שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד
28 בספטמבר 2016
הפרוטוקול הבא מתאר את ההכנה והניצול של חוצצים למדידה כמותית של שיעורי חמצון הגלוקוז וחומצות השומן בלב החולדה המבודד. נדונות גם השיטות המשמשות לניתוח מדגם ופרשנות נתונים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג מדידות סימולטניות בזמן אמת של שיעורי חמצון הגלוקוז וחמצון חומצות השומן במיוקרדיום, וכן את תפקודי התכווצות הלב בלב חולדה מבודד ופועל. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הקרדיווסקולרי, כגון האופן שבו הלב מסתגל מטבולית לשינויים חריפים בדרישות האנרגיה וכיצד תגובות אלו מושפעות במצבים פתולוגיים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מעניקה לחוקר שליטה מלאה במשתנים הסביבתיים, כגון סוגם וריכוזם של סובסטראטים, תרופות או הורמונים המוגשים ללב. המדריכה היא Bhavisha Bakrania, עמיתת פוסט-דוקטורט ממרכז המשאבים הקרדיו-וריקולריים (cardiovascular Reno resource center) במרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי. כדי להתחיל, הפעילו את המשאבה כדי להכין (prime) את מערכת הפרפוזיה ולהחמצן את הבאפר.
לאחר הכנת החומרים, הרדימו חולדה והכינו אותה לניתוח. גלחו את שערות הבטן ובצעו חתך בקו האמצע עם הרחבה לצדדים. הזיזו את הקיבה והמעי הצידה כדי לגשת לווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava) והזריקו 200 USP units של Heparin.
המתינו חמש עד 10 שניות, ולאחר מכן גזרו בעזרת מספריים את הסרעפת ואת דפנות כלוב הצלעות כדי לחשוף את תכולת חלל החזה. לאחר מכן, אחזו בעדינות בלב באמצעות היד והוציאו את הלב והריאות יחד. גזרו בגובה האורטה היורדת (descending aorta), תוך הקפדה שלא לפגוע בקשת האורטה (aortic arch) ובאורטה העולה (ascending aorta) במהלך התהליך.
העבירו מיד את הלב והריאות לכלי נתיחה מלא בבפר KH קר מאוד. לאחר שהלב מפסיק לפעום, למדו לעבוד במהירות כדי שניתן יהיה להחזיר אותו לפעולה תוך דקה או שתיים. כעת השקיעו את הלב והריאות בכלי חדש עם בפר KH קר מאוד.
הסר במהירות חתיכות גדולות של רקמת ריאה, ולאחר מכן חתוך את האביון היורד (descending aorta) ממש מעל קשת האביון. עבור השלבים הבאים, נקט באמצעי הזהירות הנדרשים לשימוש בחומרים רדיואקטיביים. לאחר מכן, פתח בזהירות את האביון באמצעות פינצטה והחלק את הלב כלפי מעלה אל תוך הקנולה.
היה זהיר מאוד שלא לחרוג ממסלול האורטה עם הקנולה, שכן הדבר עלול לגרום להיפופרפוזיה של הלב ולנזק למסממי האורטה. כעת, קבע את החיבור באמצעות מיקרו-קליפ והתחל בפרפוזיית Lagendorff של הלב. ללא חישוש, קבע את האורטה לקנולת האורטה באמצעות תפר משי 3 0 והסר את המיקרו-קליפ.
לאחר מכן, אתרו את הווריד הריאתי והסירו רקמות שאינן שייכות ללב לפי הצורך. השאירו מספיק רקמה כדי לעגן את העליה השמאלית לקנולה. קנולציה של העליה השמאלית היא השלב השני הקריטי ביותר בפרוטוקול, שכן הכנסה לא נכונה של הקנולה או קיומה של דליפה יחלישו את ההתכווצויות ויפגעו בכימות של שיעורי המטבוליזם.
בשלב הבא, הכינו את הקנולה לקו העלייה השמאלית, בדיוק כפי שנעשה עבור הקנולה הימנית. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, תפסו בעדינות את פתח הווריד הריאתי והחליקו את הלב למעלה על קנולת העלייה. הזיזו את הרקמות לפי הצורך מבלי לכופף את האורטה או להפעיל מאמץ יתר על הלב.
לאחר מכן, קבעו את הקנולה באמצעות תפר משי 3 0. לבסוף, פתחו את קו העלייה (atrial line) ובמקביל העבירו את קו האבה (aortic line) למצב עבודה (working mode). אם בופר דולף מהעלייה השמאלית, סגרו את קו העלייה והעבירו שוב למצב Lagendorff.
לאחר מכן, השתמש בתפרים נוספים כדי להבטיח את קיבוע הקנולה ונסה לעבור שוב למצב עבודה. אם הניסוי כולל מדידה ישירה של תפקוד ה-LV באמצעות קטטר, התחל בדקירת ה-LV apex באמצעות מחט gauge 26, הכנס קטטר למדידת לחץ ונפח ויישר את המוט עם הציר האורכי של ה-LV. לאחר מכן, מקם את האלקטרודה הדיסטלית E1 ממש מתחת למסתם האאורטלי, בסמוך לגבול האנדוקרדיאלי, ומקם את האלקטרודה הפרוקסימלית E4 ממש בתוך דופן הפרונטריקולר.
כעת אטמו את הלב בתוך תא בעל מעטפת מים. לאחר מכן, התחילו בניטור הפרמטרים התפקודיים בתוכנה. ברגע שפרמטרי הבסיס היו יציבים למשך חמש דקות לפחות, התחילו בהקלטת הנתונים.
כדי למדוד את זרימת הדם הכלילית, רשמו את הזמן הדרוש לאיסוף של 20 milliliters של נוזל עיבוי (effluent). לאחר מכן, שאבו שני milliliters מהנוזל למזרק באמצעות ברז תלת-כיווני והשליכו את השאר. העבירו מיד את הדגימה של שני milliliters למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה וקחו אליקוט של חצי milliliter כדי לקבוע את קצב חמצון הגלוקוז.
שמור את השאר על קרח. המשך לדגום דגימות של זרימה כלילית (coronary effluence) במרווחי זמן קבועים, ולפני הסיום, הזרק 10 micro liters של תמיסת מלח היפרטונית לקו העליות. רגע לפני שהיא מתחברת לקנולה.
השתמש בתגובה לבוליס זה כדי לחשב את המוליכות המקבילית (parallel conductance) לצורך קביעה מדויקת של נפח הלב. לאחר מכן, פתח את איטום חלל הלב והוצא את הקטטר מה-LV. לאחר מכן, חתוך את הלב מהקנולות והנח אותו בבופר KH קר במיוחד.
לאחר השקילה, יש לבצע דיסקציה של דגימות הרקמה הנדרשות ולאחר מכן להקפיא את הרקמה הנותרת באמצעות פינצטה שקוללה על קרח יבש. כחלק מההכנה, מלאו מבחנות סינצילציה מזכוכית ב-1 mL של 10x hyamine hydroxide. הכינו מבחנה אחת לכל דגימת זרימה כלילית (coronary effluence) ושתיים לצורך ביקורת.
מיד עם טעינת מבחנת הדגימה, העבר אותה ישירות לתוך מבחנת סינטילציה טעונה. לצורך הניתוח, סגור בעדינות את פיית המבחנה באמצעות פקק שרוול גומי ואטום את המבחנה בעזרת Parafilm. כעת, באמצעות מזרק של 1 ml עם מחט ארוכה במידה 23 gauge, הזרק 200 µL של 60% perchloric acid דרך שרוול הגומי.
השאירו את כל מבחנות הדגימות למשך הלילה. למחרת, הוציאו בזהירות כל מבחנת דגימה בעזרת פינצטה ושטפו את תחתיתן לתוך המבחנות הפתוחות באמצעות 1 mL של תמיסת סנקיליציה (scintillation cocktail) כדי לאסוף את כל ה-hyamine hydroxide. לאחר מכן, הוסיפו 9 mL נוספים של תמיסת סנקיליציה לכל מבחנה.
כדי לקבל את הפעילות הספציפית, הוסיפו 0.5 milliliters של בופר פרופוזיה (profusion buffer) לשניים מהמבחנות. כעת נערה את המבחנות בעוצמה והניחו להן לשקוע למשך שש שעות לפחות לפני ביצוע המדידות. כדי לקבוע את קצבי חמצון האולאט במיוקרדיום, הכינו תחילה עמודת שרף חליפי אניוני עבור כל דגימה.
יש למלא את קצותיהם של צינורות מזרק בנפח 3 mL בצמר זכוכית. לאחר מכן, יש להוסיף את תרחיף השרף במים עד לסימון של 2 mL בכל עמודה באמצעות פיפטת העברה. בשלב הבא, יש לשטוף את השרף על ידי העברת 2 mL של מים אולטרה-טהורים דרך כל עמודה שלוש פעמים.
לאחר מכן, הניחו מבחנות סינטילציה מתחת לעמודים וטענו את העמודים עם 0.5 ml של effluent כלילי. לצורך מדידת הרקע, השתמשו בתמיסת בופר לפרפוזיה. כעת, בצעו אלוציה של העמודים באופן עקבי עם 0.5 ml, 1 ml, ולבסוף 2 ml של מים אולטרה-טהורים.
יש להשליך את העמודות. לאחר מכן, יש להוסיף 13 milliliters של תמיסת סינליצציה (scintillation cocktail) למבחנות. הוסף 0.5 milliliters של באפר פרפוזיה ישירות לשתי מבחנות המלאות ב-13 milliliters של תמיסת סינליצציה נוזלית לצורך קביעת הפעילות הסגולית.
נערה את המבחנות בעוצמה, השאירו אותן להשקיע למשך שש שעות ומעלה ובצעו מדידות. לבבות בודדו משני חולדות בנות 16 שבועות והוכפפו לתנאי עקה שונים. עבור לב אחד, בוצע סימולציה של עלייה חדה בעומס העבודה על ידי הגדלת עומס לאחר-טעינה (after load) ב-40% והוספת epinephrine לתמיסת הפרופוזיה.
קצב הלב עלה באופן מיידי ביותר מ-50% עם השראת קפיצת העומס. ההספק הלבבי עלה ביותר מ-40% בקפיצת העומס, אשר לווה בעלייה בשיעורי החמצון הן של גלוקוז והן של אולאט. העלייה היחסית מקו הבסיס עבור חמצון גלוקוז הייתה בולטת.
הלב השני הוכפף ל-15 דקות של איסכמיה גלובלית ו-30 דקות של רפרפוזיה. תחת תנאים ניסיוניים אלו, לחץ דופק קרוב לנורמה הושב לאחר מספר דקות מהתחלת הרפרפוזיה. בתוך 10 דקות, ההספק הלבבי עלה במהירות אל מעל לערכי טרום-האיסכמיה, לפני שחזר לערכים קרובים לערכי הבסיס.
תוצאה זו נבעה מחמצון מוגבר של אולאט. לעומת זאת, חמצון הגלוקוז חזר במהירות לרמת הפעילות שלפני האיסכמיה. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את בידוד הלב ועד ל reperfusion הראשוני במצב עבודה (working mode) בפחות מחמש דקות, אם הפעולה מבוצעת כראוי.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ניתוחי ביטוי של RNA וחלבונים כדי לענות על שאלות נוספות, כגון השפעת תרופה או תנאי עקה על מסלולי איתות מולקולריים. יש לזכור כי עבודה עם סמני רדיו (radio tracers) עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מלא, בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את ההכנה והשימוש בתמיסות בופר למדידת קצבי חמצון של גלוקוז וחומצות שומן בלב חולדה מבודד ופעיל. מטרתו היא לספק תובנות בזמן אמת לגבי הסתגלות מטבולית של השריר הלבבי תחת דרישות אנרגיה משתנות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פיזיולוגיה של מערכת הלב וכלי הדם
- ניתוח מטבולי
- הערכת תפקוד הלב
רקע
- הבנת חילוף החומרים של הלב היא קריטית למחקר קרדיווסקולרי.
- שינויים חריים בדרישות האנרגיה משפיעים על תפקוד הלב.
- שיטה זו מאפשרת שליטה על משתנים סביבתיים.
- היא יכולה לחשוף תובנות לגבי מצבים פתולוגיים המשפיעים על הלב.
מטרת המחקר
- למדידת קצבי חמצון הגלוקוז וחומצות השומן בו-זמנית.
- להערכת תפקוד התכווצות הלב בזמן אמת.
- לבדיקת הסתגלויות מטבוליות בלב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות בופר לפרפוזיה.
- שימוש במודל של לב חולדה מבודד (working heart).
- מדידה בזמן אמת של קצבים מטבוליים.
- בקרת ריכוזי סובסטרט והורמונים.
תוצאות עיקריות
- הושגה מדידה סימולטנית של חמצון גלוקוז וחומצות שומן.
- התקבלו תובנות לגבי תגובות מטבוליות לדרישות אנרגיה.
- השלכות פוטנציאליות להבנת מחלות לב.
- הוכשרה שליטה בתנאי הניסוי.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את ההבנה של המטבוליזם הלבבי.
- היא מספקת מסגרת למחקרים קרדיווסקולריים עתידיים.
- מחקרים נוספים יכולים לבחון התאמות פתולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
שיטה זו מאפשרת כימות סימולטני ובזמן אמת של חמצון גלוקוז וחומצות שומן במודל של לב עובד ex vivo, ובכך מספקת תובנה ישירה לגבי ניצול סובסטראט תחת עקה מטבולית מבוקרת. באמצעות קישור של שטף מטבולי לתפקוד התכווצותי, היא תומכת בהורדת סיכונים מכניסטית בתהליכי תיקוף של מטרות קרדיווסקולריות ובבחירת מודלים פרה-קליניים. גישה זו מציעה פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכת האופן שבו הפרעות גנטיות, פרמקולוגיות או איסכמיות משפיעות על מטבוליזיית האנרגיה של הלב, ובכך מסייעת בקבלת החלטות מוקדמות של go/no-go במסלולי גילוי תרופות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות האופן שבו מטרות או מסלולים ספציפיים מושפעים מחמצון גלוקוז וחומצות שומן ברקמת לב שלמה.
- ערך תפעולי: מספק קריאה סטנדרטית בזמן אמת של שטף מטבולי, התומכת בתיקוף פונקציונלי של מטרות ובצמצום סיכונים של מסלולים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי תרכובות המנרמלות שינויים מטבוליים לא-סתגלוניים הקשורים לתפקוד לקוי של הלב.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת מדידות כמותיות המבוססות על סימון רדיואקטיבי של חמצון סובסטרט, שניתן להשתמש בהן כדי לתקף פנוטיפים מטבוליים במערכי סינון של תרכובות.
- הדירות: פורמט הלב המבודד הפועל מאפשר שליטה מדויקת בתנאי הפרפוזיה, מה שמאפשר מדידות עקביות של שטף מטבולי בין חזרות ניסיוניות.
- יכולת הרחבה: תומך בבדיקה של תנאים מרובים (למשל, מינוני תרופות, פגיעות איסכמיות, מודלים גנטיים) במסגרת פיזיולוגית סטנדרטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל התאמות מטבוליות הנצפות באיסכמיה, עומס לחץ ומסגרת של סטרס נוירוהומוראלי, ובכך מאפשר הערכה פרה-קלינית של משנים מטבוליים.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין תגובות מטבוליות חריות לבין התאוששות התכווצית, ובכך תומך בהערכת יעילות טיפולית המותאמת לסמנים ביולוגיים.
- קידום מותאם סיכונים: פרופילי התאוששות מטבולית מסייעים לקבלת החלטות go/no-go על ידי הבחנה בין התאמות פיצויים להתאמות פתולוגיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך אופטימיזציה של מובילים ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובמיוחד עבור תוכניות קרדיווסקולריות המתמקדות במודולציה מטבולית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי חשיפת האופן שבו מטרות משפיעות על העדפת סובסטראט ועל שטף מטבולי בזמן אמת.
- סריקה: מספקת שיעורי חמצון כמותיים המאפשרים ניתוח של קשר מבנה-פעילות עבור מודולטורים מטבוליים.
- אנליזה: מספקת מדידות ישירות של ייצור 14CO2 ו-3H2O, המאפשרות חישוב מדויק של שטף הקשור לפעילות ספציפית של סובסטראטים מסומנים רדיואקטיבית.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין שינויים מטבוליים חריפים לבין התאוששות תפקודית, ובכך תומכת בהכללה למודלים פרה-קליניים של מחלות.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת תפקוד מטבולי לבבי במגוון פרויקטים ושיטות טיפוליות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות באופן שבו מטרות משפיעות על חילוף החומרים האנרגטי של הלב.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מדידת שטף מטבולי באמצעות פרפוזיה מבוקרת והשבה של רדיוטרייסר.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור גילוי מוקדם של תרכובות שאינן פעילות מטבולית או תרכובות בעלות השפעות שליליות.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על תיעדוף מועמדים מותאם-סיכון בהתבסס על יעילות מטבולית ואותי בטיחות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוחים קרדיווסקולריים במכרסמים, בטיפול ברדיוטרייסרים ובספירת סינצילציה.
- תלוי בגישה לציוד פרפוזיה, לסובסטרטים מסומנים רדיו-אקטיבית (14C-glucose, 3H-oleate) ולסופרי סינצילציה.
- מחייב פרוטוקולי בטיחות בקרינה והכשרה לטיפול בחומרים רדיואקטיביים.
- התאמה למינים אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש התאמות בפרוטוקולים הכירורגיים ובפרוטוקול הפרפוזיה.
- מוגבל בשל אופיו של המודל כ-ex vivo, שבו חסרים מנגנוני משוב נוירוהומוראליים ומערכתיים הקיימים in vivo.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Rat Heart Isolation and Cannulation
4:51
Measurement of Cardiac Function and Sample Collection
7:17
Determination of Myocardial Glucose Oxidation Rate
8:48
Determination of Myocardial Oleate Oxidation Rates
10:14
Results: Measurements from Two Stressed Hearts
11:40
Conclusion
