איתור של הפעילות תלויה pH של Coli Escherichia Chaperone HdeB במבחנה ו In vivo

המטרה הכוללת של מבחני מלווה in vivo ו-in vitro היא לאפיין את הפעילות התלויה ב-pH של Escherichia coli chaperone HdeB בתנאי pH חומציים. למלווים המופעלים על ידי חומצה יש רק תפקיד אחד לעשות, הם צריכים להגן על חלבונים מפני חלבון המושרה על ידי חומצה שמתפתח ופירוק. הפונקציה הזו חשובה במיוחד עבור חיידקי מעיים, שצריכים לשרוד בסביבה החומצית של הקיבה אם הם רוצים להתיישב בהצלחה במעיים.

השיטות שאנו מציגים כאן מאפשרות לזהות ולאפיין צ'פרונים המופעלים על ידי חומצה, ולהגדיר את תנאי ה-pH המובילים להפעלתם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאפיין את המלווים, כמו HdeB in vitro ו- in vivo, מה שעוזר לך לפענח את מנגנון הפעלתו. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלווים אחרים המגנים על חומצה, כגון HDA, וניתן לשנות אותן עוד יותר כדי לעבוד עם מלווים אחרים, ו/או מצבי לחץ.

מנוטרת ההשפעה של HdeB מטוהר על הצטברות של חזיר מיטוכונדריאלי מלאט דהידרוגנאז בערכי pH שונים. MDH דיאליזה בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה כנגד ארבעה ליטרים של בופר C. לאחר מכן רכז את החלבון לכ-100 מיקרומולר באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות עם חתך משקל מולקולרי של 30 קילודלטון. כדי להסיר אגרגטים, צנטריפוגה את החלבון למשך 20 דקות ב 20, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.

קבע את ריכוז ה-MDH על ידי ספיגה ב-280 ננו-מולר. לאחר מכן הכינו 50 מיקרו ליטר של MDH והקפיאו את הבקבוקים לאחסון. הנח קובטה קוורץ של מיליליטר אחד לתוך ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי המצויד במחזיקי דגימות מבוקרי טמפרטורה ובוחשים.

הגדר את אורך גל העירור והכניסה ל-350 ננומטר. הוסף לקובטה את הנפחים המתאימים של מאגר D שחומם מראש בערכי ה-pH הרצויים. הנפח הכולל הוא 1,000 מיקרוליטר.

הגדר את הטמפרטורה במחזיק הקובט ל-43 מעלות צלזיוס. הוסף 12.5 מיקרו-מולרי HdeB למאגר, ואחריו תוספת של 0.5 מיקרו-מולרי MDH. התחל לנטר את פיזור האור.

דגרו על התגובה למשך 360 שניות כדי לאפשר התפתחות מספקת של MDH. העלו את ה-pH לשבע על ידי הוספת נפח של 0.16 עד 0.34 של שני דיפוטסיום פוספט מולארי לא חוצץ, והמשיכו להקליט פיזור אור למשך 440 שניות נוספות. נתח את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הפוך את הפלסמיד המבטא HdeB או את בקרת וקטור MD, PBAD 18, לזן BB7224 Delta RPOH באמצעות תאים מוכשרים כימית. זן זה רגיש לטמפרטורה ויש לגדל אותו ב-30 מעלות צלזיוס. לאחר 45 שניות של הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס ולפני הציפוי, יש לדגור על התאים ב-30 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד.

בצע רצף של מושבה בודדת של שיבוטים חיוביים, ודגירה במהלך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס. הכינו תרבית לילה ב -50 מיליליטר LB עם אמפיצילין, וטפחו את התאים ב -200 סל"ד ו -30 מעלות צלזיוס. מדללים מעל תרביות לילה פי 40 ל -25 מיליליטר LB עם אמפיצילין.

גדל את החיידקים בנוכחות 0.5% ארבינוז ב-30 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר, או OD 600 השווה ל-1.0, כדי לגרום לביטוי חלבון HDEB. עבור ניסויי שינוי ה-pH, השתמש ב-LB עם אמפיצילין וארבינוז כדי לדלל את התאים ל-OD 600 של 0.5. התאם לערכי ה-pH המתאימים על ידי הוספת נפחים מתאימים של חמש חומצה הידרוכלורית מולארית.

לאחר נקודות הזמן שצוינו, יש לנטרל את התרבויות על ידי הוספת הנפחים המתאימים של חמש נתרן הידרוקסיד מולארי. עקוב אחר צמיחת התרביות המנוטרלות והתרבות הנוזלית למשך 12 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באמצעות מדידות OD. כדי לחקור את ה-pH האופטימלי של פעילות המלווה של HdeB במבחנה, MDH מקומי דולל למאגר מחומם מראש של ה-pH המצוין בנוכחות, או בהיעדר, או HdeB.

לאחר 360 שניות של דגירה, הצטברות של MDH ב-43 מעלות צלזיוס הופעלה באמצעות נטרול. בנוכחות HdeB, אות פיזור האור יורד משמעותית עם נטרול מ-pH 4, מה שמצביע על כך ש-HdeB מונע צבירה של MDH. מדידות צבירה רגישות מאוד לשינויים בטמפרטורה או בתכולת החיץ.

כדי למנוע תוצאות חיוביות כוזבות, נבדקה ההשפעה של מאגר אחסון מלווה על צבירת לקוחות. למאגר האחסון HdeB לא הייתה השפעה על צבירת MDH. כדי לחקור את ההשפעות של HdeB in vivo, נערכו מבחני הישרדות תלויי pH באמצעות זן מחיקת RPOH רגיש לטמפרטורה.

זן זה חסר את רוב המלווים, ולכן הוא רגיש יותר לטמפרטורה גבוהה, pH נמוך או מתח מחומצן. ביטוי יתר של HdeB בתנאי pH ניטרליים לא הראה השפעה על קצב הגידול של הזן, שגדל היטב בהשוואה לזן הבקרה המכיל את הווקטור הריק, PBAD 18. לעומת זאת, נמצאו הבדלים ברורים ביכולתם לחדש את הצמיחה לאחר טיפולי pH 3 או pH 4, כאשר זן הביטוי היתר של HdeB הראה התאוששות משופרת מטיפול ב-pH נמוך בהשוואה לזן הביקורת.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את הטיהור תוך שלושה ימים, את מבחן הפיזור במבחנה ביום אחד, ואת מבחני ההישרדות in vivo תוך יומיים אם הוא מבוצע כראוי. כשאתה מבצע את הניסויים האלה, וודא שאתה שוקל את תכנון הניסוי שלך בקפידה, הן ביחס לסוג חלבוני הלקוח, הריכוזים שלהם ותנאי החיץ שבהם אתה משתמש. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא עוזרת להשיג הבנה מפורטת יותר על מנגנון הפעלת המלווה והשפעותיו בהקשר in vivo.

ואל תשכח שלימוד ה-pH האופטימלי של מלווה מגן חומצה יכול להיות מאתגר למדי. הסיבה לכך היא שהתנהגות הצבירה של חלבון הלקוח שבו אתה משתמש ככל הנראה תשתנה גם עם ה-pH. לכן, הקפידו לבחור מערכות חיץ המתאימות הן למלווה והן לחלבון הלקוח.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחני ספין למטה על ידי דף SCS, בדיכוי מתווך מלווה אוטומטי של צבירת לקוח.