G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

מבחני chemotaxis חזותיים חיוניים להבנה טובה יותר של איך איקריוטיים תאים לשלוט נדידת תאים כיוונית בתיווך chemoattractant. כאן אנו מתארים שיטות מפורטות: 1) בזמן אמת, ניטור ברזולוציה גבוהה של מבחני chemotaxis מרובים, ו -2) בו זמנית לדמיין את שיפוע chemoattractant ואת דינמיקת spatiotemporal של איתות אירועים בתאי HL60 דמוי נויטרופילים.

המטרה הכוללת של מודל זה היא לאפשר ניטור בו-זמני של מבחני כימוטקסיס מרובים, או הדמיה של אירועי איתות מרובים של תא כימוטקסיס יחיד. ביולוגים של התאים של Overdeck פיתחו מספר גישות שונות לכימות התנהגות הכימוטקסיס של התאים. עד לאחרונה הצלחנו לענות על שאלות מפתח בתחום הכימוטקסיס, כגון, כיצד לנטר בו זמנית מספר בדיקות כימוטקסיס.

היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא יישום העיקרון של מיקרופלואידיקה כדי לייצר מרכיבים אמינים וניתנים לשחזור עבור מספר בדיקות כימוטקסיס בו זמנית ברזולוציה גבוהה בזמן אמת. מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר שי וון, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלנו. כדי להרכיב את המחזיק, השתמש תחילה במנופים כדי למקם את הבסיס במצב אנכי כך שהמנופים יוכלו להטות לכיוון המשתמש.

לאחר מכן, מצפים לזמן קצר את פני הזכוכית של 41 מילימטר באתנול 70%, והשתמשו במגבון כדי להסיר בזהירות את האתנול. הכנס את הזכוכית לבסיס המחזיק, והנח החלקת כיסוי מרובעת מצופה BSA בגודל 2 מילימטר על גבי הזכוכית. לאחר מכן, הכנס את טבעת ה-O הקטנה לתחתית בית הפרוסות והתקן את בית הפרוסה לבסיס המחזיק, עם החור האליפטי בחלק האחורי של המכשיר.

משוך את המפלס הפנימי של בסיס המחזיק קדימה למצב אופקי, כדי לנעול את בית הפרוסות במקומו. השתמש באבק אוויר כדי לפוצץ כל פסולת מהחלק הפנימי של בית הוופל. לאחר מכן הוסף לבית 4 מילילטר של מדיום RPMI 1640, בתוספת 0.1% BSA.

כעת, התקן את שבב מכשיר ניתוח ניידות התאים המצופה BSA במרכז בית הפרוסה עם הפנים המבניות במגע עם הזכוכית, ועם סימן המיקום מאחור. הכנס את שתי הבליטות על אטם הגומי לתוך החורים כדי להצמיד את האטם לתחתית הפרוסה clamp, והרכיב את טבעת ה-O הגדולה על החלק העליון של בית הפרוסות . לאחר מכן התקן את הפרוסה clamp עם חור החיישן מאחור ומשוך את הידית החיצונית של בסיס המארז קדימה למצב אופקי כדי לנעול את הפרוסה clamp במקומו.

כאשר המחזיק מורכב, הנח את החלק התחתון של המחזיק על קופסת אור כדי לוודא שאין בועות אוויר בבארות. לאחר מכן הסר את המכסה, העבר את המכלול לצלחת על גבי יחידת מכשיר ניתוח ניידות התאים, והצמד את בלוק החיישן למחזיק. כדי לבצע את בדיקת ניידות התאים, ראשית אנו משעים תאי HL60 מובחנים במדיום RPMI 1640 בתוספת BSA, ופעמיים עשרה עד שישית תאים לריכוז מיליליטר.

לאחר מכן, חבר את יחידת התקן ניתוח ניידות התאים למחשב לצורך רכישת התמונה, והפעל את שני המכשירים. לאחר מכן, פתח את תוכנת המכשיר לניתוח ניידות תאים. בלוח הבקרה של תמונת המצלמה, השתמש בקווים האופקיים והאנכיים כדי לכוונן את מיקום המחזיק בזמן אמת, ומרכז את המכשיר בלוח תמונת המצלמה.

לאחר מכן בחר ערוץ ראשון כדי להעביר את המצלמה לערוץ שנבחר, והשתמש בהזז שמאלה של הזז ימינה כדי להתאים את קואורדינטות ה- X של המצלמה כדי למרכז את שדה התצוגה אופקית. כדי לכוונן אנכית את התמונה למרכז המסך, סובב את כפתור המיקום בלוח הקדמי של התקן ניתוח ניידות התאים. בלוח הבקרה של התנור, הגדר את טמפרטורת המחזיק ל-37 מעלות צלזיוס, ואת טמפרטורת הצלחת ל-39 מעלות צלזיוס.

כדי לשלוט בטמפרטורה באמצעות החיישן התרמי המחובר למחזיק, לחץ על חום כדי להתחיל את החימום ולאחר מכן על המחזיק. בלוח הצילום, הזן 15 שניות עבור המרווח ו-30 דקות עבור הזמן כדי להגדיר את המרווחים ואת משך בדיקת הכימוטקסיס, בהתאמה. מטעמי בטיחות, בחר את המחמם כבוי בסוף תיבת הצילום.

לאחר מכן, שמור את הקובץ, הזן את פרטי הניסוי בלוח התזכיר ואשר שהמכשיר מרוכז בכל הערוצים. כעת הסר את כל המאגר מהמחזיק, ושמונה מיקרוליטר מאגר מהבאר השלישית מהחלק העליון של הערוץ הראשון. באמצעות מזרק יש להזריק שני מיקרוליטרים של תאים לבאר השנייה באותה תעלה, תוך ניטור המסך בזמן אמת כדי לשלוט במספר התאים ובזרימתם במהלך ההזרקה.

כאשר התאים מיושרים, הוסיפו מיד את שמונת המיקרוליטרים של המאגר לבאר, וחזרו על הזרקת התאים בתעלות שתיים עד שש, כפי שהודגם זה עתה. לאחר הוספת כל התאים, הוסף שני מיליליטר חיץ בחזרה למחזיק, והוסף מיקרוליטר אחד של החומר הכימואטרקטיבי לבאר השלישית מלמעלה בערוצים המתאימים. לבסוף, התחל ברכישת התמונה.

בניסוי מייצג זה, תאי HL60 מתחילים לבצע כימוטקס בנתיב ישר מיד עם הזרקת החומר הכימואטרקטיבי, והמשיכו במשך כל 60 הדקות של הבדיקה, בהתאם לתוצאות סימולציה של יציבות השיפוע. מעקב אחר נתיב הנסיעה והמורפולוגיה של התאים מאפשר מדידה כמותית והשוואה לאחר מכן של התנהגויות הכימוטקסיס, באמצעות אינדקס כימוטקסיס הכולל את אורך הנתיב הכולל, כיווניות, מהירות ומעוגלות של התאים. יישום צבע פלואורסצנטי, בשילוב עם החומר הכימואטרקטיבי, מאפשר יצירת קשר ליניארי בין ריכוז הכימואטרקנט לבין עוצמת הצבע הפלואורסצנטי המנוטר.

יתר על כן, בתגובה לגירוי כימואטרקנטי המופעל באופן אחיד, תאי HL60 מתווכים טרנסלוקציה חזקה של ממברנה חזקה של חלבון קינאז GFP טאקט D1.In שיפוע כימואטרקנטי, תאי HL60 מגייסים באופן פעיל את הקינאז לחלק האחורי של הקצה המוביל. לאחר השליטה, ניתן להשלים תהליך זה תוך 30 דקות אם הוא מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב בקפדנות אחר הוראות היצרן על מכלול המחזיק, ולפקח על הזרקת התאים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הכימוטקסיס לחקור את האפשרות של בדיקות כימוטקסיס מרובות, כגון דיקטיוסטיליום מונוגניזם, או סוגים אחרים של מערכות תאי יונקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב את היחידה, לבצע בדיקות כימוטקסיס בו זמנית, או בו זמנית לדמיין אירועי איתות מרובים בתאי כימוטקס.