הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

המטרה הכללית של הליך זה היא להכין דגימות של גבישי חלבון ממбраנה בפאזה קובית ליפידית (lipidic cubic phase) לצורך איסוף נתונים של קריסטלוגרפיה סדרתית במקורות סינכרוטרון ולייזר אלקטרונים חופשיים (x-ray-free electron-laser). שיטה זו אמורה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית של חלבוני ממברנה, כגון הובלה והעברה של אותות (signal transduction) דרך הממברנה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת קביעת מבנה של חלבוני ממברנה בסביבת הליפידים הטבעית שלהם בטמפרטורת החדר, בצריכת דגימות מינימלית ובנזקי קרינה זניחים.

אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקלו בקשיים, כיוון שפאזה קובית ליפידית היא חומר צמיגי דמוי ג'ל שקשה לטיפול ללא כלים מיוחדים וניסיון קודם. התחילו הליך זה בשחזור של חלבוני ממברנה בתוך הפאזה הקובית הליפידית, או LCP, באמצעות מזרקים מספר אחת ושתיים, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר שנוצר LCP שקוף והומוגני, העבירו את כל הדגימה למזרק מספר שתיים.

נתקו את מזרק מספר אחת תוך השארת המחבר מחובר למזרק מספר שתיים. חברו מחט נשלפת למזרק נקי נוסף של 100 µL, שייקרא מזרק מספר שלוש. שאבו לתוכו כ-70 µL מתמיסת המשקיעה.

נתק את המחט ממזרק מספר שלוש תוך השארת כדור הטפלון בתוך המזרק. חבר את מזרקים מספר שתיים ושלוש באמצעות המחבר, תוך וידוי שכדורי הטפלון ממוקמים נכונה בשני המזרקים. הברג בזהירות את המחבר עד לסגירה הדוקה.

כווננו את המזרקים המחוברים בצורה אנכית, כאשר מזרק מספר 2 נמצא למטה, והזריקו את דגימת ה-LCP המכילה את החלבון ממזרק מספר 2 לתוך מזרק מספר 3 באיטיות ובעקביות, עד שחוט ה-LCP יגע בבוכנה של מזרק מספר 3. נפח ה-LCP המוזרק יהיה כ-1/10 מנפח המשקיף הראשוני במזרק מספר 3. ודאו את הנפח באמצעות קריאת הסולם בשני המזרקים.

לאחר מכן, נתקו את מזרק מספר שתיים. כעת המצמד מחובר רק למזרק מספר שלוש, המכיל את הדגימה הטבולה בתמיסת המשקיעה. השתמשו ב-Parafilm כדי לאטום לחלוטין את מזרק מספר שלוש, כולל את הממשק בין הבוכנה למזרק, את הקצה הפתוח של המצמד ואת אום המחט.

איטום לא מלא בשלב זה עלול לגרום לשינוי בתנאי המשקיע ולהוביל להתייבשות הדגימה. חזרו על שלבי ההזרקה של דגימת ה-LCP הטעונה בחלבון כדי להכין התגבשות בשישה מזרקים נוספים, תוך שימוש בסך של כ-50 µL מדגימת ה-LCP. אחסנו את המזרקים האיטומים בשק פלסטיק הניתן לסגירה עם נייר ניגוב נקי מסיבים אחד או שניים שנספגו מראש במים, כדי להגן מפני התייבשות הדגימה.

אטמו את השקיות ואחסנו את המזרקים באינקובטור בטמפרטורה של 20-degree-Celsius במהלך גידול הגבישים. לצורך זיהוי גבישים, הוציאו את המזרקים מהאינקובטור כדי לבחון את דגימות ה-LCP ישירות בתוך המזרקים בכל 12 עד 24 שעות תחת מיקרוסקופ סטריאו עם אור מקוטב בצורה מוצלבבת. זהו את הגבישים כחלקיקים מבריקים ודחוסים, או, במקרה של גבישים קטנים יותר, כזוהר אחיד מתוך פילמנט ה-LCP.

החזירו את המזרקים האטומים לשקית, ואחסנו בטמפרטורה של 20 °C לשימוש עתידי. שלב תסמין הליפידים (lipid titration) נחוץ כדי לספוג את תמיסת המשקיעה העודפת וכדי למנוע קפיאה של הליפידים בעת ההזרקה לקרן לייזר של אלקטרונים חופשיים (x-ray-free electron laser). כשעה לפני תחילת איסוף הנתונים, הוציאו את המזרקים עם הדגימות מהאינקובטור בטמפרטורה של 20 °C.

בחרו שתי עד ארבע מזרקים לאיחוד דגימות על בסיס מראה גבישי דומה ודמיון בתנאי ההתגבשות. הסירו בזהירות את איטום ה-Parafilm מהמזרקים שנבחרו. הסירו את מחבר המזרקים, וחברו מחט נקי נשלף למזרק הראשון שנבחר.

דחפו בעדינות ובאיטיות את הבוכנה קדימה כדי לסחוט את המשקיע דרך המחט אל תוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה. גלו זהירות בשלב זה; מכיוון ששקיעת לחץ גבוה על הבוכנה עלולה להוציא חלק מה-LCP העמוס בקריסטלים יחד עם תמיסת המשקיע, מה שיוביל לאובדן חלקי או מלא של הדגימה. הפסיקו את דחיפת הבוכנה כאשר רוב המשקיע הוסר וה-LCP הצטבר בכניסה למחט.

בצע תהליך זה עבור המזרקים הנבחרים האחרים. כדי לאחד את דגימות ה-LCP שהתקבלו, חבר שני מזרקים באמצעות מחבר נקי. לחץ על הבוכנה במזרק אחד כדי להעביר את כל הדגימה ממזרק אחד לשני.

נתק את המזרק הריק. חזור על שלב זה כדי לאחד את כל חומר ה-LCP המכיל גבישים למזרק אחד. הסר כמה שיותר מהמשקיף.

הוסיפו כ-5 µL של 7.9 MAG או של הליפיד המארח MAG בעל השרשרת הקצרה המקורית למזרק ריק. חברו מזרק זה למזרק המכיל את הדגימה המאוחדת באמצעות מחבר מזרקים (syringe coupler), וערבבו על ידי לחיצות לסירוגין על בוכנות המזרקים. חזרו על התהליך עד שכל התמיסה הנותרת נספגה ונוצר LCP הומוגני ושקוף.

העבירו את כל דגימת ה-LCP המעורבבת למזרק אחד, ונתקו את המזרק הריק. חברו מחט טעינה של הזרקת LCP למזרק עם הדגימה המאוחדת. פלטו בזהירות כ-1 µL מדגימת ה-LCP על עלית זכוכית, וכסו אותה עם כיסוי זכוכית.

לחץ בעדינות על לית המכסה כדי לדחוס את הדגימה. צלם את דגימת ה-LCP תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה הגבוהה ביותר האפשרית, באמצעות תאורה בשדה בהיר ומקטבים מצולבים. במידת האפשר, צלם תמונות נוספות באמצעות מיקרוסקופ וסורק פלואורסצנציית UV כדי לאשר את קיומם של מיקרו-גבישי חלבון בדגימה.

העריכו את גודל הגבישים ואת צפיפותם. צפיפות הגבישים האידיאלית עבור ניסוי איסוף נתונים תלויה בגודל הגביש, בקוטר קרן ה-x-ray ובקוטר זרם ה-LCP, והיא צריכה להוביל לשיעור פגיעה בגבישים של כ-10 עד 40%. לבסוף, טענו את מזרק ה-LCP, ובצעו קריסטלוגרפיה סריאלית בפולסים קצרים של פמטו-שניות ב-LCP, או איסוף נתוני LCP SFX, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוצגים כאן מיקרו-גבישים של קולטן הסרוטונין בקומפלקס עם ארגוטמין, המצולמים באמצעות מצב מיקרוסקופ בשדה בהיר, ומצולמים באמצעות מצב מיקרוסקופ באור מקוטב מצולב.

המבנה של קומפלקס הקולטן לסרוטונין עם ארגוטמין התקבל בגישת LCP SFX. מוצגים כאן מיקרו-גבישים של קולטן ה-smoothant בקומפלקס עם ציקלופמין שתמונתם צולמה באמצעות מצב מיקרוסקופ בקיטוב צולב. המבנה של קומפלקס הקולטן עם ציקלופמין התקבל בגישת LCP SFX.

לאחר השליטה בפרוצדורה, ניתן לבצעה בפחות משעתיים אם היא מבוצעת כהלכה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי המבנה של חלבון ממברנה כמטרה, בשינוי קל ניתן להחילה גם על חלבונים אחרים. חשיבותה של טכניקה זו משתרעת עד לגילוי תרופות; מאחר שמבנים ברזולוציה גבוהה מספקים תבניות מצוינות של אינטראקציות סטנדרטיות בין ליגנאנים לחלבונים ומסייעים בתכנון תרופות יעילות יותר.