציפוי שהוכנה טרי, כדי להבטיח תנאי גידול ובידול אופטימליים עבור ה-neurospheres.לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע שיטה זו תוך 13 ימים, זמן קצר יותר בהשוואה לשיטות הנוכחיות לספירת שכיחות תאי גזע עצביים. ניתן להשתמש בשיטה זו לצד שיטות נוכחיות, כגון בדיקת תאי מושבה עצביים (neural colony forming cell assay), כדי להעשיר תאי גזע חדשים יותר ולזהות סמן מובהק לתאי גזע עצביים.

enumeration-of-neural-stem-cells-using-clonal-assays

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ידיעת מספרם המדויק של תאים קיימא נדרש מניפולציות תרבות רבים רקמות. פרוטוקול זה מתאר כיצד להבדיל בין תאים חיים ומתים ולכמת תאים באמצעות hemacytometer. למרות שזה מתאר הספירה האנושית גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs), ניתן להשתמש בו עבור סוגי תאים אחרים.

ספירת אדם בתאי גזע עצביים

זה פרוטוקול וידאו מדגים את שיטת assay neurosphere ליצור ולהרחיב בתאי גזע עצביים מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

זה פרוטוקול וידאו מדגים כיצד להפלות ו למנות בתום תאים בתום גזע עצביים באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר באמצעות assay עצביים המושבה יוצרי התא.

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה חדשה לייצור וטיהור הבאות של ובתאים עצביים ממקורות מתחדשים בתאי גזע עצביים (NSCs) מבוסס על (גרעיניות בגודל פנימי) הפיזי שלהם תכונות ניאון cytometry באמצעות טכנולוגיית הזרימה.

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

חוט השדרה של יונקים בוגרים מכיל תאי גזע/אב עצביים (NSPCs) שניתן לבודד ולהרחיב בתרבית. פרוטוקול זה מתאר את הקציר, הבידוד, התרבית והמעבר של NSPCs שנוצרו מהאזור הפרי-חדרי של חוט השדרה הבוגר מהחולדה ומתורמי השתלת איברים אנושיים.

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

פרוטוקול חזקים כדי לפקח אוכלוסיות עצבית על ידי זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה ואחריו-מבוססות תוכנה שלאחר עיבוד מתואר. שיטה זו מייצגת כלי רב עוצמה לזיהוי אירועים הביולוגי בקרב אוכלוסיה הנבחר במהלך הניסויים הדמיה בשידור חי.

חיים הדמיה ואחריו תא בודד מעקב צג Cell Biology, ההתקדמות שושלת היוחסין של אוכלוסיות עצבית מרובים

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לניתוח המשובטים של תא גזע hematopoietic מבשרי במהלך התפתחות עובריים מאתר. אנו משלבים אינדקס מיון של תאים בודדים מאזור העורקים-בלוטת המין-mesonephros עובריים עם תרבות משותפת תא אנדותל והשתלות לאפיין את המאפיינים פנוטיפי ואת הפוטנציאל engraftment של מבשרי hematopoietic יחיד.

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

למדו ספירת תדירות תאי גזע עצביים באמצעות יצירת משובטים והבדלה בתנאים קלונליים. שיטה זו מסייעת להערכת סמנים וטיהור תאי גזע עצביים בתוך 13 ימים בלבד.

ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

גלה סרטונים נוספים