בדיית Thermoresponsive Hydrogels מתכלה-פיסיקליות מרובים באמצעות שחול תגובתי, מיקרופלואידיקה, הרכבה עצמית, Electrospinning
16 באפריל 2018
פרוטוקולים מתוארים להרכבת מתכלה thermoresponsive hydrogels מבוסס על hydrazone cross-linking של oligomers פולימריים על הסולם בתפזורת, microscale, ו ננו, והשני עבור הכנת ג'ל חלקיקים והן nanofibers.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לייצר גרסאות מתכלות של הידרוג'לים מגיבים תרמית עם סולמות אורך וגיאומטריות מבוקרים. שיטה זו יכולה לסייע בהתמודדות עם אתגרים מרכזיים בתרחיש של חומרים ביו-רפואיים כגון הקלה על אספקת תרופות מקומיות זעיר פולשניות לטווח ארוך, יצירת פיגומים מגיבים להנדסת רקמות או תכנון ננו-טיפולים ממוקדים. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא כימיה מהירה של ביוהידרזון הפוכה המאפשרת לנו לשלוט בגודל ובצורה של ההידרוג'לים המתכלים על ידי שינוי גיאומטריית הערבוב של מבשר הפולימר.
גמישות זו מאפשרת לנו לייצר ג'לים פוליים, מיקרוג'לים, ננו-ג'לים וננו-סיבים, כולם מאותו חומר מוצא. ראשית, הכינו כשני מיליליטר כל אחד של תמיסות פולימר מבשר מגיבות תרמית מתפקדות הידרזיד ואלדהיד עם ריכוזים בין חמישה ל-40% במשקל ו-10 מילי-מולרי פוספט מלוח. השתמש במזרקי חבית בודדת כדי להעמיס את תמיסות הפולימר המבשר לחביות נפרדות של מזרק 2.5 מיליליטר, 1:1 חבית כפולה.
לאחר מכן, חבר מערבל סטטי בגודל 1.5 אינץ' למזרק 2.5 מיליליטר 1:1 חבית כפולה. אם תרצה, חבר מחט בגודל 18 או 20 בגודל 1.5 אינץ' למיקסר הסטטי. לאחר מכן, חותכים מגיליון גומי סיליקון רך בעובי הרצוי.
יצירה בגודל של שקופית מיקרוסקופ רגילה. השתמש בסט אגרוף כדי לנקב לפחות חור אחד בצורה הרצויה לתוך יריעת גומי הסיליקון. הנח את תבנית גומי הסיליקון על מגלשת זכוכית נקייה, וודא שכל החורים מגובים בזכוכית.
לחץ בעדינות את התבנית על השקופית כדי לקבע אותה במקומה. יריעות גומי סיליקון עשויות לשמש גם כגיבוי כדי להבטיח הידבקות טובה של המצע. Co מוציאים את תמיסות הפולימר הפונקציונליות של הידרזיד ואלדהיד דרך המיקסר הסטטי לבארות התבנית עד למילוי הבארות לחלוטין.
מכסים את התבנית בשקופית זכוכית נקייה שנייה ומחכים לסיום הג'לציה. לאחר מכן, הסר את השקופית העליונה והשתמש במרית כדי להפריד את ההידרוג'לים מתבנית גומי הסיליקון. הרם את התבנית מהמגלשה כדי לשחזר את ההידרוג'לים.
לפני ההליך, יש לייצר שבב מיקרופלואידית ליצירת המיקרו-חלקיקים. לסנתז הידרזיד ואלדהיד פולי NIPAM פונקציונלי. כדי להתחיל, הכינו שני מיליליטר כל אחד של 6%לפי תמיסות משקל של הידרזיד ואלדהיד פולי NIPAM פונקציונלי במים נטולי יונים.
טען את תמיסות מבשר הפולימר למזרקים נפרדים של חמישה מיליליטר. לאחר מכן, הכינו 150 מיליליטר של תמיסה של 1%לפי משקל של סורביטן מונואולאט בשמן פרפין כבד. טען תמיסה זו בשני מזרקים סטנדרטיים של 60 מיליליטר.
הרכיבו את ארבעת המזרקים במשאבות מזרק עירוי נפרדות. לאחר מכן, חבר צינור סיליקון באורך 45 ס"מ לשקע השבב המיקרופלואידי. הנח את קצה צינור היציאה במיכל פסולת.
חבר את מזרקי תמיסת הפולימר לתעלות כניסת הפולימר על השבב המיקרופלואידי באורך של 30 סנטימטרים של צינורות סיליקון. חבר מזרק תמיסת שמן פרפין אחד לתעלת כניסת השמן במעלה הזרם עם צינורות סיליקון. חבר את מזרק השמן השני לשתי תעלות כניסת השמן במורד הזרם באמצעות צינורות סיליקון ומפרק מזרק בצורת U.
הגדר את קצב הזרימה של המשאבות המצוידות במזרקי שמן בין 1.1 ל -5.5 מיליליטר לשעה. הזרימו שמן דרך השבב המיקרופלואידי למשך 30 דקות לפחות כדי לטשטש את השבב ולוודא שהשבב נקי מפגמים. לאחר מכן, ספקו בו זמנית את שני פתרונות הפולימר לשבב הדרוך ב-03 מ"ל לשעה.
אפשר לזרימת הפולימר והשמן להתייצב למשך 30 דקות עד שעה. כדי למנוע ג'לציה מוקדמת של הפולימרים הקודמים בזרבובית המיקרופלואידית, חיוני לקדם בזהירות את הצינור ולהתחיל את זרימת הפולימר בדיוק באותו זמן כדי למנוע זרימה חוזרת לתוך כל אחד ממאגרי הפולימרים. לאחר שנוצרים מיקרו-חלקיקי ג'ל אחידים בזרבובית של השבב המיקרופלואידי, אסוף את החלקיקים בצינור צנטריפוגה מפלסטיק עם מוט ערבוב מגנטי פעיל.
עצור את משאבות המזרק ואת מנוע הערבוב לאחר צריכת השמן. לאחר שחלקיקי הג'ל התיישבו בצינור, שפכו את שמן הפרפין בעזרת פיפטה. הוסף לבקבוק 10 מיליליטר פנטן על כל 5 מ"ל מיקרו-חלקיקים.
מערבבים במרץ את הרגש למשך כדקה. הניחו לחלקיקים להתיישב במשך שעה עד שעתיים לפני שרוקנים את הפנטן בעזרת פיפטה. חזור על שטיפת הפנטן הזו לפחות חמש פעמים.
העבירו את חלקיקי הג'ל השטופים לבקבוקון נצנוץ זכוכית קטן. השעו מחדש את החלקיקים במיליליטר אחד עד שניים של מים נטולי יונים. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו חמישה מיליליטר כל אחד של 1% תמיסות של הידרזיד ופולי NIPAM מתפקדים על ידי אלדהיד במים נטולי יונים.
מחממים חמישה מיליליטר מתמיסת הפולי NIPAM המתפקדת בהידרזיד ל-70 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב. עקוב אחר התמיסה כשהיא הופכת אטומה וודא שלא נוצרים משקעים גלויים. לאחר מכן, הוסף 0.25 מיליליטר של תמיסת הפולי NIPAM הפונקציונלית של אלדהיד טיפה לתמיסת הפולי NIPAM המחוממת המתפקדת על ידי הידרזיד במהלך חמש עד 10 שניות.
מערבבים את התערובת במשך 15 דקות בחום של 70 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוציאו את התערובת מאמבט השמן והניחו לה להתקרר לטמפרטורת החדר במשך הלילה כדי לקבל את הננו-ג'ל לטיהור. מניחים את תערובת הננו ג'ל בקרום דיאליזה מנותק במשקל מולקולרי של 3500 קילו-דלטון.
דיאליזה של הננו-ג'לים כנגד מים מיונים שש פעמים במשך שש שעות במחזורים כדי להסיר פולימרים שאינם מקושרים. אם תרצה, ליופיליזציה של הננו-ג'לים המטוהרים לאחסון. כדי להתחיל בהליך ייצור ננו-סיבי ג'ל, הכינו מיליליטר אחד כל אחד של 15% לפי תמיסות משקל של הידרזיד ו-POEGMA מתפקדת אלדהיד במים נטולי יונים.
לאחר מכן, הכינו שני מיליליטר של תמיסה של 5% לפי משקל של תחמוצת פוליאתילן במשקל מולקולרי גבוה במים נטולי יונים. שלב כל תמיסת מבשר POEGMA עם מיליליטר אחד של תמיסת תחמוצת הפוליאתילן. טען את תמיסות המבשר לחביות נפרדות של מזרק הקנה הכפול.
לאחר מכן, חבר מערבל סטטי בגודל 1.5 אינץ' ומחט קהה בגודל 18 למזרק 2.5 מיליליטר, 1:1 חבית כפולה. התקן את מזרק הקנה הכפול על משאבת מזרק עירוי. לאחר מכן, הרכיב אספן אלקטרוספינינג של דיסק אלומיניום 10 סנטימטרים מקצה המחט.
הארקה של ספק כוח במתח גבוה בקולט וחברה את ספק הכוח למחט. הגדר את משאבת המזרק ל-0.48 מיליליטר לשעה ואת אספקת החשמל ל-10 קילו-וולט. הפעל בו זמנית את משאבת המזרק ואת ספק הכוח כדי ליזום אלקטרו-ספינינג.
המשך עד להגעה לעובי הרצוי או למיצוי המבשרים. לאחר סיום ייצור הננו-סיבים, כבה ונתק את מכלול האלקטרו-ספינינג. משרים את ננו-סיבי הג'ל שנאספו במים נטולי יונים למשך 24 שעות כדי להסיר את תחמוצת הפוליאתילן.
אספקת מזרק חבית כפולה ייצרה הידרזון הידרא-ג'ל בתפזורת POEGMA עם מגוון מכניקה, זמני ג'לציה ושקפים בהתאם לריכוז הפולימר המבשר, צפיפות הקבוצה הפונקציונלית התגובתית ומספר יחידות החזרה של תחמוצת אתילן על המונומרים. קצבי הזרימה הן של שמן הפרפין והן של תמיסות מבשר הפולימר השפיעו על הגדלים של מיקרו-חלקיקי ג'ל פולי NIPAM צולבים הידרוזון המיוצרים עם המכשיר המיקרופלואידי. נפיחות תלוית טמפרטורה הפיכה נצפתה במיקרוסקופיה אופטית בשלב חם.
חלקיקי המיקרו של הג'ל התפרקו לקודמיהם האוליגומריים עם הזמן. הגדלים של ננו-ג'ל פולי NIPAM צולבים הידרזון בהרכבה עצמית השתנו עם יחס מבשר מסה של פולימר פונקציונלי אלדהיד להידרזיד, אך נשאר מפוזר מאוד מונו. ככל שיחס המסה גדל, נצפתה פחות נפיחות תרמית.
כמו חלקיקי הג'ל, הננו-ג'לים התפרקו לקודמנים האוליגומריים עם הזמן. ננו-סיבי הידרוג'ל POEGMA צולבים של הידרזון בקוטר של 300 ננומטר הופקו על ידי אלקטרו-ספינינג תגובתי. הידרציה של ננו-סיבים הייתה מהירה יותר בשני סדרי גודל מאשר הידרציה של ג'ל בתפזורת עם אותו הרכב פולימרי.
הננו-סיבים שמרו על המורפולוגיה הננו-סיבית שלהם במשך יותר משמונה שבועות לפני שהתפרקו בתנאים פיזיולוגיים. פירוק מהיר יותר התרחש בסביבות חומציות. הננו-סיבים היו חזקים מבחינה מכנית הן במצב יבש והן במצב נפוח.
לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שיש לך הבנה טובה כיצד ליצור הידרוג'לים מתכלים ומגיבים לחום על ידי שליטה בגיאומטריה שבה עשויים הפולימרים הקודמים של הג'ל. זכור לוודא שזמן הג'לציה של מבשר הפולימר תואם את הצרכים של כל חלקיק. ג'לציה מהירה מדי תעכב את ייצור המיקרוג'ל והננו-סיבים.
ג'לציה איטית מדי תביא למורפולוגיה מגובשת במלואה. טכניקות אלו סוללות את הדרך לחוקרים בתחומי אספקת תרופות והנדסת רקמות. ולעצב פיגומי הידרוג'ל מוגדרים היטב לשליטה בקצב או במיקום שחרור התרופה או גירוי התחדשות רקמות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים לייצור הידרוגלים תגובתיים תרמית הניתנים לפירוק באמצעות קשירה צולבת של הידראזון. השיטות מאפשרות יצירת הידרוגלים ברמת המסה (bulk), ברמה המיקרוסקופית וברמה הננוסקופית, כולל ננו-חלקיקי ג'ל וננו-סיבים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- חומרים ביו-רפואיים
- ייצור הידרוג'ל
- הנדסת רקמות
רקע
- להידרוגלים תגובתיים תרמית ישנם יישומים במתן תרופות ובפיגומים לרקמות.
- שליטה על הגודל והצורה של הידרוגלים היא קריטית לתפקודם.
- קישור צולב של הידראזון מספק שיטה רב-גונית לסנתז של הידרוגלים.
- המחקר עוסק באתגרים ביצירת חומרים תגובתיים לשימוש ביו-רפואי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לייצור הידרוגלים תגובתיים תרמית הניתנים לפירוק.
- מתן אפשרות לשליטה על גיאומטריות וקני מידה עבור יישומים שונים.
- סיוע ביצירת פיגומים תגובתיים ובטיפולים ננו-תרפויטיים ממוקדים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות פולימרים פונקציונליים בעלי קבוצות הידראזיד ואלדהיד.
- שימוש במזרק כפול-חביב ובמיקסר סטטי עבור קו-אקסטרוזיה.
- ייצור שבב מיקרופלואידי ליצירת מיקרו-חלקיקים.
- דיאליזה לניקוי ננו-ג'לים.
תוצאים עיקריים
- ייצור מוצלח של ג'לים, מיקרוג'לים, ננוג'לים וננוסיבים של חומצה פולית.
- הדגמה של שליטה על הגודל והצורה של ההידרוג'ל באמצעות ערבוב של מקדימי פולימר.
- ביסוס של שיטה מהימנה לייצור מיקרו-חלקיקי ג'ל אחידים.
- הסרה יעילה של פולימרים שאינם מקושרים מהננוג'לים.
מסקנות
- הפרוטוקולים המוצגים מאפשרים ייצור ורסטילי של הידרוגלים ליישומים ביו-רפואיים.
- קשירה צולבת של הידראזון היא גישה מבטיחה ליצירת חומרים תגובתיים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול מערכות מתקדמות להולכת תרופות ופיגומים להנדסת רקמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
פרוטוקול זה מאפשר ייצור של הידרוגלים תגובתיים תרמית הניתנים לפירוק במספר סדרי גודל, ובכך הוא נותן מענה למחסום תרגומי מרכזי בפיתוח חומרים חכמים: היעדר פירוק רלוונטי ביולוגית בפולימרים תגובתיים תרמית קונבנציונליים. על ידי אפשרות לפינוי כלייתי באמצעות קשרי הצלבה של הידראזון הניתנים לפירוק הידרוליתי, השיטה תומכת בתרגום של הידרוגלים תגובתיים תרמית ליישומים הדורשים זמן שהייה מבוקר, כגון הובלה של תרופות המוסדרת על ידי חילוף חומרים ופיגומים זמניים לרקמות. גישה זו מספקת פלטפורמה רב-גונית ליצירת הידרוגלים עם גודל, צורה וקינטיקת פירוק הניתנים לכיוון, ובכך היא מקלה על הערכה פרה-קלינית של חומרים תגובתיים תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי אספקת פיגומים הניתנים לפירוק ובעלי תגובה לגירויים, המדמים תנאים דינמיים של המטריצה החוץ-תאית.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות פירוק הניתן לכיוון של הידרוג'ל, המאפשר הערכה של מעורבות המטרה בחלונות זמן מוגדרים.
- ערך ניבוי: משפר את זיהוי המועמדים לטיפול (leads) על ידי התרה של הערכת קינטיקה של שחרור תרופות ותגובות תאיות בסביבות בעלות יכולת פירוק.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר מיקרו-חלקיקי הידרוג'ל וננו-ג'לים אחידים המתאימים לסריקה בפריון גבוה (high-throughput screening) של שחרור תרכובות וספיגה תאית.
- תוצר כמותי: מאפשר מדידה של שינויים תלויי-פירוק בנפיחות ההידרוג'ל, בגודל הרשת ובדיפוזיית התרופה כמדדים פונקציונליים.
- שחזוריות: שיטות מיקרופלואידיקה ואלקטרוספינינג מספקות ייצור סטנדרטי וניתן להרחבה של חלקיקי הידרוג'ל הניתנים לפירוק עם התפלגות גודל מבוקרת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מערכת רלוונטית למחלה: מייצרת הידרוגלים תגובתיים תרמית המתפרקים למקדימים אוליגומריים מתחת לסף הסינון הכליתי, ובכך תומכת בהערכת הפינוי והביו-תאימות.
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין שלב הגילוי לעבודה הפרה-קלינית על ידי אספקת פיגומים הניתנים לפירוק השומרים על תפקוד תגובתי תרמי, תוך מתן אפשרות להערכת בטיחות באמצעות התאוששות של תוצרי הפירוק.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מאפשרת הערכה של הולכת תרופות המתווכת על ידי הידרוגלים ושל התחדשות רקמות בתנאים שבהם פינוי החומר מדמה נתיבי הגלהה פיזיולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם דרך אופטימיזציה של תרכובות מובילות ופיתוח פרה-קליני, ומספקת פלטפורמות של הידרוג'לים מתכלים שניתן להתאימם לסריקה, לניסוח ולמחקרים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מתן שליטה מרחבית-זמנית בהצגה של חומרים ביו-אקטיביים באמצעות הידרוגלים המגיבים לטמפרטורה ולפירוק.
- סריקה: מספקת מיקרו-חלקיקים וננו-סיבים של הידרוגלים בסטנדרט אחיד לצורך סריקה עקבית של תרכובות וניתוח תגובה תאית.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות על קינטיקה של פירוק, התנהגות נפיחות ופרופילי שחרור, המאפשרים הסקת מסקנות על קשרי מבנה-פעילות ומבנה-תכונה.
- מחקר טרנסלציונלי: מאפשרת הערכה פרה-קלינית של מערכות מבוססות הידרוגלים, שבהן פירוק לאוליגומרים הניתנים לפינוי מפחית את הסיכון לשימור ארוך טווח בגוף.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה מודולרית הניתנת ליישום על פולימרים מסיסים במים שונים, ומאפשרת שימוש חוזר בתחומים טיפוליים ובתוכניות מודליות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי כך שמאפשר הערכה של חומרים חכמים בהקשרים פיזיולוגיים רלוונטיים בעלי יכולת התפרקות.
- ערך תפעולי: מציע ייצור סטנדרטי וניתן להרחבה על פני קני מידה שונים (bulk, micro, nano) תוך שימוש בכימיה משותפת של חומרי מוצא וציוד הניתן להתאמה.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי התייחסות לסוגיות של תאימות ביולוגית ופינוי בשלב מוקדם של הפיתוח.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי יצירת נתונים פרה-קליניים על התפרקות, פינוי ותפקוד זמני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיה של פולימרים, יצירת הידרוג'לים ואפיון חומרים המגיבים לגירויים.
- נדרשת גישה למערכות מיקרופלואידיקה, ציוד אלקטרוספינינג ותשתיות דיאליזה או טיהור לבידוד ננוג'לים.
- מחייב סטנדרטיזציה של סינתזת חומרי המוצא והפונקציונליזציה שלהם כדי להבטיח פרופילי פירוק וקשירה צולבת של הידראזון הניתנים לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה לפולימרים שונים או כוונון קצבי הפירוק באמצעות סטוכיומטריה של הקושר הצולב.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רגישות לזמן הג'לציה, אותה יש להתאים לשיטת הייצור כדי למנוע היווצרות מוקדמת או חלקית של הרשת.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Fabrication of Hydrazone-crosslinked Bulk Poly(Oligoethylene Glycol Methacrylate)(POEGMA) or Poly(N-Isopropylacrylamide) (PNIPAM) Hydrogels
2:41
Fabrication of Hydrazone-crosslinked PNIPAM Gel Microparticles via Reactive Microfluidics
6:18
Thermally-driven Reactive Self-assembly of Hydrazone-crosslinked PNIPAM Nanogels
7:34
Fabrication of Hydrazone- crosslinked POEGMA Nanofibers via Reactive Electrospinning
9:28
Results: Bulk, Microscale, and Nanoscale Thermoresponsive Hydrogels
11:17
Conclusion
