תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לכמת במהירות ובמחיר סביר סמנים ביולוגיים מרובים בנוזל השדרה, או CSF, כדי להעריך את השימוש בהם לקראת אבחון וניטור טיפול. זוהי בדיקה חדשה שמאפשרת לנו למדוד סמנים ביולוגיים שלא ניתן היה למדוד בעבר. ואנחנו חושבים שזה יכול לשמש למטרות אבחון וגם כדי להבדיל בין מחלות ניווניות שונות ואולי גם לתת מידע פרוגנוסטי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מתוכננת להיות מהירה, פשוטה בהכנת דגימות, ספציפית מאוד וחסכונית לתרגום למעבדה הקלינית. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון, שכן ניתן להשתמש במבחן תפוקה גבוה זה בניסויים קליניים עתידיים לטיפולים חדשים בניוון עצבי. ניתן ליישם מתודולוגיה זו גם על מחלות ורקמות אחרות, כגון שתן להפרעות בכליות, פלזמה לקרדיומיופתיה ותאים לפלוריפוטנטיות.

כדי להתחיל בהליך זה, השעו מחדש את הפפטידים הסינתטיים הרצויים לריכוז מלאי של מיליגרם אחד למיליליטר, בהתאם להוראות היצרן. הכן דילול של אחד מכל 10 של הפפטיד מריכוז המלאי, ואגד 1,000 פיקומולים מכל פפטיד לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בעל קשירה נמוכה. יבש את דגימת הפפטיד המאוחסנת ברכז SpeedVac.

בסיום, אחסן את הדגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש להוציא 100 מיקרוליטר של CSF לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בעלי קשירה נמוכה. יש לייבש בהקפאה את דגימות ה-CSF.

השעו מחדש מנה של דגימת הפפטיד המאוגדת במאגר העיכול כדי לקבל ריכוזים של 10 ופיקומול אחד למיקרוליטר. כעת, הכניסו את דגימת הפפטיד המאוגדת לתוך 100 מיקרוליטר מיובשים בהקפאה של CSF, בריכוזי אפס, אחד, שניים, חמישה, 10 ו-15 פיקומולרים. לאחר מכן, הוסף 20 ננוגרם של חלבון שלם שאינו קשור כדי לשמש כתקן פנימי ולשלוט ביעילות העיכול של טריפסין.

הוסף את מאגר העיכול ל-CSF aliquots לנפח סופי של 20 מיקרוליטר, ומערבל את הדגימות. לאחר מכן, עכל את הדגימות לפי פרוטוקול סטנדרטי על ידי הוספת 1.5 מיקרוליטר של דיתיותרייטול, וניעור בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, הוסיפו לדגימות שלושה מיקרוליטרים של יודואצטמיד ונערו בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות בחושך.

לאחר מכן, הוסיפו 165 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים. הוסף לדגימות 10 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין שונה של 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר, בדרגת ריצוף, מושעה מחדש במאגר אמוניום ביקרבונט של 50 מילי-מולרי. דגרו את הדגימות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר מכן, עצור את העיכול על ידי הקפאת הדגימות. לאחר הפשרת מעכלי ה- CSF על קרח, צנטריפוגה ב -16, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות. בסיום, העבירו 60 מיקרוליטר מכל תקציר לתוך תוספת זכוכית של 300 מיקרוליטר.

באמצעות מערכת LC-MS, המצוידת בעמודת C18 UPLC, הזרקת הריכוז הגבוה ביותר מנקודת העקומה הסטנדרטית באמצעות שיפוע ליניארי של 10 דקות, 1 עד 40% אצטוניטריל. לאחר השלמת הריצה, פתח את הכרומטוגרמה המתקבלת בתוכנה, ושים לב לזמן השמירה ולשני המעברים האינטנסיביים ביותר לכל פפטיד. בהתבסס על מידע זה, עדכן ניטור תגובות מרובות שנוצר בעבר, או שיטת MRM עם ערוצים מתוזמנים למדידת פפטידים.

כדי לשמור על רגישות, שמור על כל ערוץ עם נקודות לשיא הגדולות משמונה וזמן השהייה גדול מ-0.01 שניות למעבר אחד לפחות עבור כל פפטיד. כלול עיכובים ממס בשיטת MRM על ידי בחירת עיכובים ממס באירועי שיטה בקובץ שיטת MS. זה קריטי להתאים נכון את השיא הנכון בשיטת HPLC קצרה.

ניתן לעשות זאת באמצעות הפפטידים הדוקרניים במטריצה המשמשים לעקומה סטנדרטית והתבוננות במעברים המרובים במהלך פיתוח השיטה. לבסוף, סקור ידנית את ביאור הנתונים כדי להבטיח דיוק. נתח כל פפטיד ויחס לתקן פנימי יציב מתאים עם תווית איזוטופ.

כרומטוגרמה של סמני הפפטיד המשמעותיים מבדיקת CSF בתפוקה גבוהה מוצגת כאן. הנתונים נותנים יחסים סטנדרטיים לתקן הפנימי היציב הרלוונטי המסומן באיזוטופים, שניתן להשתמש בו כדי לקבוע ריכוזי CSF מוחלטים ולנתח סטטיסטית לשינויים בדגימות קליניות. כימות של 74 הפפטידים הכלולים בבדיקת CSF זו העלה כי 25 השתנו באופן משמעותי ב-CSF של חולי דמנציה, ותוצאות מסמני דמנציה פרו-אורקסין וחלבון דמוי כיטינאז-3 YKL מוצגות כאן.

ApoE4 הוא גורם סיכון ידוע למחלת אלצהיימר, וזיהוי איזופורמים של ApoE מבוסס על זיהוי הפפטידים המתאימים לשינויים בחומצות האמינו עבור איזופורמים E2 ו-E4. תבנית השיא הצפויה עבור כל שילוב איזופורמים מוצגת כאן. לאחר הגדרת השיטה, ניתן לבצע את הבדיקה תוך יום אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוח שיטה זו, ניתן היה למדוד קבוצה חדשה של סמנים ביולוגיים בעלי רגישות וסגוליות אנליטית גבוהה, וזה יאפשר לחוקרים להעריך מחלות ניווניות באופן חדש.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לתכנן ולבצע אופטימיזציה של בדיקת MRM עבור רגישות וספציפיות. אל תשכח שעבודה עם DTE, טרמיטים, חומצה פורמית ורקמות אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש ליישם אמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, במהלך הליך זה.