Name: איתור של הפעילות תלויה pH של Coli Escherichia Chaperone HdeB במבחנה ו In vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: חקור את הפעילות תלוית ה-pH של Chaperone HdeB ב-Escherichia coli בשיטות מבחנה וחיות. למד כיצד לזהות ולאפיין chaperones המופעלים בחומציות ולהגדיר תנאי pH המובילים להפעלתם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר קלאודיה Cremers עבור עצתה המועילה על מבחני מלווה. קן וואן הוא הודה לקבלת הסיוע הטכני שלו טיהור HdeB. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הרפואי של הווארד יוז (כדי JCAB) לבין המכון הלאומי לבריאות מענק RO1 GM102829 כדי JCAB ו UJJ-UD הוא נתמך על ידי מענק מחקר בתר-דוקטוריאלי מסופק על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG).

ביטוי טיהור 1. של periplasmic HdeB הערה: HdeB התבטאה E. קולי תאים מחסה פלסמיד pTrc- hdeB 10, וטיהר מן periplasm על תמוגה polymyxin. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבות לילה של E. קולי תאים מחסה פלסמיד pTrc- hdeB 10 ב 30 מ&quot;ל LB המכיל 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל אמפיצילין (AMP LB). לחסן ארבעה 1 תרבויות L של LB Amp לגדל אותם על 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל&quot;ד עד OD 600nm של 0.7 הוא הגיע. לאחר מכן, להוסיף 300 מיקרומטר IPTG להשרות את הביטוי של HdeB ולהפחית את הטמפרטורה הצמיחה עד 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 5 שעות של ביטוי חלבון ב 30 מעלות צלזיוס, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את תא גלולה עם 100 מ&quot;ל חיץ (50 מ&quot;מ טריס / HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5) ו צנטריפוגות שוב התאים ב 8000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, גלולהתא גלול ב 80 מיליליטר הצפה, המכילה 1 מ&quot;ג / סולפט polymyxin מיליליטר. עבור שיבוש יעיל של הממברנה החיצונית, בעדינות מערבבים את ההשעיה עבור שעה 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את חלק cytoplasmic ופסולת תאית, צנטריפוגה ההשעיה עבור 20 דקות ב 15,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. התוצאה היא ~ 60 מיליליטר supernatant המכיל את HdeB המסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze את supernatant המכיל את תמצית periplasmic לילה נגד נפח 150x של חיץ B (20 מ&quot;מ טריס / HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0) באמצעות קרום דיאליזה עם 6 kDa MW חתוכים. לרכז את החלבונים עד 15 מ&quot;ל באמצעות יחידות צנטריפוגלי מסנן עם משקל מולקולרי חתוכים של 3 kDa. סנן את פתרון החלבון באמצעות מסנן נקבובי 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את החלבון על טור כרומטוגרפיה אניוני (נפח עמודה 5 מ&quot;ל) כי כבר equilibrated עם B חיץ 5 כרכים עמודה עם קצב הזרימה של 2.5 mL / min. לאחר החלבון נטען על הטור, לשטוף את העמודה עם החיץ B במשך 10 דקות בשיעור תזרים של 2.5 מ&quot;ל / דקה. Elute HdeB עם שיפוע ליניארי 0 כדי 0.5 M NaCl חיץ B על פני פרק זמן של 50 דקות עם קצב הזרימה של 2.5 mL / min 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות שברים המכילים HdeB באמצעות SDS-PAGE 15%. מערבבים 20 מדגם μl עם 5 μl 5x חיץ טעינת מופחת SDS. טען 10 μl על ג&#39;ל ולהפעיל חיץ טריס-גליצין (גליצין 14.4 גר &#39;/ ל, 2.9 גר&#39; / ל טריס, 1 גר &#39;/ ל סולפט dodecyl נתרן, pH 8.3). הפעל את הג&#39;ל על 150 V עד להקת bromophenol העבירה קרובה לתחתית הג&#39;ל (~ 45 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת כל שברים HdeB המכילים, דיאליזה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 למאגר אחסון L HdeB (50 מ&quot;מ טריס / HCl, 200 מ&quot;מ NaCl, pH 8.0), ולהתרכז החלבון לכ 300 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים של 3 kDa. קבע את הריכוז של HdeB ב 280 ננומטר באמצעות 280nm ε מקדם הכחדה = 15,595 M -1 cm -1. כן 100 aliquots μl ופלאש ללאZE את aliquots בחנקן נוזלי. הערה: HdeB ניתן לאחסן ב -70 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים. </li></ol> 2. Assay פעילות הורה מלווה שימוש תרמית התגלגלות dehydrogenase Malate (MDH) הערה: השפעת HdeB מטוהר על צבירת תרמית התגלגלות dehydrogenase malate המיטוכונדריה החזירית (MDH) בערכי pH שונים הייתה פיקוח כמפורט להלן. כל ריכוזי חלבון המפורטים מתייחסים ריכוז מונומר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין MDH, dialyze MDH ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 C חיץ L (פוספט אשלגן 50 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ NaCl, pH 7.5) ולרכז את חלבון כ 100 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים 30 kDa. הערה: דיאליזה זהירות של MDH נדרשת MDH מועבר כפתרון אמוניום סולפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר אגרגטים, בצנטריפוגה חלבון במשך 20 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קביעת ריכוז MDH ידי ספיגה ב 280 ננומטר (ε &lt;sub&gt; 280 ננומטר = 7,950 M -1 cm -1). הכן 50 aliquots μl של MDH ופלאש להקפיא את aliquots לאחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים קובט קוורץ 1 מ&quot;ל לתוך ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי מצויד מחזיקי מדגם מבוקר טמפרטורה בוחש. הגדר לשעבר λ / em ל -350 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כרכים המתאים של טרום התחמם (43 ° C) חיץ D (150 פוספט אשלגן מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ NaCl) על ערכי pH הרצוי (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, ו- pH 5.0) כדי קובט וערכת הטמפרטורה של בעל קובט ל -43 מעלות צלזיוס. ההיקף הכולל הוא 1,000 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12.5 מיקרומטר HdeB (או לחילופין באותו נפח של למאגר אחסון HdeB על בקרת חיץ) למאגר, ואחריו תוספת של MDH 0.5 מיקרומטר. מתחיל בבקרת פיזור אור. דגירת התגובה עבור 360 שניות כדי לאפשר מספיק התגלגלות של MDH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את pH עד 7 על ידי הוספת נפח 0.16-0.34 מ -2 K unbuffered M 2 HPO 4 ולהמשיך מחדשcording פיזור אור עבור 440 אחר שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מידת הצטברות MDH כי נרשמה בהעדר המלווה בנקודת זמן מוגדרת לאחר הנטרול (כאן אחרי 500 שניות, כאשר פיזור אור המקסימאלי של MDH נצפה) ל -100%. לנרמל פעילות HdeB לאות פיזור אור של MDH בהעדר HdeB בכל ערך pH מצוין. </li></ol> 3. איתור של גיבוש קומפלקס HdeB-LDH ידי אנליטית ultracentrifugation (AUC) הערה: ניסויים מהירות שקיעה של HdeB לבד או בקומפלקס עם תרמית התגלגלות לקטט דהידרוגנאז (LDH) בוצעו באמצעות ultracentrifuge אנליטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין LDH, dialyze LDH ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 L חיץ C (50 פוספט אשלגן מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ NaCl, pH 7.5) ולרכז את חלבון כ -200 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים 30 kDa. הערה: דיאליזה זהירות של LDH נדרשת LDH מועבר כפתרון אמוניום סולפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר אגרגטים, LDH צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קביעת ריכוז LDH ידי ספיגה ב 280 ננומטר (ננומטר = ε 280 43,680 M -1 cm -1). הכן 50 aliquots μl של LDH ופלאש להקפיא את aliquots לאחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 3 LDH מיקרומטר בנוכחות והיעדר HdeB 30 מיקרומטר במאגר D (pH 4 ו -7, בהתאמה) במשך 15 דקות ב 41 מעלות צלזיוס. הערה: דגירה של LDH לתוצאות טמפרטורות גבוהות ב הצבירה המוחלטת שלה, ואין שפעה מלווה של HdeB ניתן לצפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו דגימות להתקרר לטמפרטורת החדר. ואז, דגימות עומס לתוך התאים המכילים במגזר סטנדרטי בצורת 2 ערוצים מסידורי עם 1.2 ס&quot;מ אורך הדרך. טען את התאים לתוך ultracentrifuge לאזן ל -22 מעלות צלזיוס למשך לפני 1 שעה לפחות כדי שקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דגימות ב 22 ° C ו- 167,000 XG ב הרוטור בהתאמה במשך 12 שעות, ולנטר את sedimentation של חלבון ברציפות ב 280 ננומטר. כפי שתואר קודם לכן, יחס האות לרעש הוא השתפר כאשר עוצמת האור המועברת של כל ערוץ נמדדת ולא ספיג. זה גם משפר את איכות הולם נתונים עקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח נתונים עם SEDFIT (15.01b גרסה, דצמבר 2015), באמצעות ג הרציף מודל ההפצה (הים) 17. הדרכה המתאר כיצד להשתמש SEDFIT ניתן למצוא התייחסות 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את רמת הביטחון להסדרת ME (מקסימום אנטרופיה) 0.7. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב צפיפות חיץ וכן צמיגות באמצעות SEDNTERP 19. כדי לאמוד את כמות חלבון הלקוח מצטבר, השווה את אינטגרלים של LDH משקע ב pH 4 ל- pH 7 כהפניה. הערה: שילוב של מגרשי הפצת השקיעה יכול להיעשות ישירות SEDFIT. תוכנות חלופיות כדי לנתח נתונים מהירים שקיעה ניתן למצוא בביקורתם אחרונה 20. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. ניטור MDH איון והפעלה מחדש בנוכחות HdeB הערה: השפעת HdeB מטוהר על refolding של pH-פרש MDH נקבעה על ידי ניטור פעילות MDH על הניטרול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1 MDH מיקרומטר במאגר D על ערכי pH הרצוי (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, ו- pH 5.0) במשך שעה 1 ב 37 ° C בהעדר או בנוכחות HdeB 25 מיקרומטר. לאחר מכן, להעביר את הטמפרטורה ל 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: אין refolding MDH נצפתה אפילו בנוכחות של HdeB כאשר MDH הודגר בטמפרטורות גבוהות מ -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליזום refolding של MDH מפוגל חומצה, לנטרל את דגימות ה- pH 7 על ידי תוספת של נפח 0.13-0.42 של 0.5 M פוספט נתרן, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה עבור שעה 2 ב 20 מעלות צלזיוס, לקבוע פעילות MDH על ידי ניטור ירידה של NADH ב 340 9 ננומטר. הערה: MDH מזרז את הירידה תלויה-NADH של oxaloacetate לתוך L-Malate. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 50 μl של התגובה הדגירה עם 950 μl של חיץ assay (פוספט נתרן 50 מ&quot;מ, pH 8.0, 1 מ&quot;מ oxaloacetate, ו -150 מיקרומטר NADH). הערה: הריכוז הסופי של MDH למאגר assay צריך להיות 44 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על השינוי ספיג באמצעות ספקטרופוטומטר, מצויד בלוק בקרת טמפרטורת פלטייה מוגדר 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דווח על יחסי פעילות MDH ל -44 ננומטר יליד MDH כי נשמר ב- pH 7.0. </li></ol></li></ol> 5. השפעת HdeB התבטאות יתר על E. coli הישרדות תחת מתח חומצה הערה: E. coli MG1655 הדנ&quot;א הגנומי היה מבודד באמצעות פרוטוקול שפורסם 21. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר hdeB מ E. MG1655 coli על ידי PCR באמצעות hdeB פריימרים - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT GTC CAA ATT CGG ו hdeB - Ecor I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת PCR ב 50 μl כדלקמן: 10 μl חיץ פולימראז 5x, 200 מיקרומטר dNTPs, 0.5 מיקרומטר פריימר JUD2, 0.5 מיקרומטר פריימר JUD5, 150 ng MG1655 הדנ&quot;א הגנומי, 0.5 DNA פולימרז μl, להוסיף DDH 2 O עד 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הגברה של hdeB כדלקמן: שלב 1: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 1 מחזור; צעד 2: 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 55 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס, 40 מחזורים; שלב 3: 10 דק &#39;ב 72 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clone וכתוצאה מכך שבר PCR לתוך האתרים Ecor אני BamH לי של פלסמיד pBAD18 באמצעות שיטות סטנדרטיות עבור שיבוט אתר הגבלה. לטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד פי הוראות היצרן. בדוק את הפלסמיד שהתקבל על ידי רצף 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הפלסמיד להביע HdeB או pBAD18 בקרת וקטור ריק לתוך BB7224 זן (Δ rpoH) (גנוטיפ: F -, λ -, E14 -, [araD139] B / [r6; (argF-לאק) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 ארד + rpoH :: kan +; 16) באמצעות תאים מוסמכים כימי. הערה: זן זה הוא רגיש לטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 45 שניות-הלם חום על 42 מעלות צלזיוס ולפני הציפוי, דגירת תאים ב 30 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד. בצע פס-outs מושבה אחת של שיבוטים חיובי דגירה לילה בשעה 30 ° C. הכן תרבות הלילה ב 50 מ&quot;ל LB Amp ולטפח את התאים ב 200 סל&quot;ד ו -30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרבויות לילה פי 40 ל -25 מ&quot;ל LB Amp ולגדול החיידקים בנוכחות 0.5% arabinose (Ara) על 30 מעלות צלזיוס ו 200 סל&quot;ד ל 600nm OD = 1.0 להשרות ביטוי חלבון HdeB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניסויי משמרת pH, השתמש LBAmp + ערה לדלל את התאים OD 600nm של 0.5 ולהתאים לערכי pH בהתאמה (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0) על ידי הוספת כמויות מתאימות של 5 M HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהוחלט על נקודות זמן המצוינות (pH 2, 1 דקות; pH 3, 2.5 דקות, pH 4, 30 דק &#39;), לנטרל את התרבויות על ידי תוספת של הכרכים המתאימים של 5 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על הצמיחה של התרבויות לנטרל בתרבות הנוזלית במשך 12 שעות ב 30 ° C באמצעות מדידות OD. </li></ol>

<ol><li>Smith, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Gastric+Acid+in+Preventing+Foodborne+Disease+and+How+Bacteria+Overcome+Acid+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Protect%22%5BJournal%5D)">The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions.</a> J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).</li>
<li>Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+mechanisms+for+acid+resistance+in+enteric+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria.</a> Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).</li>
<li>Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins%3A+barrels+in+a+nutshell%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li>
<li>Reichmann, D., Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+out+of+Disorder%3A+Working+Cycle+of+an+Intrinsically+Unfolded+Chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone.</a> Cell. 148 (5), 947-957 (2012).</li>
<li>Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+disorder+in+chaperone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Conditional disorder in chaperone action.</a> Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).</li>
<li>Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+an+acid-activated+chaperone+allows+promiscuous+substrate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).</li>
<li>Hong, W., Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+Protein+HdeA+Exhibits+Chaperone-like+Activity+Exclusively+within+Stomach+pH+Range+by+Transforming+into+Disordered+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation.</a> J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).</li>
<li>Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+pH-Dependent+Dissociation+of+HdeA+Dimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers.</a> J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).</li>
<li>Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+refolding+by+pH-triggered+chaperone+binding+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).</li>
<li>Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HdeB+Functions+as+an+Acid-protective+Chaperone+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria.</a> J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).</li>
<li>Waterman, S. R., Small, P. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sigmas-dependent+genes+associated+with+the+stationary-phase+acid-resistance+phenotype+of+Shigella+flexneri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri.</a> Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).</li>
<li>Mucacic, M., Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+Hsp31+Contributes+to+Acid+Resistance+in+Stationary-Phase+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).</li>
<li>Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Chaperone-assisted+Refolding+of+Citrate+Synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase.</a> J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).</li>
<li>Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+Activity+with+a+Redox+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chaperone Activity with a Redox Switch.</a> Cell. 96 (3), 341-352 (1999).</li>
<li>Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Molecular%2C+Modeling%2C+and+Systems+Approaches+for+an+Understanding+of+the+Escherichia+coli+Heat+Shock+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).</li>
<li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Distribution+Analysis+of+Macromolecules+by+Sedimentation+Velocity+Ultracentrifugation+and+Lamm+Equation+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling.</a> Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li>
<li>Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm">http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm</a> (2016).</li>
<li>Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page">http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</a> (2012).</li>
<li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation%3A+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol%3AChloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).</li>
<li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+activation+by+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chaperone activation by unfolding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).</li>
<li>Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+the+isolation+and+characterization+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Express+Purif%22%5BJournal%5D)">Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones.</a> Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).</li>
<li>Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Heat-shock+Protein+70+Reaction+Cycle+by+the+Mammalian+DnaJ+Homolog%2C+Hsp40%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40.</a> J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).</li>
<li>Quan, S., Koldewey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+designed+to+stabilize+proteins+uncovers+a+chaperone+called+Spy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).</li>
<li>Gray, M. J., Wholey, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+Is+a+Primordial+Chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate Is a Primordial Chaperone.</a> Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

<html> על מנת ללמוד את המנגנון של הפעלה מלווה פונקציה של HdeB, כמויות גדולות של HdeB צריכים לבוא לידי ביטוי ו מטוהר. מספר מערכות וקטור ביטוי זמינים לייצור רמות גבוהות של חלבון המטרה, כולל וקטורים pTrc או pBAD, אשר שניהם שימשו במחקר זה. היזמים נגישים בקלות עבור E. RNA פולימראז coli ובכך ביטוי מאפשר שהוגבר בחום של HdeB בכל E. זן coli. היבט זה רלוונטי במיוחד עבור מחקר ביטוי יתר in vivo של HdeB בתנאי קיצון חומצה, שבו זן -deficient rpoH</...

סביבה טבעית משותפת שבה פתוגנים חיידקים לחוות תנאי התגלגלות חלבון חומצה הנגרמת היא בבטן היונקת (טווח pH 1-4), אשר pH חומצי משמש מחסום יעיל נגד פתוגנים שמקורן במזון 1. חלבון התגלגלות ומקבצים, אשר נגרם על ידי protonation שרשרת הצד של חומצות אמיניות, משפיעים תהליכים ביולוגיים, מבנים הסלולר ניזקים ולבסוף גורם מוות של תאי 1,2. מאז ה- pH של periplasm חיידקי equilibrates כמעט מיידי עם pH הסביבתי עקב דיפוזיה החופשית של פרוטונים דרך הממברנה החיצונית הנקבובית, חלבונים בממברנה periplasmic והפנימיים של חיידקי גרם שליליים הם מרכיבים התאיים הפגיעים ביותר בתנאי חומצה-מתח 3. כדי להגן proteome שלהם periplasmic מפני נזק חומצה בתיווך מהירה, חיידקים גראם שליליים לנצל את המלוות periplasmic המופעל חומצה HdeA ו HdeB. HdeA הוא מלווה מופרע על תנאים <sup&gt; 4,5: ב- pH נייטרלי, HdeA קיים בתור דימר מקופל, המלווה-פעיל. עם שינוי pH מתחת pH 3, הפונקציה המלווה של HdeA מופעלת במהירות 6,7. הפעלת HdeA דורש שינויים מבניים עמוקים, כולל ניתוק שלה לתוך מונומרים, ואת חלקי התגלגלות של מונומרים 6-8. הופעל פעם אחת, HdeA נקשר לחלבונים הנפרשות בתנאים חומציים. זה מונע ביעילות הצבירה שלהם הוא במהלך הדגירה ב- pH הנמוך, כמו גם על נטרול pH. עם שובו ל- pH 7.0, HdeA מקל על refolding של חלבוני הלקוח שלו בצורה ATP-עצמאית וממיר בחזרה לתוך קונפורמציה שלה dimeric, בת הלוויה-פעיל 9. באופן דומה, HdeB המלווה ההומולוגי הוא גם לוויה-פעיל ב- pH 7.0. בניגוד HdeA, לעומת זאת, פעילות המלווה של HdeB מגיע המקסימלית שלה לכאורה ברמה של 4.0 pH, התנאים שבהם HdeB עדיין מקופלת ברובו dimeric 10. יתר על כן, עוד הורדת קאוס pHes איון של HdeB. תוצאות מראות כי למרות ההומולוגיה הנרחבת שלהם, HdeA ו HdeB שונים במצב שלהם הפעלה פונקציונלית ומאפשרת להם מכסי מגוון רחב pH עם פונקצית המלווה המגנה שלהם. מלווה אחר אחת כי היה מעורב התנגדות החומצה של E. coli הוא Hsp31 cytoplasmic, המופיע לייצב חלבוני הלקוח פרש עד משוחזרים תנאי נייטרלי. המצב המדויק של הפעולה של Hsp31, לעומת זאת, נותר 12 חידתי. בהתחשב בכך חיידקים וחיידק אחרים כגון סלמונלה חסרים את אופרון hdeAB, סביר מאוד כי מלוות periplasmic בלתי מזוהים אחרים אבל בכל זאת עלולים להתקיים כי הם מעורבים התנגדות חומצה של חיידקים אלה 11. הפרוטוקולים שהוצגו כאן מאפשרים לפקח על הפעילות המלווה תלוי pH של HdeB במבחנה ובחי 10 וניתן להחיל לחקור מלווים אחריםכגון Hsp31. לחלופין, הרשת המורכבת של גורמי שעתוק השולטות ביטוי hdeAB יכולה להיחקר באופן פוטנציאלי על ידי assay מתח vivo. כדי לאפיין את תפקודם של חלבונים המלווים in vivo, setups הניסיוני השונה ניתן ליישם. מסלול אחד הוא ליישם בתנאי עקה התגלגלות חלבון phenotypically לאפיין זנים מוטנטים כי גם ביטוי יתר של הגן של עניין או לבצע מחיקה של הגן. ניתן לבצע מחקרי proteomic לזהות אילו חלבונים כבר לא המצרפי בתנאי קיצון כאשר המלווה הוא הווה, או את ההשפעה של מלווה על אנזים מסוים יכולה להיקבע במהלך בתנאי עקה באמצעות מבחני האנזימטית 14-16. במחקר זה, בחרנו overexpress HdeB ב זן מחיקת rpoH, אשר חסר את גורם סיגמא הלם חום 32. RpoH שולט הביטוי של כל א הגדולה מלווה coli והמחיקה שלו ידועה להגדיל sensitivity לתנאי עקה סביבתיים הגורמים חלבון התגלגלות 15. פעילות המלווה vivo של HdeB נקבע על ידי ניטור יכולתה לדכא את רגישות ה- pH של זן Δ rpoH. בסך הכל, הפרוטוקולים שהוצגו כאן לספק גישה מהירה וישירה לאפיין את הפעילות של מלווה חומצה מופעלת במבחנה וכן בהקשר vivo.

<table><tbody><tr><td>NEB10-beta E. coli תאים</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB תערובת מרק, Lennox</td><td>LAB Express</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>אמרסקו</td><td>0826-5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>פולימיקסין B סולפט&nbsp;</td><td>ICN ביומדיקל בע"מ</td><td></td><td></td>100565</tr><tr><td>0.2 ומיקרו; מסנן מזרק סטרילי נקבובי</td><td>קורנינג</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 מ"ל)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, 15%</td> <td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>מלאט דהידרוגנאז (MDH)</td><td>Roche</td><td>10127914001</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט (מונובסיסי)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט (דו-בסיסי)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500 ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי</td><td>היטאצ'י</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>אוקסלואצטט</td><td>סיגמא</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>לקטט דהידרוגנאז (LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Proteome Lab XL-I אולטרה-צנטריפוגה אנליטית</td><td>בקמן קולטר</td><td><a href='https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render& wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/'>392764</a></td><td></td></tr> <tr><td>סנטרפיס, 12 מ"מ, 306493</td><td></td><td></td><td></td> בקמן קולטר במילוי פחם אפון</tr><tr><td>AN-50 Ti Rotor, אנליטי, 8 מקומות</td><td>Beckman Coult</td><td>363782</td><td></td>er</tr><tr><td>Wizard Plus Miniprep Kit</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>המשמש לטיהור פלסמיד (פרוטוקול 5.1)</td></tr> <tr><td>L-arabinose</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>DOT Scientific Inc</td><td>DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>קובטת תא פלואורסצנטי</td><td>Hellma Analytics</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטידים</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion נאמנות גבוהה DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP סט</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>פישר מדעי</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר מדעי</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 מ"ל 3K NMWL</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה Avanti J-26XPI</td><td>בקמן קולטר</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>Varian Cary 50 ספקטרופוטומטר</td><td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 קרום דיאליזה MWCO: 6 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Amicon יחידות סינון אולטרה צנטריפוגליות 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 בארות Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

איתור של הפעילות תלויה ph של<em&gt; coli escherichia</em&gt; chaperone hdeb<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; in vivo</em

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

חיידקים נחשפים לעתים קרובות לשינויים סביבתיים, כגון שינויים ב- pH, טמפרטורה, מצב חיזור, חשיפה לאור או כוח מכני. הרבה מהמקרים האלה לגרום חלבון התגלגלות בתא ויש להם השפעה מזיקה על ההישרדות של האורגניזם. קבוצת מלווים שאינם קשורים, מולקולריים ספציפי לחץ הוכחה לשחק תפקידים חיוניים להישרדותה של תנאי הלחץ הללו. בעוד מקופל מלא מלווה-פעיל לפני לחץ, החלבונים האלה להתפתח במהירות ולהיות מלווה-פעיל בתנאי קיצון ספציפי. הופעל פעם אחת, מלווה סדר המותנה אלה נקלטות על ידי מספר רב של חלבוני צבירה נוטה שונים, למנוע הצבירה שלהם במישרין או בעקיפין להקל חלבון refolding עם שיבת תנאים שאינם מתח. הגישה העיקרית להשגת הבנה מפורטת יותר על המנגנון של הכרת הפעלת הלקוח שלהם כרוכה הטיהור subsequenאפיון t של חלבונים אלו באמצעות מבחני מלווה במבחנה. מעקב מבחני לחץ vivo חיוני לחלוטין כדי לאשר את שהושג באופן עצמאי בתוצאות חוץ גופייה. פרוטוקול זה מתאר במבחנה שיטות vivo לאפיין את הפעילות המלווה של E. coli HdeB, גידול מלווה חומצה מופעלת. מדידות פיזור אור שמשו לקריאה מתוך נוח הקיבולת של HdeB למנוע צבירה הנגרמת חומצה של חלבון לקוח המודל הוקם, MDH, במבחנה. ניסויי ultracentrifugation אנליטית יושמו לחשוף היווצרות מורכבת בין HdeB ו LDH חלבון הלקוח שלה, כדי לשפוך אור לתוך גורל חלבוני לקוח עם שובי תנאים שאינם מתח. מבחני הפעילות האנזימטית של חלבוני הלקוח נערכו במטרה לפקח על תופעות של HdeB על איון הלקוח הנגרמת pH ו מחדש. לבסוף, מחקרים הישרדות שימשו Monitor השפעת פונקצית in vivo המלווה של HdeB.

HdeA ו HdeB הם הומולוגיים E. חלבונים coli, ידוע להגן חלבונים periplasmic נגד בתנאי עקה חומצה 10. העבודה שלנו גילתה כי בדומה HdeA, HdeB מתפקד גם בתור חומצה מופעלת מלווה מולקולרי. עם זאת, בניגוד HdeA, פונקציות HdeB ב- pH כי הוא עדיין פוטנציאל bactericidal, אך גבוה משמעותית מאשר אופטימלית pH של HdeA 6,9,10,22. כדי לחקור את אופטימלית pH של פעילות המלווה של HdeB במבחנה, יליד MDH דוללה לתוך מחומם מראש (43 ...

מחקר זה מתאר טכניקות biophysical, ביוכימיים ומולקולריים לאפיין את הפעילות המלווה של Escherichia coli HdeB בתנאי pH חומצי. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלוות חומצה-מגן אחרות כגון HdeA והוא יכול להיות שונה כדי לעבוד עבור מלווים אחרים בתנאי עקה.

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

המטרה הכללית של בדיקות צ'פרונין (chaperone) אלו, שבוצעו in vivo ו-in vitro, היא לאפיין את הפעילות התלויה-pH של הצ'פרונין HdeB של Escherichia coli בתנאי pH חומציים. לצ'פרונינים המופעלים על ידי חומצה יש תפקיד אחד בלבד: הגנה על חלבונים מפני פריסה (unfolding) ופירוק של חלבונים המושרים על ידי חומצה. תפקוד זה חשוב במיוחד עבור חיידקים מעיים, שחייבים לשרוד את הסביבה החומצית של הקיבה אם ברצונם להתיישב בהצלחה במעי.השיטות שאנו מציגים כאן מאפשרות לכם לזהות ולאפיין שפרונים המופעלים על ידי חומצה, ולהגדיר את תנאי ה-pH המובילים להפעלתם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן אפיון השפרונים, כגון HdeB in vitro ו-in vivo, דבר שיסייע לכם לפענח את מנגנון הפעלתם. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור שפרונים אחרים המגנים מפני חומצה, כגון HDA, וניתן להתאימן הלאה לעבודה עם שפרונים אחרים ו/או תנאי עקה שונים.נבדקת ההשפעה של HdeB מופק על אגרגציה של malate dehydrogenase מיטוכונדריאלי מחזיר, המתקפל תרמית, בערכי pH שונים. MDH שעבר דיאליזה בטמפר C במשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, רכז את החלבון לריכוז של כ-100 µM באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות עם סף משקל מולקולרי של 30 kDa. כדי להסיר אגרגטים, צנטריפוג את החלבון למשך 20 דקות ב-20,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C.קבע את ריכוז ה-MDH באמצעות בליעה באורך גל של 280 ננומטר. לאחר מכן, הכן מנות (aliquots) של 50 µL של MDH והקפא אותן בהקפאה מהירה (flash-freeze) לצורך אחסון. הכנס קובטץ קוורץ של 1 mL לספקטרופוטומטר פלואורסצנטי המצויד במחזיקי דגימות עם בקרת טמפרטורה ובמערכת ערבול.הגדירו את אורך גל העירור והפליטה ל-350 nanometers. הוסיפו לקובטה את הנפחים המתאימים של באפר D שחומם מראש בערכי pH הרצויים. הנפח הכולל הוא 1,000 microliters.כוון את הטמפרטורה במחזיק הקיווטה ל-43 °C. הוסף 12.5 µM HdeB לבאפר, ולאחריו הוסף 0.5 µM MDH. התחל בניטור פיזור האור.דגרו את התגובה למשך 360 שניות כדי לאפשר פתילה מספקת של MDH. העלו את ה-pH לשבעה על ידי הוספה של 0.16 עד 0.34 נפח של dipotassium phosphate לא מחוצב בריכוז two molar, והמשיכו להקליט את פיזור האור למשך 440 שניות נוספות. נתחו את הנתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.העבירו את הפלסמיד המבטא את HdeB או את וקטור הבקרה MD, PBAD 18, אל זן BB7224 Delta RPOH באמצעות תאים בעלי כשירות כימית (chemically competent cells). זן זה רגיש לטמפרטורה ויש לגדלו ב-30 °C. לאחר 45 שניות של הלם תרמי ב-42 °C ולפני הפיזור על מצע הגדלה, דגרו את התאים ב-30 °C וב-200 RPM.בצעו בידוד של מושבות בודדות (streak out) של השבטים החיוביים, והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. הכינו תרבית לילה ב-50 milliliters של LB עם Ampicillin, וגדלו את התאים ב-200 RPM ובטמפרטורה של 30 degrees Celsius. דללו את תרביות הלילה פי 40 לתוך 25 milliliters של LB עם Ampicillin.גדלו את החיידקים בנוכחות 0.5% arabinose בטמפרטורה של 30 degrees Celsius ובמהירות של 200 RPM עד לצפיפות אופטית ב-600 nanometers, או OD 600 השווה ל-1.0, כדי להשרות את ביטוי חלבון HDEB. עבור ניסויי שינוי ה-pH, השתמשו ב-LB עם Ampicillin ו-arabinose כדי לדלל את התאים ל-OD 600 של 0.5. התאימו לערכי ה-pH הרלוונטיים על ידי הוספת נפחים מתאימים של חומצה כלורית בריכוז five molar.לאחר נקודות הזמן המצוינות, נטרלו את התרביות על ידי הוספה של נפחים מתאימים של נתרן הידרוקסיד בריכוז חמישה מולרי. עקבו אחר הצמיחה של התרביות המנוטרלות והתרבית הנוזלית במשך 12 שעות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius באמצעות מדידות OD. כדי לבחון את ה-pH האופטימלי של פעילות הצ'פרון של HdeB in vitro, מדללו MDH טבעי לתוך בופר שחומם מראש ל-pH המצוין, בנוכחות או בהיעדר HdeB.לאחר 360 שניות של דגירה, השתראה של אגרגציית MDH בטמפרטורה של 43 °C בוצעה באמצעות ניטרול. בנוכחות HdeB, אות פיזור האור פוחת באופן משמעותי עם הניטרול מ-pH ארבע, מה שמעיד על כך ש-HdeB מונע את אגרגציית ה-MDH. מדידות אגרגציה רגישות מאוד לשינויים בטמפרטורה או בהרכב התמיסא.כדי לשלול תוצאות חיוביות שגויות, נבחנה השפעתו של תמיסת האחסון של הצ'פרונים על אגרגציה של חלבוני המטרה. לתמיסת האחסון של HdeB לא הייתה השפעה על אגרגציה של MDH. כדי לבחון את השפעותיו של HdeB in vivo, נערכו בדיקות הישרדות תלויות pH באמצעות זן עם מחיקה של RPOH הרגיש לטמפרטורה.זן זה חסר את רוב השפרונים (chaperones), ולכן הוא רגיש יותר לטמפרטורה גבוהה, pH נמוך או עקה חמצונית. ביטוי יתר של HdeB בתנאי pH ניטרלי לא הראה השפעה על קצב הצמיחה של הזן, שצמח באופן דומה לזן הביקורת הנושא את הווקטור הריק, PBAD 18. לעומת זאת, נמצאו הבדלים ברורים ביכולתם לחדש את הצמיחה לאחר טיפולים ב-pH 3 או pH 4, כאשר הזן בעל ביטוי היתר של HdeB הראה שיפור עקבי בהתאוששות מטיפול ב-pH נמוך בהשוואה לזן הביקורת.לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את הטיהור בשלושה ימים, את בדיקת הפיזור in vitro ביום אחד, ואת בדיקות השרידות in vivo ביומיים, במידה והדבר מבוצע כהלכה. בעת ביצוע ניסויים אלו, ודא כי תתכנן את הניסוי בקפידה, הן ביחס לסוג חלבוני המטרה, הן ביחס לריכוזיהם והן ביחס לתנאי הבאפר שבהם תשתמש. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מסייעת להשגת הבנה מפורטת יותר לגבי מנגנון ההפעלה של השפרונים (chaperones) והשפעותיהם בהקשר של in vivo.ואל תשכחו שחקר ה-pH האופטימלי של צ'פרון (chaperone) המגן בחומצה יכול להיות מאתגר למדי. זאת מכיוון שהתנהגות האגרגציה של חלבון המטרה (client protein) שבו תשתמשו תשתנה ככל הנראה גם היא בהתאם ל-pH. לכן, הקפידו לבחור מערכות בופר שמתאימות הן לצ'פרון והן לחלבון המטרה.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות spin down באמצעות SCS page, לצורך כימות אוטומטי של דיכוי צבירה של לקוח המתווך על ידי שaperon.

detection-ph-dependent-activity-escherichia-coli-chaperone-hdeb-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

מקור: דאל, ג'. ואחרים. זיהוי פעילות התלויה ב-pH של Escherichia coli Chaperone HdeB במבחנה ובחיים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים בדיקה מבוססת ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה להערכת פעילות צ'פרון על חלבון סובסטרט תחת לחץ חומצי וחום. הוא מפרט את השלבים לניטור התפתחות התפתחות והצטבר של המצע באמצעות פיזור אור, תוך השוואת תנאים עם ובלי המלווה (chaperone).

הערכת פעילות צ'פרון חיידקית באמצעות התפתחות תרמית של חלבון מודל

מקור: דאל, ג'. ואחרים. זיהוי פעילות התלויה ב-pH של Escherichia coli Chaperone HdeB במבחנה ובחיים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים את השימוש בתרביות E. coli רקומביננטיות להערכת ההשפעה המגנה של צ'פרון המופעל על ידי חומצה במהלך לחץ חומצי. ניטור צמיחת חיידקים מגלה שיפור בהישרדות בתרביות המבטאות צ'פרונים בהשוואה לבקרות, ומדגיש את תפקידם של הצ'פרונים בייצוב חלבונים תחת תנאי לחץ.

הערכת התפקיד המגן של צ'פרון המופעל על ידי חומצה ב-E. coli תחת לחץ חומצי

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה למדידת הפעילות של אנזימים תפקודי הומולוגי deubiquitinating. בדיקות מיוחדות קוולנטית לשנות את האנזים ולאפשר לגילוי. שיטה זו מחזיקה את הפוטנציאל לזהות מטרות טיפוליות חדשות.

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

פרוטוקול מפורט של דגם העכבר עבור enterohemorrhagic e. coli (EHEC) מושבת באמצעות חיידקים התווית על-ידי ביולומינסנציה מוצג. זיהוי חיידקים זוהרים אלו באמצעות פולשני ויוו מערכת בבעלי חיים הדמיה יכול לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של EHEC קולוניזציה.

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

פרוטוקול זה מתאר סוללה של שיטות הכוללות כרומטוגרפיה אנליטית של אי-הכללת גודל כדי לחקור אוליגומריזציה ויציבות של מלווה היסטון, בדיקת משיכה למטה כדי לפענח אינטראקציות של מלווה היסטון-היסטון, AUC כדי לנתח את הסטויכיומטריה של קומפלקסי החלבונים, ומבחן מלווה היסטון כדי לאפיין באופן פונקציונלי מלווה היסטון במבחנה.

במבחנה אפיון מלווי היסטון באמצעות מבחני אנליטיקה, משיכה וליווי

פרוטוקול זה מדגים את פעילות המלווה של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). תאי E. coli dnaK756 משמשים כמודל לבדיקה מכיוון שהם מכילים Hsp70 ילידי ולקוי תפקודית, מה שהופך אותם רגישים ללחץ חום. המבוא ההטרולוגי של Hsp70 פונקציונלי מציל את חוסר הצמיחה של התאים.

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

מוצג פרוטוקול לייצור, טיהור ושימוש בשלפוחיות ממברנה חיצוניות ארוזות אנזימים (OMV) המספק יציבות אנזימים משופרת ליישום ביישומים מגוונים.

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

חקור את הפעילות תלוית ה-pH של Chaperone HdeB ב-Escherichia coli בשיטות מבחנה וחיות. למד כיצד לזהות ולאפיין chaperones המופעלים בחומציות ולהגדיר תנאי pH המובילים להפעלתם.

איתור של הפעילות תלויה pH של

גלה סרטונים נוספים