Name: אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית מ Coli Escherichia: עיצוב, ייצור טיהור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: למדו לייצר ולטהר וסיקולות ממברנה חיצונית מ-Escherichia coli המכילות אנזימים לקטליזה חופשית מתאים. שיטה זו משפרת יציבות אנזימטית ומאפשרת יישומים ביוכימיים מתקדמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי המשרד למחקר ימי באמצעות כספי ליבה שניתנו למעבדת המחקר הימית.

<ol><li>Avila-Calderon, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of bacterial membrane vesicles.</a> Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).</li>
<li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).</li>
<li>Beveridge, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+Gram+negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).</li>
<li>Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+multifaceted+roles+of+outer+membrane+vesicles+from+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria.</a> Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).</li>
<li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).</li>
<li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).</li>
<li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+nanobioreactors-directing+enzyme+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).</li>
<li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).</li>
<li>Kesty, N. C., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+heterologous+outer+membrane+and+periplasmic+proteins+into+Escherichia+coli+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).</li>
<li>Zakeri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+tag+forming+a+rapid+covalent+bond+to+a+protein%2C+through+engineering+a+bacterial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).</li>
<li>Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+and+optimization+of+the+covalent+association+between+SpyCatcher+and+a+peptide+tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag.</a> J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).</li>
<li>Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+organophosphorus+nerve+agents+by+the+phophotriesterase+from+Pseudomonas-Diminuta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta.</a> Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).</li>
<li>Bigley, A. N., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+mechanisms+for+phosphotriesterases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biochim.+Biophys.+Acta%2C+Proteins+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catalytic mechanisms for phosphotriesterases.</a> Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).</li>
<li>Minton, N. A., Murray, V. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+organo-phosphate+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Toxicol.+Adverse+Drug+Exper%22%5BJournal%5D)">A review of organo-phosphate poisoning.</a> Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).</li>
<li>Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+neutralization+of+the+chemical+warfare+agent+VX%3A+Evolution+of+phosphotriesterase+for+phosphorothiolate+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).</li>
<li>Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+bacteria%3A+the+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Outer+Membrane+Vesicles+of+Bacteria.+SpringerBriefs+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gram-negative bacteria: the cell membranes.</a> Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+OmpA+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The function of OmpA in Escherichia coli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).</li>
<li>Danoff, E. J., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soluble%2C+periplasmic+domain+of+OmpA+folds+as+an+independent+unit+and+displays+chaperone+activity+by+reducing+the+self-association+propensity+of+the+unfolded+OmpA+transmembrane+beta-barrel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel.</a> Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).</li>
<li>Alves, N. J., Kline, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+inhibition+of+plasmin+and+delta-plasmin+via+benzamidine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).</li>
<li>Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density-based+separation+of+liposomes+by+glycerol+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation.</a> Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).</li>
<li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+liposome+purification+via+Liposome+Extruder+Purification+%28LEP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP).</a> Analyst. 138, 4746-4751 (2013).</li>
<li>Mayer, L. D., StOnge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+and+liposome-associated+doxorubicin+and+vincristine+levels+in+plasma+under+equilibrium+conditions+employing+ultrafiltration+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques.</a> Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).</li>
<li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast%2C+efficient%2C+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+BioSyst%22%5BJournal%5D)">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li>
<li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils%3A+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li>
<li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866(2016).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme%2Fprotein+packaged+bacterial+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Delivery%22%5BJournal%5D)">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

פונקציות פרוטוקול זה להפגין נציג מכוון טכניקת אריזה שבה אנזים עניין מיוצר וארוז לתוך OMV ידי E. coli. כמו עם טכניקות מורכבות רבות ישנם אזורים מרובים, בם הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להתאים לשימוש ביישומים ייחודיים שונים, שחלקם מפורטים להלן. בעוד מנגנון של אנקפסולציה האריזה אנזים OMV ניתן להתאים לצרכים הספציפיים ישנם מספר צעדים בתוך פרוטוקול זה אשר הם קריטיים להצלחתו. ההסרה הראשונית של חיידק שלם ופסולת הסלולר היא בעל חשיבות משמעותית תשפיע על כל הניסיונות במורד הזרם ב quan...

אנו מציגים כאן שיטה בעיצוב, ייצור, וטיהור של שלפוחית ​​הממברנה החיצונית חיידקי טעון אנזים (OMV). OMV הם קטנים, בעיקר unilamellar, proteoliposomes כי טווח בגודל 30-200 1,2 ננומטר. כל חיידקים גראם-שליליים גראם חיוביים כי נחקרו עד כה הוכיחו שחרור או OMV או שלפוחית תאיים (EV) מפני השטח שלהם 3,4. המנגנון המדויק שבו OMV מיוצר עדיין הובהר באופן מלא בשל אוכלוסיות חיידקים המגוונות אשר מפרישות אותם כמו גם את הפונקציות השונות, כי הם משרתים. OMV הוכח להובלת מגוון רחב של מטענים ממולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים ו החומר גנטי מגיש מגוון רחב של איתות מורכבת, טרנסלוקציה גן, ארסיות מתפקדת 5,6. המנגנונים המדויקים של biogenesis OMV אינם מתאפיינים היטב, נראים שונה בין מינים של חיידקים. למרות תיהים למעשה, פתחנו שיטה לשיפור יעיל האריזה של חלבון רקומביננטי לתוך OMV ידי יצירת הצמדה סינטתית בין חלבון של עניין וכן אנדוגני חלבון הנפוץ ביותר בקרום החיצוני חיידקי OMV שלאחר מכן. בהיעדר זיקה סינטתית, או זיקה שולבה באופן מלאכותי, בין חלבון recombinantly הביע ואת OMV את יעילות האריזה הנצפית היא מאוד נמוכה 7. תוצאה זו היא צפויה כמו שילוב של חלבונים בתוך OMV גם מתרחשת דרך אנקפסולציה מקריות בדיוק ברגע של היווצרות OMV על פני השטח חיידקי או באמצעות אריזות בבימויו של המנגנונים אינם מובנים היטב. חלק ההצלחה נצפתה חלבוני אריזה פשוט דרך על ביטוי במרחב periplasmic המסתמך על אנקפסולציה מקרית אלא אריזה יעילה מאוד חלבון תלוי עם כמה חלבוני אריזה ביעילות גבוהה בהשוואה לאחרים הב- אינו לארוז בכלל 8-10. על ידי ניצול טכניקות ביולוגיה סינטתית משותפות חפשנו להנדס Escherichia coli (E. coli) לייצר בו זמנית, חבילה ומפרישי אנזים פעיל עניין לתוך OMV עוקף מגבלות ידע קיימות לגבי איך OMV נוצרת וכיצד מטען נבחר על-ידי החיידקים אריזה. לעניין יישום זה מערכת bioconjugation חלבון פיצול נבחרת ההצמדה הסינטתית בחירה כדי להקל אריזה כיוונית לתוך OMV. כפי שהשם מרמז מערכת bioconjugation חלבון פיצול מורכבת משני תחומים למקטע ומשלימים אינטראקציה זה עם זה. תחומי חלבון הפיצול שנבחרו לצורך פרוטוקול זה המכונה SpyCatcher (SC) ואת SpyTag (ST) התחום נגזרים פיברונקטין מחייב pyogenes סטרפטוקוקוס החלבון (FbaB) 11. מערכת חלבון פיצול זה הוא יוצא דופן בכך wתרנגולת שתי יחידות המשנה הן בתוך קרבת אג&quot;ח isopeptide יוצרת באופן ספונטני בין הפרוקסימלי אספרטית שאריות חומצת חומצה ליזין אמינו יצירת הצמדה קוולנטי. היווצרות קשר Isopeptide אינה דורשת תוספת של חלבונים מלווים, אנזימים קטליטי, או קו-פקטורים ויכולה להתרחש בקלות בטמפרטורת חדר (RT) על פני טווח רחב של מצבים רלוונטיים מבחינה הפיזיולוגית 12. כהוכחה מושג, phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) מ diminuta Brevundimonas נבחרה להיות ארוז לתוך E. coli נגזר OMV 13. PTE מכיל אתר binuclear Zn / Zn פעיל ויש לו את היכולת לשבור זרחנים אורגניים באמצעות תגובה הידרוליזה המרת aryldialkylphosphates לתוך dialkylphosphates ו כהלים aryl 14. חשיפה זרחנים אורגניים פוגעת בתפקוד העצבי הנכון דרך עיכוב הידרוליזה של אצטילכולין על ידי האצטילכולין בצמתים neuromuscular מאקיןתרכובות organophosphate נגזר g 15 מסוכן מאוד. ממושך או חשיפה משמעותית זרחנים אורגניים תוצאות נפוצות עוויתות בלתי נשלטת בדרך כלל גורם למוות באמצעות מחנק. בעוד PTE מציג את הפעילות הקטליטית הגבוהה ביותר כלפי paraoxon, דברה חזקה מאוד, הוא גם מסוגל hydrolyzing מגוון רחב של חומרי הדברה אחרות ו- V / G סוג גזי עצבים כימיים 16. כדי להקל על אריזת OMV, פלסמיד חיידקי תוכנן מקודד מבנה גן המכיל מקדם מושרה, רצף לוקליזציה periplasmic, ואתר שיבוט מרובה קצר במעלה זרם של רצף גן SC. החדרה של גן PTE בין מנהיג רצף SC מותר ליצירת מתג גנטי שמכוון את חלבון היתוך PTE-SC למרחב periplasmic לאריזת OMV. למרות שהמאמצים המתוארים כאן להתמקד PTE, גן האנזים הוא להחלפה יכול להיות מוחלף בקלות עם רצף גן אחר facאריזת ilitate של אנזים או חלבון חלופי. כמו החלק השני של ההצמדה הסינטתית, חלבון הממברנה חיצוני בשפע (OmpA) נבחר להציג את רצף הפפטיד ST. בעוד הבחירה של חלבון עוגן יכול להשתנות, זה הכרחי כי החלבון יש דומיין מתירנית המציג במרחב periplasmic, סובל את ההיתוך לבנות ללא גרימת cytotoxicity, ידוע להיות נוכח OMV, ואינו מצטבר כאשר הוא recombinantly מיוצר. OmpA הוא חלבון 37.2 kDa הטרנסממברני Porin כי ידוע להיות מבוטא בכמות גבוהה בקרום החיצוני בקטריאלי ולאחר OMV 17. הוא מעורב התחבורה של מולקולות קטנות, &lt;2 ננומטר בגודל, דרך הממברנה בקטריאלי 18. יש Native OmpA שני תחומים ייחודיים מבחינה מבנית, מוטיב חבית בטא הטרנסממברני וחלק periplasmically מסיס בטרמינל C-ידוע אינטראקציה עם 19 פפטידוגליקן. בשנות ה designe היתוך OmpA-ST מוטציהד כאן חלק מסוף-C של OmpA נמחק ואת ST היה התמזג N- periplasmically פונה או C-Termini. מחיקת חלק periplasmic של OmpA מקטינה את מספר האינטראקציות בין הממברנה החיצונית ואת פפטידוגליקן וכתוצאה מכך יציבות הממברנה מובילה Hyper-vesiculation 7. הגנום OmpA נשמרה בנוסף לבנות OmpA-ST הביע recombinantly להמתיק יציבות הממברנה ברוטו.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>כל</td><td></td><td>תמיד מכינים טרי או מקפיאים.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>כל</td><td></td><td>ניתן להכין מבעוד מועד ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>: כל</td><td></td><td>תוספת מיד לפני השימוש לאחר שהחומר מתקרר מספיק לאחר חיטוי.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>כלורמפניקול&nbsp;</td><td>כל</td><td></td><td>תוסף מיד לפני השימוש לאחר שהחומר מתקרר מספיק לאחר חיטוי.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB Culture Media</td><td>כל</td><td></td><td>מדיית צמיחה אחרת ככל הנראה תעבוד באופן דומה.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>כל</td><td></td><td>אחד מפעילי שטח פוטנציאליים פוטנציאליים מתאימים.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>צלוחיות תרבות מבולבלות</td><td>כל</td><td></td><td>הבלבול מקדם רמות גבוהות יותר של אוורור.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>מאגר אופטימלי המשמש לפירוק paraoxon (pH > 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>חומר רעיל מאוד שיש לטפל בו בזהירות ולהיפטר ממנו כראוי.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>מסנן מזרק 0.45 ומיקרו; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 מ"מ)</td><td>קוטר המסנן יהיה תלוי בנפח הדגימה. קרום קשירת חלבון נמוך הוא קריטי.</td></tr><tr><td>חממת שייקר</td><td>ניו ברונסוויק</td><td>אקסלה E24</td><td>טמפרטורה וערבוב מדויקים חיוניים לצמיחת חיידקים הניתנת לשחזור.&nbsp;</td></tr><tr><td>צנטריפוגה תרבית סורוול</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>RC 5B PLUS</td><td>צנטריפוגת תרבית בנפח גדול (500 מ"ל) המסוגלת להכיל 7,000 x גרם.</td></tr><tr><td>סורוול אולטרה-צנטריפוגה&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>מסוגל לכוחות צנטריפוגליים & 150,000 x גרם.</td></tr><tr><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>ודא שנעשה שימוש ברוטור ובצינורות המתאימים ושהכל מאוזן כהלכה.</td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה שקופים במיוחד (25 x 89 מ"מ)</td><td>בקמן קולטר</td><td>344058</td><td>ודא שאין שברי מאמץ לפני השימוש ושהצינורות מאוזנים היטב.</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>הכרחי לבדיקות קינטיות של אנזימים.</td></tr><tr><td>מעקב אחר DLS/חלקיקים</td><td>NanoSight&nbsp;</td><td>LM10</td><td>הכרחי להתפלגות גודל OMV וקביעת ריכוז.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>זן ביטוי חיידקי מתאים.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>ניתן להשתמש בפלסמידים אחרים במקום אלה.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>ניתן להשתמש בפלסמידים אחרים במקום אלה.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>ערכה לדוגמה.</td></tr></tbody></table>

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; coli escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

עניין גובר יישום טכניקות ביולוגיה סינטטיות לתכנת שלפוחית ​​קרום חיצונית (OMV) מוביל כמה יישומים מעניינים וייחודיים מאוד עבור OMV שבו חלקיקים מסורתיים מוכיחים קשים מדי לסנתז. נכון להיום, כל חיידקים גראם שליליים הוכחו לייצר אריזות הוכחת OMV של מגוון מטענים הכוללת מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים החומר הגנטי. בהתבסס על המטענים המגוונים שלהם, OMV הם מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, החלו מתקשורת תאי תאים כדי העברת גנים ואספקה ​​של גורמים ארסיים התלויים בו חיידקים מפיקים את OMV. רק לאחרונה חיידקי OMV להיות נגיש לשימוש על פני מגוון רחב של יישומים באמצעות פיתוח טכניקות לשלוט ואריזה ישירה של חלבונים רקומביננטיים לתוך OMV. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור, טיהור, ושימוש OMV ארוז אנזים מתן השתפר overaייצור ll של אנזים רקומביננטי, vesiculation גדל, ויציבות אנזים משופר. ניצול מוצלח של פרוטוקול זה יגרום ליצירת זן חיידקים אשר בו זמנית מייצר חלבון רקומביננטי ומפנה אותו אנקפסולציה OMV באמצעות יצירת זיקה סינטתית בין חלבון רקומביננטי חלבון עוגן הממברנה חיצוני. גם פרוטוקול זה מפרט שיטות לבידוד OMV מתרבויות חיידקים כמו גם טכניקות טיפול הולמות ודברים שיש להביא בחשבון בעת ​​התאמת פרוטוקול זה לשימוש עבור יישומים ייחודיים אחרים כגון: משלוח סמי תרופות, אבחון רפואי, וטיפול סביבתי.

ביטוי סימולטני של שני חלבונים רקומביננטיים, כפי שנדרש לצורך אסטרטגית אריזת OMV המפורטים בפרוטוקול זה, ניתן להשיג באמצעות מספר דרכים שונות. כאן, מערכת וקטור שני נוצלה עם מקורותיה התואמים של שכפול קלטות גן מושרים נפרדות. על מנת לתת הביטוי של PTE-SC לבנות עמוד שדרת פלסמיד המסחרי (pACY184) תוכנן לכלול קלטת גן arabinose מושרה ו תאום ארגינין רצף מנהיג לוקליזציה periplasmic ואחריו שורה של אתרי הגבלה ייחודיים כדי להקל שיבוט של גן האנזים בתור היתוך חלבון SC...

מוצג פרוטוקול לייצור, טיהור ושימוש בשלפוחיות ממברנה חיצוניות ארוזות אנזימים (OMV) המספק יציבות אנזימים משופרת ליישום ביישומים מגוונים.

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לטהר ולאפיין שלפוחיות ממברנה חיצונית חיידקיות ממולאות באנזים, לשימוש כריאגנטים קטליטיים in vitro. טכניקה זו לבידוד אנזימים מאפשרת לאסוף OMVs חיידקיות מתוך מצע תרבית ולאחר מכן להשתמש בהן לביצוע קטליזה חסרת תאים של תרכובת אורגנופוספט. אריזה מנותבת בתוך OMVs חיידקיות משפרת משמעותית את יציבות האנזים תחת מגוון תנאי תגובה ואחסון, בניגוד לטכניקות מסורתיות שמובילות לעיתים קרובות לאובדן הדרגתי ומתמשך של הפעילות האנזימטית.ההשלכות של טכניקה זו מתרחבות לאריזה של חלבונים בעלי רלוונטיות לתחומים מרובים, כגון פיתוח תרופות, סנפצום (remediation), או פיתוח מערכות קטליטיות ללא תאים. בעוד שפרוטוקול זה מפרט ניקוי של OMVs מ-E.coli, ניתן להשתמש בטכניקות אלו, עם התאמה של אסטרטגיית האריזה, בקלות לניקוי OMVs ממגוון תרביות של תאים מיקרוביאליים. לאחר יצירת שלפוחיות קרום חיצוני או OMVs בחיידקים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, סובב במרכז פוגה את מצע תרבית החיידקים השלם ב-7,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות.הסיר ושמור את הנוזל העליון (supernatant), תוך הקפדה לא להפריע למשקע התאים. לאחר מכן, העבר את הנוזל העליון לסבב צנטריפוגה שני כדי להבטיח שכל החיידקים הוסרו מהתווך. כדי להסיר אגרגטים של חלבונים וחומר תאי גדול מתוך תווך התרבית שנשמר, שאב את התמיסה למזרק סטרילי של 10 עד 50 milliliter.חברו מסנן 0.45 micron לקצה המזרק. לאחר מכן, לחצו על הבוכנה ואספו את הנוזל המסונן לשפופרת חדשה. לחלופין, ניתן לסנן את מצע התרבית באמצעות סינון בוואקום על ידי העברתה למכשיר סינון סטרילי.חבר את היחידה למשאבת ואקום או לשואב כיור כדי ליצור יניקה. העבר את המדיום המסונן לכלי חדש. כדי לבודד את ה-OMVs, העבר את מדיום התרבית המסונן לתוך מבחנות אולטרה-צנטריפוגה.סובב את המדיום במהירות של כ-150,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש שעות, באמצעות רוטור התואם למבחנות שבשימוש. מיד לאחר העלטרה-צנטריפוגציה, וכדי למנוע איבוד של מסת המשקע, שפוך את מדיום התרבית המרוקן מ-OMV מהמשקע החום-בהיר של ה-OMV, שעשוי להיות נראה או לא נראה לעין. משקע ה-OMV שנוצר לאחר העלטרה-צנטריפוגציה עשוי להיות דבוק באופן רופף לדופן המבחנה.יש לנקוט משנה זהירות בעת המסננת כדי להבטיח שהמשקע לא יזוז וייאבד. שמרו את הנוזל העליון לבדיקת פיזור אור דינמי (DLS) מאוחרת יותר, כדי לוודא שחלקיקי ה-OMV הוסרו במלואם מהתווך. הוסיפו למשקע 0.5 עד 1 מיליליטר של PBS מסונן וסטרילי, pH 7.4, או באפר מסונן אחר בהתאם לצרכים או לתנאי הניסוי, והניחו לו להדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר מכן, העבירו בזהירות באמצעות פיפט את תמיסתו המזוהה של ה-OMV, תוך ערבוב עדין כדי להבטיח שכל המשקע הומס. כדי לקבוע את התפלגות הגדלים של ה-OMV, פתחו את תוכנת מעקב הננו-חלקיקים של ה-DLS עבור המכשיר שבשימוש. הדליקו את המיקרוסקופ ונקו את כל המשטחים במיקרוסקופ וביחידת מעקב הננו-חלקיקים.באמצעות מזרק סטרילי של מילליטר אחד, הוסיפו כ-0.5 מילליטר מדגמיית ה-OMV ישירות לחלון הצפייה של מכשיר מעקב החלקיקים דרך החיבור התחתון, תוך הקפדה על כיסוי כל חלון הצפייה ללא הזרקת בועות אוויר למערכת. הניחו את יחידת מעקב הננו-חלקיקים על משטח המיקרוסקופ והפעילו את הלייזר. לאחר מכן, לחצו על Capture בתוכנה.כווננו את פוקוס המיקרוסקופ ואת השולחן כדי להציג את החלקיקים על מסך התצוגה המקדימה בחלון התוכנה. כווננו את תריס המצלמה ואת הגבירה (gain) של המצלמה עד שחלקיקים בהירים יוצגו בבירור על רקע כהה. הגדירו את משך הלכידה ל-60 seconds, ולאחר מכן לחצו על Record.כאשר תתבקש, הזן את טמפרטורת המכשיר עבור הדגימה, תייג את הדגימה, ובסיום כל הרצה שמור את נתוני הווידאו בתיקייה שהוגדרה על ידי המשתמש. השאר את כל פרמטרי הניתוח במצב זיהוי אוטומטי (auto-detect) ולחץ על Process Sequence. רשום את התפלגות גודל החלקיקים ואת הריכוז כמספר החלקיקים למיליליטר כפי שנקבע על ידי התוכנה.כדי לקבוע את תכולת החלבון ב-OMV, השתמש ב-SDS-PAGE וב-Western Blots כדי להעריך את טוהר ה-OMV, את ייצור האנזימים ואת יעילות הקישור הצלוב של SpyCatcher או SC ל-SpyTag או ST. חובה לאשר את הביטוי של האנזימים המטרה וחלבון העיגון. ביטוי של חלבונים רקומביננטיים עלול לעיתים להיכשל ממגוון סיבות, ויש לאשר ייצור חלבון מוצלח לפני אפיון ה-OMV.לביצוע בדיקת פעילות פוספוטריאסטראז (phosphotriesterase או PTE), הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מהיל 1:1,000 של פאראוקסון (paraoxon) בבופר CHES לחמישה מיקרוליטרים של OMVs מופקת ב-90 מיקרוליטרים של CHES. בצעו קריאות ספיגה באורך גל של 405 ננומטר ו-348 ננומטר כל 20 שניות למשך כשעתיים של זמן תגובה כולל, כדי לעקוב אחר התקדמותו של p-ניטרופנול, תוצר הפירוק הכרומוגני של הפאראוקסון. לבסוף, בצעו ניתוח נתונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב.מוצגים כאן דוגמאות למורפולוגיה של OMVs מטוהרים מ-E.coli באמצעות SEM. גודל ה-OMVs נע בין 50 ל-250 ננומטרים, כפי שנקבע באמצעות מכשור למעקב אחר חלקיקים. בגרף זה מוצג ריכוז ה-OMV המוחלט.כאשר OMP-A-ST N-terminal הועבר בטרנספורמציה משותפת עם PTE-SC בנוכחות ארבינוז ו-IPTG, נצפתה עלייה משמעותית בייצור OMV בהשוואה לדגימות הביקורת. ה-SDS-PAGE וה-Western Blots המוצגים כאן מאפיינים עוד יותר את תכולת החלבונים של ה-OMV ואת ביטוי החלבון הרקומביננטי עבור OMP-A-ST, OMP-A טבעי, PTE-SC ו-OMP-A-ST-PTE-SC. באיור זה, רמות הביטוי הכלליות של PTE ויעילות האריזה ב-OMV במשקעי התאים, בעיקרי ה-UC ובמשקעי ה-UC OMV המופקים, נקבעו על ידי מדידות מהירות ראשונית תוך שימוש ב-paraoxon כסובסטרט כרומוגני.כאן, Triton X-100 שימש כדי לאמת את התעתוק של paraoxon דרך שכבות דומה של OMV שלמות. נמצא הבדל מזערי בפעילות עם או בלי דטרגנט, דבר המצביע על כך ש-paraoxon עובר בחופשיות דרך נקבים אנדוגניים ב-OMV. לבסוף, כפי שניתן לראות בניסוי זה, נתונים קינטיים של PTE-SC הותאמו למשוואת קינטיקה אנזימטית סטנדרטית של Michaelis-Menten עבור N terminal OMP-A-ST שהותמרהร่วม עם PTE-SC בנוכחות arabinose ו-IPTG, ועבור PTE-SC בנוכחות הפעלת arabinose.לאחר שיצרו ואישרו את כל המבנים הגנטיים, ניתן לבצע את אריזת האנזים ואת טיהור ה-OMVs במהלך תקופה של יומיים. יום שלישי נחוץ כדי לאשר ולאפיין את ה-OMVs בכל פעם שפותח מבנה חדש. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לוודא את דירוגי הבטיחות של כל החומרים ושל ציוד הצנטריפוגה.בנוסף, חשוב לוודא את הצלחתה של כל פעילה לפני המעבר לשלב הבא. ניתן להוסיף לשלבי האפיון המתוארים כאן שלבים נוספים כדי לאשש את אריזת האנזים ואת המורפולוגיה של ה-OMV. ריכוז החלבון, תכולת הליפידים, ריכוז ה-LPS ותכונות רבות אחרות עשויים להשתנות בהתאם למטען השונה ולתנאי ההספחה, ועשויים להשפיע על יישומים בהמשך התהליך.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הטיהור והאפיון של OMVs ממולאים באנזימים, כמו גם ביצוע בדיקות ראשוניות להערכת הפעילות של מטען האנזימים. זכרו כי עבודה עם חיידקים וריאגנטים כימיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון טכניקה אספטית נאותה וציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

מקור: Figueroa, D. M., et.al. ייצור והדמיה של ספרופלסטים ופרוטופלסטים חיידקיים לאפיון לוקליזציה של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את הייצור של ספרופלסטים Escherichia coli על ידי עיכוב חלוקת התאים כדי לגרום לנימה, ולאחר מכן עיכול אנזימטי של דופן התא. התהליך כולל הוספה מבוקרת של חומר כלאט, DNase ומייצב אוסמוטי כדי להבטיח היווצרות ויציבות תקינה של ספרופלסט לתצפית מיקרוסקופית.

הכנת ספרופלסט E. coli

מקור: Streather, B. R., et al. ייצור וניתוח אופטימלי של שלפוחיות מלאות חלבון רקומביננטיות מ- E. coli. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים את הייצור והבידוד של חלבונים רקומביננטיים המתויגים עם פפטיד גרעין שלפוחית (VNp) משלפוחיות חיידקים. משרה מפעיל ביטוי חלבון מתויג VNp, מניע היווצרות שלפוחית ואנקפסולציה, ואחריו צנטריפוגה וסוניקציה לשחזור חלבון יעיל ללא ליזה...

ייצור חלבון רקומביננטי והתאוששות משלפוחיות שמקורן בחיידקים

תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

פרולין-פרולין אנדופפטידאז-1 (PPEP-1) הוא מטאלופרוטיאז מופרש ויעד תרופה מבטיח מהפתוגן האנושי קלוסטרידיום דיפיצילה. כאן אנו מתארים את כל השיטות הדרושות לייצור וקביעת המבנה של חלבון זה.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

אנו מתארים שיטה לאפיון של מובילי הממברנה המונעת על ידי פרוטון בתכשירים ושלפוחית ממברנה המיוצרים על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli והליזה של תאים באמצעות עיתונות צרפתית.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

בממשק של ממיסים אורגניים ומימית, מותאם המותאם לאלסטין וחלבונים בעלי מבנה מולקולרי מורכבים כגון שלפוחיות, סיבים ומדבקות מופעלות על ידי פרמטרים סביבתיים. פרוטוקולי ההרכבה המתוארים מניבים תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) עם מאפיינים שניתן לסמוך עליהם, המאפשרים כימוס של מטענים שונים.

בימוי האסיפה של אלסטין כמו חלבונים לתוך הגדרת מבנים Supraולקולריים מוגדרים מחוץ לגופית

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מפורטת לייצור חיידקים של חלבונים רקומביננטיים, כולל חלבונים המכילים בדרך כלל קשרים בלתי מסיסים או דיסולפידים, ארוזים בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות הקשורות לקרום. יש לכך פוטנציאל להיות מיושם בתחומים מגוונים של מחקר מדעי, כולל ביוטכנולוגיה יישומית ורפואה.

ייצור וניתוח אופטימליים של בועיות מלאות חלבון רקומביננטי מאי-קולי

למדו לייצר ולטהר וסיקולות ממברנה חיצונית מ-Escherichia coli המכילות אנזימים לקטליזה חופשית מתאים. שיטה זו משפרת יציבות אנזימטית ומאפשרת יישומים ביוכימיים מתקדמים.

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ

גלה סרטונים נוספים

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית מ