תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

המטרה הכללית של שיטה זו היא כימות מהיר ובמחיר נגיש של מספר סמנים ביולוגיים בנוזל חוט השדרה, או CSF, כדי להעריך את שימושם לאבחנה ולניטור הטיפול. זוהי בדיקה חדשה המאפשרת לנו למדוד סמנים ביולוגיים שלא ניתן היה למדוד בעבר. אנו סבורים שניתן להשתמש בה למטרות אבחוניות, וכן כדי להבדיל בין מחלות נוירודגנרטיביות שונות, וייתכן שגם כדי לספק מידע פרוגנוסטי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא תוכננה להיות מהירה, פשוטה בהכנת הדגימות, בעלת סגפיות גבוהה וכלכלית עבור יישום במעבדה קלינית. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות אל עבר טיפול או אבחנה, שכן בדיקה זו בעלת התפוקה הגבוהה יכולה לשמש בניסויים קליניים עתידיים עבור טיפולים חדשניים בניוון עצבי. ניתן ליישם מתודולוגיה זו גם במחלות ורקמות אחרות, כגון שתן להפרעות בכליות, פלזמה לקארדיומיופתיה ותאים לבדיקת פלוריפוטנציה.

כדי להתחיל בפרוצדורה זו, השביה את הפפטידים הסינתטיים הרצויים לריכוז מלאי של one-milligram-per-milliliter, בהתאם להוראות היצרן. הכן דילול של 1:10 של הפפטיד מריכוז המלאי, ואיגד 1,000 picomoles מכל פפטיד לתוך מבחנת מיקרוצנטריפוגה בעלת קישור נמוך (low-binding). ייבש את דגימת הפפטיד המאוחדת בריכוז SpeedVac.

עם סיום הפעולה, יש לשמור את הדגימה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש להעביר מנות (aliquots) של 100 µL של CSF למבחנות מיקרו-צנטריפוגה בעלות קישור נמוך (low-binding). יש לבצע לייובש בהקפאה (freeze-dry) של דגימות ה-CSF.

שחזר תמיסה של מנת דגימת פפטיד מאוחדת בבופר עיכול כדי להגיע לריכוזים של 10 ו-1 פיקומול למיקרוליטר. כעת, הוסף את דגימת הפפטיד המאוחדת למנות של 100 מיקרוליטר של CSF המקומעות בייבוש בהקפאה, בריכוזים של 0, 1, 2, 5, 10 ו-15 פיקומולר. לאחר מכן, הוסף 20 ננוגרמים של חלבון שלם שאינו קשור שישמש כסטנדרט פנימי ובקרת יעילות העיכול של טריפסין.

הוסיפו באפר עיכול למנות של ה-CSF עד לנפח סופי של 20 microliters, וערבבו את הדגימות ב-vortex. לאחר מכן, בצעו עיכול של הדגימות לפי הפרוטוקול הסטנדרטי על ידי הוספה של 1.5 microliters של dithiothreitol, ונערערו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו שלוש microliters של iodoacetamide לדגימות ונערערו בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות בחשכה.

לאחר מכן, הוסיפו 165 µL של מים מזוקקים פעמיים. הוסיפו לדגימות 10 µL של תמיסת trypsin מ модиפיקציה בדרגת sequencing, בריכוז של 0.1 µg/µL, שהומסה מחדש בבופר ammonium bicarbonate בריכוז 50 mM. דגרו את הדגימות במבחנה עם מים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה.

לאחר מכן, הפסיקו את העיכול על ידי הקפאת הדגימות. לאחר הפשרת תוצרי העיכול של ה-CSF על קרח, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 16,000 ×g למשך 10 דקות. בסיום, העבירו 60 µL מכל תוצר עיכול למבחנת זכוכית עם אינסרט בנפח 300 µL.

באמצעות מערכת LC-MS, המצוידת בעמודת C18 UPLC, הזרק את הריכוז הגבוה ביותר מנקודת עקומת הסטנדרט תוך שימוש במדרג ליניארי של 10 דקות, מ-1% עד 40% acetonitrile. עם השלמת הריצה, פתח את הכרומטוגרמה שהתקבלה בתוכנה, ורשום את זמן השרידות (retention time) ואת שתי המעברים (transitions) בעזמה הגבוהה ביותר עבור כל פפטיד. על בסיס מידע זה, עדכן שיטת multiple reaction monitoring (או MRM) שנוצרה בעבר, עם ערוצים מתוזמנים למדידת הפפטידים.

כדי לשמור על הרגישות, יש להבטיח שבכל ערוץ יהיו יותר משמונה נקודות לכל פיק (points per peak) וזמן שהייה (dwell time) הגבוה מ-0.01 שניות עבור מעבר אחד לפחות לכל פפטיד. יש לכלול השהיות ממס (solvent delays) בשיטת ה-MRM על ידי בחירת השהיות ממס באירועי השיטה (method events) בקובץ שיטת ה-MS. קריטי להבטיח התאמה נכונה של הפיק המתאים בשיטת HPLC קצרה.

ניתן לבצע זאת באמצעות הפפטידים שהוסיפו (spiked) למטריצה המשמשים לעקומת סטנדרט, ובדיקת המעברים המרובים במהלך פיתוח השיטה. לבסוף, בצעו סקירה ידנית של השיוך (annotation) של הנתונים כדי להבטיח דיוק. נתחו כל פפטיד ויחס ביחס לסטנדרט פנימי מתאים המסומן באיזוטופ יציב.

כאן מוצגת כרומטוגרמה של סממני הפפטידים המשמעותיים מאסיי CSF בעבודת סריקה רחבה (high-throughput). הנתונים מספקים יחסי סטנדרטיזציה ביחס לסטנדרט פנימי רלוונטי המסומן באיזוטופ יציב, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע ריכוזים מוחלטים ב-CSF ולנתחם סטטיסטית לצורך זיהוי שינויים בדגימות קליניות. כימות של 74 הפפטידים שנכללו באסיי CSF זה גילה כי 25 מהם השתנו באופן משמעותי ב-CSF של חולי דמנציה, וכאן מוצגות תוצאות עבור סממני הדמנציה pro-orexin ו-YKL chitinase-3-like protein.

ApoE4 הוא גורם סיכון ידוע למחלת אלצהיימר, וזיהוי של איזופורמים של ApoE מבוסס על זיהוי הפפטידים התואמים לשינויים בחומצות האמינו עבור האיזופורמים E2 ו-E4. תבנית הפסגות הצפויה עבור כל שילוב של איזופורמים מוצגת כאן. ברגע ששיטת העבודה מוגדרת, ניתן לבצע את הבדיקה ביום אחד אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוח שיטה זו, ניתן היה למדוד קבוצה חדשה של ביומארקרים עם רגישות וסגוליות אנליטיות גבוהות, דבר שיאפשר לחוקרים להעריך מחלות ניורודגנרטיביות בדרך חדשה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לתכנן ולבצע אופטימיזציה של בדיקת MRM לרגישות וספציפיות. זכרו כי עבודה עם DTE, טרמיטים, חומצה פורמית ורקמה אנושית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות, במהלך הליך זה.