Name: שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: למד שיטות למדידת קצבי חמצון גלוקוז וחומצות שומן בלב עכברוש מבודד. פרוטוקול זה מאפשר ניטור בזמן אמת של מטבוליזם לבבי ותפקוד התכווצותי תחת תנאי עומש שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R00 HL112952 (ל-R.H.), R01 HL108618 (ל-J.P.G.), P01 HL051971 ו-P20 GM104357. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Neely, J. R., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+carbohydrate+and+lipid+metabolism+and+the+energy+balance+of+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle.</a> Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).</li>
<li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+regulation+of+load-induced+mTOR+signaling+and+ER+stress+in+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart.</a> J Am Heart Assoc. 2, e004796(2013).</li>
<li>Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+maladaptation+of+the+heart+in+diabetes%3A+Part+II%3A+potential+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms.</a> Circulation. 105, 1861-1870 (2002).</li>
<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).</li>
<li>Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mitochondrial+oxidative+metabolism+as+an+approach+to+treat+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).</li>
<li>Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+fatty+acid+and+carbohydrate+oxidation--a+novel+therapeutic+intervention+in+the+ischemic+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart.</a> Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).</li>
<li>Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+metabolism+as+a+target+for+the+treatment+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure.</a> Circulation. 110, 894-896 (2004).</li>
<li>Taegtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Cardiac+Metabolism%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circ Res. , (2016).</li>
<li>Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+measuring+in+vitro%2Fex+vivo+cardiac+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).</li>
<li>Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pressure+development+on+oxygen+consumption+by+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart.</a> Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).</li>
<li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochem J. 186, 701-711 (1980).</li>
<li>Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continuing+evolution+of+the+Langendorff+and+ejecting+murine+heart%3A+new+advances+in+cardiac+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).</li>
<li>Cingolani, O. H., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-volume+relation+analysis+of+mouse+ventricular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).</li>
<li>Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cardiac+function+using+pressure-volume+conductance+catheter+technique+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats.</a> Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).</li>
<li>Abraham, D., Mao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Pressure-Volume+Loop+Analysis+Using+Conductance+Catheters+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Harmancey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+improves+metabolic+and+contractile+efficiency+in+stressed+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart.</a> FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).</li>
<li>Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+long-chain+fatty+acid+oxidation+impairs+postischemic+recovery+of+the+insulin-resistant+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart.</a> FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).</li>
<li>Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+energy+metabolism+of+the+heart+during+acute+increase+in+heart+work%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work.</a> J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).</li>
<li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).</li>
<li>Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+increased+heart+work+on+the+tricarboxylate+cycle+and+its+interactions+with+glycolysis+in+the+perfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart.</a> Biochem J. 128, 147-159 (1972).</li>
<li>Katz, J., Dunn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-2-t+as+a+tracer+for+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism.</a> Biochemistry. 6, 1-5 (1967).</li>
<li>Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+electrophysiological+variables+in+blood-perfused+and+buffer-perfused%2C+isolated%2C+working+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart.</a> Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).</li>
<li>Qiu, Y., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ischemic+vulnerability+and+responsiveness+to+cardioplegic+protection+in+crystalloid-perfused+versus+blood-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).</li>
<li>Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketone+body+metabolism+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ketone body metabolism and cardiovascular disease.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).</li>
<li>Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+metabolism+in+heart+disease%3A+an+epiphenomenon+or+a+real+culprit%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?</a> Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).</li>
<li>Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+branched+chain+amino+acids+by+isolated+hearts+and+diaphragms+of+the+rat.+The+effect+of+fatty+acids%2C+glucose%2C+and+pyruvate+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration.</a> J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).</li>
<li>Liepinsh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+is+better+protected+against+myocardial+infarction+in+the+fed+state+compared+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state.</a> Metabolism. 63, 127-136 (2014).</li>
<li>Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+triacylglycerol-rich+lipoproteins+by+the+working+rat+heart%3A+routes+of+uptake+and+metabolic+fates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates.</a> J Physiol. 558, 225-237 (2004).</li>
<li>Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+turnover+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glycogen turnover in the isolated working rat heart.</a> J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).</li>
<li>Sender, P. M., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+rates+of+protein+in+the+Langendorff-perfused+rat+heart+in+the+presence+and+absence+of+insulin%2C+and+in+the+working+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart.</a> Biochem J. 132, 603-608 (1973).</li>
<li>Hindlycke, M., Jansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+tolerance+and+pancreatic+islet+blood+flow+in+rats+after+intraperitoneal+administration+of+different+anesthetic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Ups+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs.</a> Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).</li>
<li>Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia%27s+effects+on+plasma+glucose+and+insulin+and+cardiac+hexokinase+at+similar+hemodynamics+and+without+major+surgical+stress+in+fed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Anesthesia's effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats.</a> Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).</li>
<li>Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pentobarbital+appropriate+for+basal+anesthesia+in+the+working+rat+heart+model%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).</li>
<li>Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+anesthesia+on+cardiac+function+and+response+in+the+perfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).</li>
<li>Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sanguinarine+non-+versus+re-circulation+during+isolated+heart+perfusion--a+Jekyll+and+Hyde+effect%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Drugs+Ther%22%5BJournal%5D)">Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect?</a> Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).</li>
<li>Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+and+fatty+acid+metabolism+in+the+isolated+working+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart.</a> Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).</li>
<li>Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats%21+%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Rats! </a> Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הפרוטוקול הקודם מפרט את שיטות לכמת את השטף של המצע בו זמנית באמצעות חימצון גלוקוז וחמצון חומצות שומן בלב עכברוש עבודה מבודד. המדידות אז יכולות להיות על גבי לפרמטרים הפונקציונליים הלב נרשמו כדי לקבוע את הקשר בין מטבוליזם מצעים ולעבוד לב בתנאי בסיס ומתח (שינוי בעומס עבודה, איסכמיה-רה-פרפוזיה, וכו &#39;...). כמו כן ניתן להעריך כיצד יחסי מטבוליזם / התכווצות מושפעת תנאים קודמים כגון אי ספיקת לב וסוכרת. בנוסף, בלב מכרסמים גנטיים שונים ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעה של חלבון מס...

רלוונטי קליני בלב היונק, קיים קשר חיובי חזק בין השטף של מצעים דרך מסלולי מטבוליים חמצונים, דור ה- ATP ו -1 עבודת לב. במהלך שני העשורים האחרונים, חקירת הקישור המורכב בין מטבוליזם לב והתפקוד הובילה להכיר כי השינויים במטבוליזם לב הן גורמות לטיפול באין התכווצות ואולי שיפוץ מבני פתולוגיים את ההגדרה של סוגים שונים של מחלות לב 2-4. לכן, צפוי כי הבנתנו את המנגנונים השולטים שיפוץ המטבולית של הלב הדגיש תוביל לזיהוי מטרות טיפוליות למניעה או לטיפול באי ספיקת לב 5-7. הפרסום האחרון של קביעה מדעית מן איגוד הלב האמריקאי על &quot;הערכת מטבוליזם לב&quot; מדגיש את העניין הגובר של הקהילה המדעית לאבתחום המחקר שלו 8. אבל בעוד ההתקדמות הטכנולוגית בתחום ההדמיה הלב עכשיו לאפשר הערכה מדויקת ומהירה של מורפולוגיה לב ותפקוד, המחקר in vivo של מטבוליזם הלב נשאר מוגבל ומכבידות: תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) ו טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) יכול הדמיה להשתמש כדי לעקוב אחר מטבוליזם פוספט גבוה אנרגית לב ופעילות מחזור קרבס, אבל טכניקות אלה הם הטרידו עלויות תפעול גבוהות ועל ידי חוסר היכולת שלהם לקבוע את התרומה של מצעים שונים כדי מטבוליזם חמצונים בתנאים יציבים 9 .כדי למועד זה vivo לשעבר עבודה הכנה הלב מייצג את הטכניקה היחידה וייחודי לטובת לימודים, בו זמנית ובזמן אמת, הפונקציה התכווצות ושטף של מצעים לתוך מסלולים מטבוליים חמצוני 7,9. הפרוטוקול הבא נועד לספק הנחיות בהכנה וסילוק חומרים כימיים המשמשת לקביעת העכברושes של ניצול מצעים בלב עכברוש עבודה המבודד. מנגנון הלב המבודד עבודה המכרסמת למרות הטכניקה היא כמעט בן חצי מאה, הכנת לב עכברוש המבודדת עובדת נשארת שיטת הבחירה של מחקר לב וכלי דם. כמו במקרה של הכנת לב Langendorff, בלב מכרסמי עבודה מציע דרך פשוטה יחסית, אמינה, ולא יקרה כדי למדוד מגוון רחב של פרמטרי לב במנותק תופעות הבלבול של איברים אחרים, neurohormonal וגורם במחזור שני. אלא שבניגוד בלב-perfused Langendorff, בלב העבודה ממשיך לבצע עבודת לב הכמעט פיזיולוגית, דרישה מוקדמת עבור הדור של שטף מטבולים של חמצון לרמות שרלוונטיות תנאי in vivo. זו מושגת על ידי מתן למאגר זלוף אל החדר השמאלי (LV) באמצעות צינורית מחובר הפרוזדור השמאלי, וככל LV מילויי חוזים,החיץ נפלט דרך קו אב העורקים כנגד לחץ ההידרוסטטי afterload נחוש. העיצוב של מנגנון זלוף תאר במקור על ידי ונילי ועמיתיו 10 השתפרו לאחר מכן על ידי Taegtmeyer, אמרות שמלות וקרבס 11, אבל השתנה מעט מאוד מאז. כפי שתואר במנגנון המקורי, הפונקציה התכווצות ניתן להעריך באמצעות קביעת תפוקת הלב, באמצעות לא יותר משורה ו סטופר למדוד אבי העורקים הכליליים זורם 10,11. מספר ספקים מציעים כעת מערכות זלוף הלב מכרסם עבודה מלאה. ניתן לרכוש מסחרית אלה מנגנון זמין עם flowprobes, מתמרים ללחץ, קטטר לחץ-נפח וכל הציוד הדרוש לרכישת נתונים תפקודית לב וניתוח. הספקים לספק הפעלות תיעוד והכשרה מקיפות להכיר המשתמש החדש עם הציוד שלהם. מאמרי ביקורת אחדים גם פרוטוקולים בפירוט על instrum הלב עובדentation ועל השימוש צנתרים למדוד תפקוד הלב במכרסמים 12-15. מסיבה זו, אנו בקצרה רק לדבר על ההגדרה של מנגנון זלוף וציוד ההקלטה. הפרוטוקול הנוכחי דווקא שואפת להשלים את המידע שכבר זמין עם תיאור של שיטות שניתן ליישם בו זמנית למדוד את שיעורי גלוקוז וחמצון חומצות שומן ארוכות שרשרת, שני מצעים לספק אנרגיה מרכזי בלב נורמלי. אנו מתארים כאן את כל השלבים הכרוכים בשימוש מצעים אנרגיה radiolabeled להערכת מטבוליזם חמצוני שריר הלב, מן ההכנה של ריאגנטים מאגרים להתאוששות ועיבוד של דגימות, לניתוח נתונים. עקרונות השיטה Cardiomyocytes ליצור את חלק הארי של האנרגיה שלהם התכווצות מן זרחון חמצוני של חומצות שומן (חומצות שומן ארוכות שרשרת בעיקר) ופחמימות (glucosדואר ומיניקות). הלב מאוד מוגבל עתודות אנרגטיות מסתמך על אספקה ​​סדירה של מצעי מתן אלה אנרגיה מהמחזור. פירוק של גלוקוז דרך מסלול glycolytic מניב פירובט אשר decarboxylated מכן על ידי מורכבות פירובט דהידרוגנאז של קרום המיטוכונדריה הפנימית. חומצות שומן ארוכות שרשרת, המופק במחזור טריגליצרידים אלבומין או ליפופרוטאין, מופעלים הראשון למולקולות acyl-CoA reductase ב cytosol ובהמשך מועבר בתוך מטריקס המיטוכונדריה דרך הסעות קרניטין להיכנס מסלול-חמצון בטא. המולקולות-CoA אצטיל המיוצרות על ידי הפירוק של הגלוקוז וחומצות שומן לתדלק במעגל קרבס על מנת ליצור את ושווי הצמצום (NADH ו FADH 2) אשר נמצאים בשימוש על ידי שרשרת העברת אלקטרונים לבנות את כוח פרוטון-המניע פני קרום המיטוכונדריה הפנימי ליצור ATP דרך הפעילות של ה- ATP synthase. מים ופחמן דו חמצני הם תוצרי לוואי הסוףהתגובות האנזימטית המתרחשות בתוך במעגל קרבס. אספקת 14 C- ו -3 H- מצעים רדיואקטיבי (כגון 14 גלוקוז C-רדיואקטיבי ו -3 H-רדיואקטיבי חומצה אולאית) ללב עובד מבודד וכתוצאה מכך יוביל לייצור 14 CO 2 ו -3 H 2 O אשר יכול להיות התאושש כמותית מן השפכים כלילית. האוסף של 14 CO 2 מתבצע על ידי שמירה על לב perfused מבודד לתוך תא אטום על ידי מייד לשחזר את השפכים כלילית עם יציאתו בלב. טור אניוני קטן משמש להפריד ולשחזר 3 H 2 O מן השפכים כלילית. רדיואקטיביות ממדגמים המעובד נמדדת עם מונה נצנץ נוזלי, ועם ידע של הפעילות הספציפית של המצעים רדיואקטיבי בשימוש, אז זה ניתן בנפרד לכמת את השטף של גלוקוז וחומצה שומניחמצון מסלולי 16,17.

<table><tbody><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי הפטאהידרט (MgSO4*7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>AG 1-X8 שרף, צורת כלוריד, 100 - 200 גודל רשת יבשה, 500 גרם</td><td>Bio-Rad</td><td>1401441</td><td>ניתן להחליף פריט זה על ידי רכישה ישירה של צורת הידוקסיד&nbsp; (ראה הפניה למטה), אבל זה יעלה כמעט פי 8 יותר</td></tr><tr><td>שרף AG 1-X8, צורת הידרוקסיד, 100 - 200 גודל רשת יבשה, 100 גרם</td><td>Bio-Rad</td><td>1432445</td><td>רכישת פריט זה מאפשרת לעקוף את ההמרה של שרף חילופי האניונים מצורת הכלוריד לצורת ההידרוקסיד (ראה סעיף 1.2 לפרוטוקול)</td></tr> <tr><td>מחזיק מסנן ואקום מיקרואנליזה מזכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-753-2</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S318</td><td>מאכל. התייעץ עם המוצר MSDS לטיפול ואחסון מתאימים.</td></tr><tr><td>צינור פיזור גז עם צילינדר מטוגן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-138B</td><td></td></tr><tr><td>פרובומין בקר סרום אלבומין ללא חומצות שומן אלבומין, אבקת</td><td>EMD Millipore</td><td>820027</td><td>אנו ממליצים להשתמש ב-BSA נטול פחם, מכיוון שתהליך טיהור אחר כגון הפרדת אתנול קר עלול להשאיר שאריות רעילות ללב.</td></tr><tr><td>נתרן אולאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>O7501</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אולאית, [9,10-3H(N)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NET289005MC</td><td>חומר רדיואקטיבי. פעל בהתאם להנחיות המשרד לבטיחות קרינה של המוסד שלך להזמנה וטיפול.</td></tr><tr><td>צינורות ממברנה דיאליזה, קוטר 29 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז, D-[14C(U)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042B005MC</td><td>חומר רדיואקטיבי. פעל בהתאם להנחיות המשרד לבטיחות קרינה של המוסד שלך להזמנה וטיפול.</td></tr><tr><td>Humulin R U-100</td><td>Eli Lilly and Company</td><td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td><td></td></tr><tr><td>Inactin Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td>חומר מבוקר על USDEA Schedule III</td></tr><tr><td>3-0 משי צמה שחורה</td><td>Roboz כירורגית</td><td>SUT-15-3</td><td></td></tr><tr><td>10x היאמין הידרוקסיד</td><td>PerkinElmer</td><td>6003005</td><td>רעיל מאוד וגורם לכוויות קשות. התייעץ עם המוצר MSDS לטיפול ואחסון נאותים</td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ מזכוכית 20 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-341-25E</td><td>השתמש בבקבוקוני זכוכית לשחזור כמותי של 14CO2</td></tr><tr><td>20 ml בקבוקוני נצנוץ HDPE</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-337-23B</td><td>השתמש בבקבוקוני HDPE לשחזור כמותי של 3H2O</td></tr><tr><td>אדום פקקי שרוול גומי</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-126DD</td><td>Fit בקבוקוני נצנוץ של 20 מ"ל; </td></tr><tr><td>מחט BD PrecisionGlide לשימוש חוזר 23G x 40 מ"מ</td><td>BD</td><td></td><td>305194 השתמש להזרקת חומצה פרכלורית דרך פקק שרוול הגומי של מלכודת CO2</td></tr><tr><td>חומצה פרכלורית, 60%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A228</td><td>מאכל מאוד ועלול לשמש כמחמצן ו/או לגרום לסכנת פיצוץ. התייעץ עם המוצר MSDS לטיפול ואחסון נאותים</td></tr><tr><td>Ultima Gold, Scintillation Cocktail</td><td>PerkinElmer</td><td>6013327</td><td></td></tr><tr><td>Glass Wool</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38606</td><td></td></tr><tr><td>Decon Dri-Clean אבקת ניקוי</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355</td><td>לניקוי כלי זכוכית, חלקי פלסטיק וצינורות</td></tr><tr><td>Alconox Tergazyme Enzyme-Active</td><td>Detergent Switch Fisher מדעי</td><td>16-000-115</td><td>לניקוי משטחים "קשים לגישה" (צינורות, כלי זכוכית) המזוהמים בשאריות חומצת שומן-BSA</td></tr></tbody></table>

שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

הלב היונק הוא צרכני גדולה של ATP ודורש אספקה ​​קבועה של מצעי אנרגיה להתכווצות. באופן לא מפתיע, שינויים של חילוף החומרים בשריר הלב קושרו להתפתחות של ליקוי התכווצות ואי ספיקת לב. לכן, לפרום את הקשר בין מטבוליזם והתכווצות צריך לשפוך אור על כמה מן המנגנונים השולטים הסתגלות לב או maladaptation במדינות מחלה. הכנת לב עכברוש המבודדת עובדת יכולה לשמש כדי לעקוב אחר, בו זמני ובזמן אמת, פונקצית התכווצות לב שטף של אנרגית מתן מצעים לתוך מסלולי מטבוליים חמצונים. הפרוטוקול הנוכחי נועד לספק תיאור מפורט של השיטות המשמשות בהכנה וסילוק מאגרים למדידת כמותית של שיעורי חמצון עבור הגלוקוז וחומצות שומן, האנרגיה העיקרית בו תינתן מצעים של הלב. השיטות השונות שהופעלו לניתוח מדגם נתונים לפרשנות גם הם דנו.קיצורו של דבר, הטכניקה מבוססת על אספקת 14 C- גלוקוז רדיואקטיבי וכן 3 H- חומצת שומן ארוכת שרשרת רדיואקטיבי אל הלב הפועם vivo לשעבר דרך זלוף גְבִישָׁן normothermic. 14 CO 2 ו -3 H 2 O, תוצרי לוואי סוף התגובות האנזימטית המעורבות בניצול מצעי מתן אלה אנרגיה, הם התאוששו באופן כמותי מן השפכים כלילית. עם ידע של הפעילות הספציפית של המצעים רדיואקטיבי בשימוש, אז זה ניתן בנפרד לכמת את השטף של גלוקוז וחומצה שומני מסלולי החמצון. פונקצית התכווצות של הלב המבודד ניתן לקבוע במקביל ציוד ההקלטה המתאים ו בקורלציה ישירות לערכי שטף מטבולית. טכניקה זו שימושית מאוד ללמוד את הקשר מטבוליזם / התכווצות בתגובה לתנאי קיצון שונים כגון שינויים טרום ואחרי עומס איסכמיה, תרופה או circulaגורם טינג, או בעקבות שינוי בביטוי של תוצר הגן.

שני ניסויים נציג מתוארים באיורים הבאים. בשני המקרים, בלב עכברוש גבר בן 16 בשבוע ספראג Dawley היה מבודד perfused במצב עבודה עם חיץ KH מוכן לפי הפרוטוקול הקודם. בכל ניסוי, בלב היה נתון במצב מתח להשפיע עבודת לב. הפונקציה התכווצות הלב הוערכה על ידי הקלטה רציפה של לחץ הדופק באמצעות החדרת מתמר לחץ בקו אבי העורקים ועל ידי קביעת כוח הלב. ההשלכות של כל תנאי לחץ על ניצול מצעים לספק אנרגיה נקבעו בו זמנית על ידי מדידת שיעורי גלוקוז וחמצון oleate. <p class=...

הפרוטוקול הבא מתאר את ההכנה והניצול של חוצצים למדידה כמותית של שיעורי חמצון הגלוקוז וחומצות השומן בלב החולדה המבודד. נדונות גם השיטות המשמשות לניתוח מדגם ופרשנות נתונים.

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג מדידות סימולטניות בזמן אמת של שיעורי חמצון הגלוקוז וחמצון חומצות השומן במיוקרדיום, וכן את תפקודי התכווצות הלב בלב חולדה מבודד ופועל. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הקרדיווסקולרי, כגון האופן שבו הלב מסתגל מטבולית לשינויים חריפים בדרישות האנרגיה וכיצד תגובות אלו מושפעות במצבים פתולוגיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מעניקה לחוקר שליטה מלאה במשתנים הסביבתיים, כגון סוגם וריכוזם של סובסטראטים, תרופות או הורמונים המוגשים ללב. המדריכה היא Bhavisha Bakrania, עמיתת פוסט-דוקטורט ממרכז המשאבים הקרדיו-וריקולריים (cardiovascular Reno resource center) במרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי. כדי להתחיל, הפעילו את המשאבה כדי להכין (prime) את מערכת הפרפוזיה ולהחמצן את הבאפר.לאחר הכנת החומרים, הרדימו חולדה והכינו אותה לניתוח. גלחו את שערות הבטן ובצעו חתך בקו האמצע עם הרחבה לצדדים. הזיזו את הקיבה והמעי הצידה כדי לגשת לווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava) והזריקו 200 USP units של Heparin.המתינו חמש עד 10 שניות, ולאחר מכן גזרו בעזרת מספריים את הסרעפת ואת דפנות כלוב הצלעות כדי לחשוף את תכולת חלל החזה. לאחר מכן, אחזו בעדינות בלב באמצעות היד והוציאו את הלב והריאות יחד. גזרו בגובה האורטה היורדת (descending aorta), תוך הקפדה שלא לפגוע בקשת האורטה (aortic arch) ובאורטה העולה (ascending aorta) במהלך התהליך.העבירו מיד את הלב והריאות לכלי נתיחה מלא בבפר KH קר מאוד. לאחר שהלב מפסיק לפעום, למדו לעבוד במהירות כדי שניתן יהיה להחזיר אותו לפעולה תוך דקה או שתיים. כעת השקיעו את הלב והריאות בכלי חדש עם בפר KH קר מאוד.הסר במהירות חתיכות גדולות של רקמת ריאה, ולאחר מכן חתוך את האביון היורד (descending aorta) ממש מעל קשת האביון. עבור השלבים הבאים, נקט באמצעי הזהירות הנדרשים לשימוש בחומרים רדיואקטיביים. לאחר מכן, פתח בזהירות את האביון באמצעות פינצטה והחלק את הלב כלפי מעלה אל תוך הקנולה.היה זהיר מאוד שלא לחרוג ממסלול האורטה עם הקנולה, שכן הדבר עלול לגרום להיפופרפוזיה של הלב ולנזק למסממי האורטה. כעת, קבע את החיבור באמצעות מיקרו-קליפ והתחל בפרפוזיית Lagendorff של הלב. ללא חישוש, קבע את האורטה לקנולת האורטה באמצעות תפר משי 3 0 והסר את המיקרו-קליפ.לאחר מכן, אתרו את הווריד הריאתי והסירו רקמות שאינן שייכות ללב לפי הצורך. השאירו מספיק רקמה כדי לעגן את העליה השמאלית לקנולה. קנולציה של העליה השמאלית היא השלב השני הקריטי ביותר בפרוטוקול, שכן הכנסה לא נכונה של הקנולה או קיומה של דליפה יחלישו את ההתכווצויות ויפגעו בכימות של שיעורי המטבוליזם.בשלב הבא, הכינו את הקנולה לקו העלייה השמאלית, בדיוק כפי שנעשה עבור הקנולה הימנית. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, תפסו בעדינות את פתח הווריד הריאתי והחליקו את הלב למעלה על קנולת העלייה. הזיזו את הרקמות לפי הצורך מבלי לכופף את האורטה או להפעיל מאמץ יתר על הלב.לאחר מכן, קבעו את הקנולה באמצעות תפר משי 3 0. לבסוף, פתחו את קו העלייה (atrial line) ובמקביל העבירו את קו האבה (aortic line) למצב עבודה (working mode). אם בופר דולף מהעלייה השמאלית, סגרו את קו העלייה והעבירו שוב למצב Lagendorff.לאחר מכן, השתמש בתפרים נוספים כדי להבטיח את קיבוע הקנולה ונסה לעבור שוב למצב עבודה. אם הניסוי כולל מדידה ישירה של תפקוד ה-LV באמצעות קטטר, התחל בדקירת ה-LV apex באמצעות מחט gauge 26, הכנס קטטר למדידת לחץ ונפח ויישר את המוט עם הציר האורכי של ה-LV. לאחר מכן, מקם את האלקטרודה הדיסטלית E1 ממש מתחת למסתם האאורטלי, בסמוך לגבול האנדוקרדיאלי, ומקם את האלקטרודה הפרוקסימלית E4 ממש בתוך דופן הפרונטריקולר.כעת אטמו את הלב בתוך תא בעל מעטפת מים. לאחר מכן, התחילו בניטור הפרמטרים התפקודיים בתוכנה. ברגע שפרמטרי הבסיס היו יציבים למשך חמש דקות לפחות, התחילו בהקלטת הנתונים.כדי למדוד את זרימת הדם הכלילית, רשמו את הזמן הדרוש לאיסוף של 20 milliliters של נוזל עיבוי (effluent). לאחר מכן, שאבו שני milliliters מהנוזל למזרק באמצעות ברז תלת-כיווני והשליכו את השאר. העבירו מיד את הדגימה של שני milliliters למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה וקחו אליקוט של חצי milliliter כדי לקבוע את קצב חמצון הגלוקוז.שמור את השאר על קרח. המשך לדגום דגימות של זרימה כלילית (coronary effluence) במרווחי זמן קבועים, ולפני הסיום, הזרק 10 micro liters של תמיסת מלח היפרטונית לקו העליות. רגע לפני שהיא מתחברת לקנולה.השתמש בתגובה לבוליס זה כדי לחשב את המוליכות המקבילית (parallel conductance) לצורך קביעה מדויקת של נפח הלב. לאחר מכן, פתח את איטום חלל הלב והוצא את הקטטר מה-LV. לאחר מכן, חתוך את הלב מהקנולות והנח אותו בבופר KH קר במיוחד.לאחר השקילה, יש לבצע דיסקציה של דגימות הרקמה הנדרשות ולאחר מכן להקפיא את הרקמה הנותרת באמצעות פינצטה שקוללה על קרח יבש. כחלק מההכנה, מלאו מבחנות סינצילציה מזכוכית ב-1 mL של 10x hyamine hydroxide. הכינו מבחנה אחת לכל דגימת זרימה כלילית (coronary effluence) ושתיים לצורך ביקורת.מיד עם טעינת מבחנת הדגימה, העבר אותה ישירות לתוך מבחנת סינטילציה טעונה. לצורך הניתוח, סגור בעדינות את פיית המבחנה באמצעות פקק שרוול גומי ואטום את המבחנה בעזרת Parafilm. כעת, באמצעות מזרק של 1 ml עם מחט ארוכה במידה 23 gauge, הזרק 200 µL של 60% perchloric acid דרך שרוול הגומי.השאירו את כל מבחנות הדגימות למשך הלילה. למחרת, הוציאו בזהירות כל מבחנת דגימה בעזרת פינצטה ושטפו את תחתיתן לתוך המבחנות הפתוחות באמצעות 1 mL של תמיסת סנקיליציה (scintillation cocktail) כדי לאסוף את כל ה-hyamine hydroxide. לאחר מכן, הוסיפו 9 mL נוספים של תמיסת סנקיליציה לכל מבחנה.כדי לקבל את הפעילות הספציפית, הוסיפו 0.5 milliliters של בופר פרופוזיה (profusion buffer) לשניים מהמבחנות. כעת נערה את המבחנות בעוצמה והניחו להן לשקוע למשך שש שעות לפחות לפני ביצוע המדידות. כדי לקבוע את קצבי חמצון האולאט במיוקרדיום, הכינו תחילה עמודת שרף חליפי אניוני עבור כל דגימה.יש למלא את קצותיהם של צינורות מזרק בנפח 3 mL בצמר זכוכית. לאחר מכן, יש להוסיף את תרחיף השרף במים עד לסימון של 2 mL בכל עמודה באמצעות פיפטת העברה. בשלב הבא, יש לשטוף את השרף על ידי העברת 2 mL של מים אולטרה-טהורים דרך כל עמודה שלוש פעמים.לאחר מכן, הניחו מבחנות סינטילציה מתחת לעמודים וטענו את העמודים עם 0.5 ml של effluent כלילי. לצורך מדידת הרקע, השתמשו בתמיסת בופר לפרפוזיה. כעת, בצעו אלוציה של העמודים באופן עקבי עם 0.5 ml, 1 ml, ולבסוף 2 ml של מים אולטרה-טהורים.יש להשליך את העמודות. לאחר מכן, יש להוסיף 13 milliliters של תמיסת סינליצציה (scintillation cocktail) למבחנות. הוסף 0.5 milliliters של באפר פרפוזיה ישירות לשתי מבחנות המלאות ב-13 milliliters של תמיסת סינליצציה נוזלית לצורך קביעת הפעילות הסגולית.נערה את המבחנות בעוצמה, השאירו אותן להשקיע למשך שש שעות ומעלה ובצעו מדידות. לבבות בודדו משני חולדות בנות 16 שבועות והוכפפו לתנאי עקה שונים. עבור לב אחד, בוצע סימולציה של עלייה חדה בעומס העבודה על ידי הגדלת עומס לאחר-טעינה (after load) ב-40% והוספת epinephrine לתמיסת הפרופוזיה.קצב הלב עלה באופן מיידי ביותר מ-50% עם השראת קפיצת העומס. ההספק הלבבי עלה ביותר מ-40% בקפיצת העומס, אשר לווה בעלייה בשיעורי החמצון הן של גלוקוז והן של אולאט. העלייה היחסית מקו הבסיס עבור חמצון גלוקוז הייתה בולטת.הלב השני הוכפף ל-15 דקות של איסכמיה גלובלית ו-30 דקות של רפרפוזיה. תחת תנאים ניסיוניים אלו, לחץ דופק קרוב לנורמה הושב לאחר מספר דקות מהתחלת הרפרפוזיה. בתוך 10 דקות, ההספק הלבבי עלה במהירות אל מעל לערכי טרום-האיסכמיה, לפני שחזר לערכים קרובים לערכי הבסיס.תוצאה זו נבעה מחמצון מוגבר של אולאט. לעומת זאת, חמצון הגלוקוז חזר במהירות לרמת הפעילות שלפני האיסכמיה. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את בידוד הלב ועד ל reperfusion הראשוני במצב עבודה (working mode) בפחות מחמש דקות, אם הפעולה מבוצעת כראוי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ניתוחי ביטוי של RNA וחלבונים כדי לענות על שאלות נוספות, כגון השפעת תרופה או תנאי עקה על מסלולי איתות מולקולריים. יש לזכור כי עבודה עם סמני רדיו (radio tracers) עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מלא, בעת ביצוע הליך זה.

methods-for-determination-rates-glucose-fatty-acid-oxidation-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המטרה היא לפקח על המדינה חמזור המיטוכונדריה של לבבות בודדים בהקשר של preload פיזיולוגי ולחצים afterload. הלב biventricular לעבוד במודל ארנבת מוצג. רזולוציה גבוהה spatiotemporal הקרינה הדמיה של NADH משמש כדי לפקח על מצב חמזור המיטוכונדריה של הרקמה epicardial.

NADH Fluorescence הדמיה של Biventricular מבודדת עבודה לבבות ארנב

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

השיטות המוצגות מספקות הוראות שלב אחר שלב לביצוע אוסף של בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרו-צלחת באמצעות מיטוכונדריה מבודדת מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר. מבחנים אלה מסוגלים למדוד שינויים/התאמות מכניסטיות בצריכת החמצן המיטוכונדריאלית במודל נפוץ של בעלי חיים.

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

גליקוליזה היא סמן מטבולי מגדיר במערכות ביולוגיות מרובות. ניטור גליקוליזה על ידי מדידת השטף החוץ-תאי של H+ הוא נפוץ, אך דורש תיקון כמותי וחד משמעי. כאן, אנו מדגימים כיצד לאסוף ולתקן נתוני שטף חוץ-תאי כדי להבחין בין מקורות נשימתיים וגליקוליטיים של החמצה חוץ-תאית.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

חקר חילוף החומרים הופך רלוונטי יותר ויותר למחקר אימונולוגי. כאן, אנו מציגים שיטה אופטימלית למדידת גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית בטחול עכברים, ולימפוציטים T ו-B.

פרוטוקול אופטימיזציה כדי לנתח הגליקוליזה מיטוכונדריאלי הנשימה לימפוציטים

כאן אנו מציגים שיטה לשימוש צנתר אופטי פנים-חדר בלבבות מעשה כדי לבצע ספקטרוסקופיה ספיגת על פני קיר הלב. הנתונים שהושגו מספק מידע חזק על מתח החמצן ברקמות, כמו גם ניצול מצע ופוטנציאל הממברנה במקביל עם ביצועים מדדים לב בהכנה זו בכל מקום.

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

ויסות שלם של ספיגת גלוקוז בשרירים חשוב לשמירה על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף. פרוטוקול זה מציג הערכה של ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ודגירה כאשר הם מתארים את ההשפעה של התערבויות פיזיולוגיות שונות על חילוף החומרים של גלוקוז בכל הגוף.

מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים

חמצון β חומצות שומן הוא מסלול מטבולי חיוני האחראי על הפקת אנרגיה בסוגי תאים רבים ושונים, כולל הפטוציטים. כאן אנו מתארים שיטה למדידת חמצון-β חומצות שומן בהפטוציטים ראשוניים שזה עתה בודדו באמצעות 14חומצה פלמיטית המסומנת כ-C.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

מתואר כאן פרוטוקול מפורט לביצוע בדיקת מתח מיטוכונדריאלית ובוחן קצב גליקוליטי בדגימות רקמת רשתית ex vivo באמצעות ביואנלייזר מסחרי.

קביעת נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בדגימות רקמת רשתית Ex Vivo

אנו מתארים מערך ניסיוני לניהול מטבוליטים היפרפולריים 13בעלי תווית C במצב זילוח רציף ללב עכבר מבודד ומחורר. גישה ייעודית לרכישת 13C-NMR אפשרה לכמת את פעילות האנזים המטבולי בזמן אמת, וניתוח מולטי-פרמטרי של 31P-NMR איפשר לקבוע את תכולת ה-ATP וה-pH של הרקמה.

חקירת חילוף החומרים הלבבי בלב עכבר מבודד עם היפרפולריזציה [1-13C] פירובט וספקטרוסקופיית NMR 13C/31P

למד שיטות למדידת קצבי חמצון גלוקוז וחומצות שומן בלב עכברוש מבודד. פרוטוקול זה מאפשר ניטור בזמן אמת של מטבוליזם לבבי ותפקוד התכווצותי תחת תנאי עומש שונים.

שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד

גלה סרטונים נוספים