אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית מ Coli Escherichia: עיצוב, ייצור טיהור
16 בנובמבר 2016
מוצג פרוטוקול לייצור, טיהור ושימוש בשלפוחיות ממברנה חיצוניות ארוזות אנזימים (OMV) המספק יציבות אנזימים משופרת ליישום ביישומים מגוונים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לטהר ולאפיין שלפוחיות ממברנה חיצונית חיידקיות מלאות באנזימים לשימוש כמו ריאגנטים קטליטיים במבחנה. טכניקת בידוד אנזימים זו מאפשרת לקצור OMV חיידקיים מאמצעי תרבית ולאחר מכן להשתמש בהם לביצוע קטליזה נטולת תאים של תרכובת אורגנו-פוספט. אריזה מכוונת בתוך OMV חיידקים משפרת משמעותית את יציבות האנזים במגוון תנאי תגובה ואחסון, בניגוד לטכניקות מסורתיות שלעתים קרובות גורמות לאובדן הדרגתי ומתמשך של פעילות האנזים.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אריזת חלבונים עם רלוונטיות בתחומים מרובים, כגון פיתוח טיפולים, תיקון או פיתוח מערכות קטליטיות נטולות תאים. בעוד שפרוטוקול זה מפרט טיהור של OMV מ-E.coli, הטכניקות עם שינוי באסטרטגיית האריזה יכולות לשמש בקלות לטיהור OMV ממגוון תרביות תאים מיקרוביאליות. לאחר יצירת שלפוחיות ממברנה חיצונית או OMVs בחיידקים על פי פרוטוקול הטקסט, צנטריפוגה את מדיום תרבית החיידקים השלם ב-7,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
הסר ושמור את ה-supernatant, תוך הקפדה לא להפריע לכדור התא. לאחר מכן, הכניסו את הסופרנטנט לסיבוב שני כדי להבטיח שכל החיידקים יוסרו מהמדיום. כדי להסיר אגרגטים של חלבון וחומר סלולרי גדול ממדיום התרבות השמור, משוך את התמיסה למזרק סטרילי של 10 עד 50 מיליליטר.
חבר פילטר 0.45 מיקרון כדי לפתות את קצה המזרק. לאחר מכן לחץ על הבוכנה ואסוף את הזרימה בצינור חדש. לחלופין, יש לסנן בוואקום את מדיום התרבות על ידי העברתו למנגנון סינון סטרילי.
חבר את היחידה למשאבת ואקום או לשואב כיור כדי ליצור יניקה. העבירו את המדיום המסונן לכלי חדש. כדי לבודד את ה-OMVs, העבירו את מדיום התרבות המסונן לצינורות אולטרה-צנטריפוגה.
סובב את המדיום בערך פי 150, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות באמצעות רוטור המתאים לצינורות המשמשים. מיד לאחר אולטרה-צנטריפוגה כדי למנוע אובדן מסת גלולה, שפכו את מדיום התרבית המדולדל ב-OMV מכדור ה-OMV החום מעט שעשוי להיראות או לא נראה בעין. ניתן להיצמד לכדור ה-OMV שנוצר לאחר אולטרה-צנטריפוגה רק באופן רופף לשלפוחית הצנטריפוגה.
יש לנקוט בזהירות בעת הסילוק כדי להבטיח שהגלולה לא תיעקר ותלך לאיבוד. שמור את הסופרנטנט לפיזור אור דינמי מאוחר יותר כדי לוודא שחלקיקי ה-OMV התרוקנו לחלוטין מהתווך. הוסף 0.5 למיליליטר אחד של PBS, PH 7.4 או מאגר מסונן אחר כפי שנקבע על ידי צרכים או תנאים ניסיוניים, לגלולה ואפשר לה לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר מכן פיפטה בזהירות את תמיסת ה-OMV המטוהרת תוך ערבוב עדין כדי להבטיח שהגלולה כולה מסיסה. כדי לקבוע את התפלגות גודל ה-OMV, פתח את תוכנת מעקב הננו-חלקיקים DLS עבור המכשיר שבו נעשה שימוש. הפעל את המיקרוסקופ ונקה את כל המשטחים במיקרוסקופ וביחידת המעקב אחר ננו-חלקיקים.
באמצעות מזרק סטרילי של מיליליטר אחד, הוסף כ-0.5 מיליליטר של דגימת OMV ישירות לחלון הצפייה של מכשיר מעקב החלקיקים דרך האביזר התחתון, תוך הקפדה לכסות את כל חלון הצפייה מבלי להזריק בועות אוויר למערכת. הנח את יחידת המעקב אחר ננו-חלקיקים על המיקרוסקופ stage והפעל את הלייזר. לאחר מכן לחץ על לכידה בתוכנה.
התאם את המיקוד והבמה של המיקרוסקופ כדי לדמיין את החלקיקים במסך התצוגה המקדימה הקיים בחלון התוכנה. כוונן את תריס המצלמה ואת רווח המצלמה עד שחלקיקים בהירים יוצגו בבירור על רקע כהה. התאימו את משך הצילום ל-60 שניות, ואחר כך לחצו על 'הקלט'.
כאשר תתבקש, הזן את טמפרטורת מכשיר הדגימה, תייג את הדגימה ושמור את נתוני הווידאו בסיום כל ריצה בתיקיה המיועדת למשתמש. שמור את כל פרמטרי הניתוח במצב זיהוי אוטומטי ולחץ על רצף תהליך. רשום את התפלגות וריכוז גודל החלקיקים כחלקיקים למיליליטר כפי שנקבע על ידי התוכנה.
כדי לקבוע את תכולת חלבון OMV, השתמש ב-SDS-PAGE וב-Western Blots כדי להעריך את ייצור אנזימי טוהר OMV ו-SpyCatcher או SC ל-SpyTag או ST יעילות צולבת. חובה לאשר את הביטוי של אנזימי המטרה וחלבון העוגן. ביטוי של חלבונים רקומביננטיים יכול לעתים קרובות להיות לא מוצלח ממגוון סיבות ויש לאשר ייצור חלבון מוצלח לפני אפיון OMV.
כדי לבצע בדיקת פעילות פוספוטריאסטראז או PTE, הוסף חמישה מיקרוליטר של דילול של 1 עד 1,000 של פראוקסון במאגר CHES לחמישה מיקרוליטרים של OMV מטוהרים ב-90 מיקרוליטר של CHES. בצע קריאות ספיגה ב-405 ננומטר ו-348 ננומטר כל 20 שניות למשך כשעתיים של זמן תגובה כולל כדי לעקוב אחר התקדמות תוצר הפירוק הפראוקסוני הכרומוגני p-nitrophenol. לבסוף, בצע ניתוח נתונים על פי פרוטוקול הטקסט.
מוצגות כאן דוגמאות למורפולוגיה של OMV מטוהרים מ-E.coli דרך SEM. גודלם של OMV נע בין 50 ל-250 ננומטר כפי שנקבע באמצעות מכשור מעקב אחר חלקיקים. בגרף זה מוצג ריכוז ה-OMV המוחלט.
כאשר N terminal OMP-A-ST עבר טרנספורמציה משותפת עם PTE-SC בנוכחות ארבינוז ו-IPTG, נצפתה עלייה משמעותית בייצור OMV בהשוואה לדגימות הביקורת. ה-SDS-PAGE והכתמים המערביים הנראים כאן מאפיינים עוד יותר את תכולת חלבון ה-OMV וביטוי החלבון הרקומביננטי עבור OMP-A-ST, OMP-A, PTE-SC ו-OMP-A-ST-PTE-SC. באיור זה, רמות ביטוי PTE כוללות ויעילות אריזת OMV בכדורי התא, כדורי UC supernatant וכדורי UC OMV מטוהרים נקבעו על ידי מדידות מהירות ראשוניות באמצעות paraoxon כמצע כרומוגני.
כאן, Triton X-100 שימש לאימות טרנסלוקציה של paraoxon על פני שכבות OMV דו-שכבתיות שלמות. היה הבדל קטן בפעילות עם או בלי חומר ניקוי, מה שמצביע על כך שפארוקסון עובר בחופשיות דרך נקבוביות אנדוגניות ב-OMV. לבסוף, כפי שניתן לראות בניסוי זה, נתונים קינטיים של PTE-SC מתאימים למשוואה קינטית סטנדרטית של אנזים מיכאליס-מנטן עבור N טרמינל OMP-A-ST שעבר טרנספורמציה משותפת עם PTE-SC בנוכחות ארבינוז ו-IPTG ו-PTE-SC בנוכחות הפעלת ארבינוז.
לאחר שכל המבנים הגנטיים נוצרו ואושרו, ניתן לבצע את אריזת האנזים וטיהור ה-OMV במשך תקופה של יומיים. יש צורך ביום שלישי כדי לאשר ולאפיין OMV בכל פעם שמפותח מבנה חדש. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לוודא את דירוגי הבטיחות של כל החומרים וציוד הצנטריפוגה.
בנוסף, חשוב לוודא את הצלחת כל שלב לפני שממשיכים לשלב הבא. ניתן להשלים את שלבי האפיון המתוארים כאן עם אחרים כדי לאשר את אריזת האנזים ומורפולוגיה של OMV. ריכוז החלבון, תכולת השומנים, ריכוז ה-LPS ומאפיינים רבים אחרים יכולים להשתנות עם מטענים ותנאי אדוקציה שונים ועשויים להשפיע על יישומים במורד הזרם.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר ולאפיין OMV מלאי אנזימים וכן לבצע בדיקות מקדימות כדי להעריך את פעילות מטען האנזים. אל תשכח שעבודה עם חיידקים וריאגנטים כימיים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון טכניקה אספטית נכונה וציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את תהליכי הייצור, הניקוי והיישום של שלפוחיות ממברנה חיצונית (OMVs) ממקור בקטריאלי הממולאות באנזימים. שלפוחיות OMVs אלו משפרות את יציבות האנזימים, ובכך הופכות אותם למתאימים ליישומים שונים, כולל קטליזה נטולת תאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביוכימיה
- מיקרוביולוגיה
- טכנולוגיית אנזימים
רקע
- שלפושיות ממברנה חיצונית (OMVs) הן ננו-חלקיקים המתרחשים באופן טבעי ומשוחררים על ידי חיידקים.
- OMVs יכולות להכניס אנזימים לקפסולות, ובכך לשפר את יציבותם בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- טכניקה זו מאפשרת שימוש ב-OMVs במגוון יישומים, כולל פיתוח טיפולי ושיקום סביבתי.
- הפרוטוקול מתמקד ב-OMVs המופקות מ-E. coli אך ניתן להתאימו לתרביות מיקרוביאליות אחרות.
מטרת המחקר
- לטיהור ואפיון של OMVs ממולאים באנזימים עבור יישומים קטליטיים in vitro.
- לשיפור יציבות האנזים לצורך פעילות ממושכת תחת תנאים שונים.
- לבחינת הפוטנציאל של OMVs בתחומים מרובים כגון טיפוליות וקטליזה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף OMVs חיידקיים מתוכיי מטרייה.
- סנטריפוגציה של תרביות חיידקים לבידוד OMVs.
- אפיון הפעילות האנזימטית בתוך ה-OMVs.
- יישום של OMVs בקטליזה נטולת תאים של תרכובות אורגנופוספט.
תוצאות עיקריות
- OMVs משפרים באופן משמעותי את יציבות האנזים בהשוואה לטכניקות בידוד מסורתיות.
- פעילות האנזים נשמרת בטווח רחב של תנאי תגובה ואחסון.
- הפרוטוקול מאפשר טיהור יעיל של OMVs מ-E. coli.
- מודגשות יישומים פוטנציאליים בתחומי הטיפול התרופתי והשיקום הסביבתי.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מספק שיטה מהימנה להפקת OMVs יציבים הממולאים באנזימים.
- OMVs יכולים לשמש כריאגנטים קטליטיים יעילים ביישומים ביוכימיים שונים.
- עבודות עתידיות עשויות להרחיב את השימוש בטכניקה זו למערכות מיקרוביאליות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אריזה מכוונת של חלבונים בתוך שלפוחיות ממברנה חיצונית (OMVs) מאפשרת הובלה יציבה של אנזימים עבור מערכות קטליטיות נטולות תאים, ובכך נותנת מענה לאתגרי חוסר היציבות בייצור חלבונים רקומביננטיים. גישה זו תומכת במחקר ופיתוח בתחום הביו-פארמה על ידי שיפור חיי המדף והפעילות של האנזימים תחת תנאים משתנים, ובכך מפחיתה את שיעורי הכישלון בשלבים מוקדמים של פיתוח תרופות ואבחנה מבוססות אנזימים. השיטה מספקת פלטפורמה של ננו-חלקיקים ממקור בקטריאלי הניתנת להרחבה (scalable) להובלה ממוקדת של מטען, עם יישומים בתחומים של טיפולים להחלפת אנזימים, ביו-רמדיאציה וייצוב של ריאגנטים אבחנתיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של אנזימים רקומביננטיים על ידי שמירה על פעילותם באמצעות כליסה ב-OMV, ובכך מפחית תוצאות שגויות שליליות בסריקת מטרות.
- ערך תפעולי: תומך בהערכה בתפוקה גבוהה של וריאנטים של אנזימים על ידי סטנדרטיזציה של מדדי היציבות בין מבנים שונים.
סקר ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק פורמט יציב להצגת אנזימים לצורך מדידות קינטיות עקביות במערכי בדיקה נטולי תאים, ובכך משפר את השחזוריות של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי מזעור הסטיה בפעילות במהלך קמפיינים של סריקה, ובכך מפחית את הצורך בהכנה תכופה של ריאגנטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר הערכה של תרופות אנזימטיות בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית על ידי הגנה על המטען מפני פירוק פרוטאוליטי.
- ערך תפעולי: תומך בפיתוח פורמולציות עבור תרופות מבוססות אנזימים על ידי הדגמת יציבות מוגברת תחת עומסי אחסון והובלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטת האריזה ב-OMV משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות, ומאפשרת ייצור יציב של אנזימים לצורך סריקות המשך והערכה פרה-קלינית.
- ביולוגיה של גילוי: מאשרת מעורבות של המטרה ומודולציה של המסלול על ידי שימור תפקוד האנזים במהלך אפיון in vitro.
- סריקה: מספקת פלטים אנזימטיים כמותיים ויציבים לצורך ניתוח תגובה למינון, ובכך משפרת את הביטחון במעבר מ-hit ל-lead.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני פעילות מהימנים באמצעות בדיקות הידרוליזה של paraoxon, המאפשרות הערכה השוואתית של וריאנטים של אנזימים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות פרה-קלינית על ידי הדגמת יציבות אנזימטית בתנאים ביולוגיים מדומים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-שימוש לאנקפסולציה של אנזימים מגוונים, ובכך מפחיתה את מאמצי הפיתוח מחדש בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתפקוד האנזימטי על ידי הפחתת אובדן הפעילות במהלך ביצוע הבדיקה.
- ערך תפעולי: משפר את עקביות הריאגנטים ואת יכולת ההרחבה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד וכימות של OMV.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכון ביולוגי בפיתוח טיפולים אנזימטיים על ידי תיקוף מוקדם של יכולת המודולציה של המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים אנזימטיים בהתבסס על יציבות ויעילות קטליטית מוכחות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בשיטות של שיבוט מולקולרי, ביטוי חלבונים ותרביות חיידקים.
- תלוי בגישה למכשור של אולטרה-צנטריפוגציה ומעקב אחר ננו-חלקיקים לצורך בידוד ואפיון של OMV.
- מחייב סטנדרטיזציה של תנאי ההשראה (למשל, arabinose/IPTG) בין צוותים כדי להבטיח יעילות אריזה ובלועיקה (vesiculation) ניתנת לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה לגדלי אנזימים, מסיסויות ואסטרטגיות עיגון שונות כאשר מרחיבים את השיטה למטענים שאינם PTE.
- כולל מגבלות מעשיות כגון תנודתיות ביבול ה-OMV ואגרגציה פוטנציאלית במהלך האחסון, הדורשות אופטימיזציה אמפירית עבור כל אנזים מטרה.
